細(xì)菌生物膜參與炎癥性腸病發(fā)病的研究進(jìn)展*

史少培 汪芳裕

南京醫(yī)科大學(xué)金陵臨床醫(yī)學(xué)院消化內(nèi)科(210002)

隨著工業(yè)化的發(fā)展與飲食逐漸西方化，我國(guó)炎癥性腸病(IBD)的發(fā)病率逐年升高。目前IBD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，遺傳基因、腸道屏障受損、菌群失調(diào)等多種因素參與其發(fā)病過(guò)程。有研究結(jié)果顯示，誘發(fā)IBD的病原體并非某種單一的致病菌，而是由多種病原微生物構(gòu)成的腸道細(xì)菌群落，這種微生物的聚集體稱(chēng)為細(xì)菌生物膜。IBD患者腸道屏障受損，細(xì)菌易穿透黏液層直接與腸上皮接觸并定植形成生物膜，造成腸道炎癥[1]。本文就細(xì)菌生物膜的一般特征與檢測(cè)方法及其IBD中的作用作一綜述。

一、細(xì)菌生物膜概述

1. 一般特征：腸道中細(xì)菌以浮游或生物膜兩種方式生長(zhǎng)。細(xì)菌附著于生物或非生物表面，產(chǎn)生胞外聚合物(extra-cellular polymeric substance, EPS)包裹菌落形成生物膜。生物膜成熟后會(huì)播散部分細(xì)菌至其他地方，形成新的生物膜，造成感染范圍的擴(kuò)大。有研究指出，脂肪酸、氧氣、一氧化氮、鐵、蛋白酶等均可有效誘導(dǎo)生物膜播散，然而生物膜在腸道中的具體播散機(jī)制有待進(jìn)一步研究[2]。

生物膜形成后，不同菌群可在基質(zhì)內(nèi)互相影響，彼此進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)交換和信息交流。同時(shí)，基質(zhì)相當(dāng)于為細(xì)菌提供了一層保護(hù)屏障，生物膜內(nèi)部的細(xì)菌對(duì)外界壓力有顯著的抵抗力，造成頑固性感染。近年研究證明，生物膜與許多腸道疾病如IBD、結(jié)腸癌、家族性腺瘤性息肉病等相關(guān)[3]。

2. 形成步驟：生物膜的形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，主要包括5個(gè)步驟：①形成生物膜的表面吸附細(xì)菌賴(lài)以附著的有機(jī)或無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，形成調(diào)節(jié)膜，調(diào)節(jié)膜是覆蓋在表面由體液形成的2～10 nm厚的蛋白吸附層，其表面蛋白、糖蛋白可作為特異性受體選擇性與細(xì)菌黏附。②細(xì)菌可逆性附著。③細(xì)菌產(chǎn)生的EPS與黏附表面牢固結(jié)合，發(fā)展為不可逆性黏附。④細(xì)菌繁殖，黏附細(xì)菌分裂增殖形成的微小菌落是生物膜的基本組成單位。⑤成熟的生物膜可播散細(xì)菌至其他地方形成新的生物膜[4]。

3. 主要成分：在大多數(shù)細(xì)菌生物膜中，微生物占生物膜的10%以下，而EPS占90%以上。EPS與許多功能相關(guān)，包括黏附與聚集、保持生物膜水分和酶的活性、充當(dāng)保護(hù)屏障、吸附有機(jī)物和無(wú)機(jī)離子、作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)源、基因信息的交流等[5]。

IBD腸道微生態(tài)失調(diào)主要表現(xiàn)為細(xì)菌多樣性減少以及腸桿菌科細(xì)菌的增多，包括黏附性大腸埃希菌和侵襲性大腸埃希菌(AIEC)[6]。腸桿菌科細(xì)菌生物膜基質(zhì)中主要包含卷曲纖維、纖維素、1型菌毛、鞭毛蛋白、胞外DNA等，其中卷曲纖維占85%以上，是基質(zhì)的重要組成部分。

二、生物膜的檢測(cè)方法

掃描電鏡和熒光原位雜交技術(shù)(fluorescenceinsituhybridization， FISH)是目前檢測(cè)生物膜的金標(biāo)準(zhǔn)。FISH利用熒光標(biāo)記的特異性DNA探針與樣本DNA雜交之后染色成像，在量化細(xì)菌數(shù)量的同時(shí)可視化觀察生物膜的立體結(jié)構(gòu)，可定性、定量和相對(duì)定位分析DNA。

激光掃描共聚焦顯微鏡(CLSM)結(jié)合熒光染料是原位觀察黏膜中生物膜的重要工具[7]。與普通熒光顯微鏡相比，CLSM可對(duì)細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行斷層掃描，具有更高的空間分辨率和圖像對(duì)比度，可形成清晰的三維圖像。一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CLSM下可見(jiàn)生物膜具有多種多樣化的結(jié)構(gòu)，內(nèi)部含有許多通道供細(xì)菌間進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)交換和信息交流[8]。

三、生物膜與IBD的相關(guān)性

人體整個(gè)胃腸道均可形成生物膜，黏液豐富的區(qū)域微生物密度最高。腸道細(xì)菌利用凝膠狀黏液作為基質(zhì)發(fā)展成生物膜結(jié)構(gòu)，同時(shí)黏液層也可作為附著于體內(nèi)的媒介[9]。腸上皮細(xì)胞分泌黏蛋白，構(gòu)成黏液屏障，避免了微生物與腸上皮細(xì)胞的直接接觸。正常遠(yuǎn)端結(jié)腸內(nèi)層黏液層致密且無(wú)菌，緊密黏附于上皮細(xì)胞；而外層的疏松黏液層包含大量細(xì)菌，但多是無(wú)害的共生菌群，不具侵入性[10]。共生菌形成的生物膜可增強(qiáng)與宿主的相互作用，有利于腸道穩(wěn)態(tài)[11]。

在IBD的發(fā)生、發(fā)展中，特異性黏膜生物膜通過(guò)多種途徑引起宿主腸道炎癥反應(yīng)。致病菌可穿透黏液層，直接與腸上皮細(xì)胞接觸，與宿主的免疫和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)相互作用，發(fā)展成慢性黏膜炎癥[1,12]。與健康個(gè)體相比，IBD患者活檢標(biāo)本中黏膜附著的生物膜檢出率明顯增高，且體外培養(yǎng)可形成更大的生物膜。Swidsinski等[13]的研究證實(shí)IBD患者腸道黏膜菌群的組成和空間結(jié)構(gòu)均發(fā)生了改變。其中脆弱擬桿菌占80%以上，為IBD的特征菌群。

1. 細(xì)菌生物膜的直接促炎作用：腸道是人體微生物定植量最高的器官，其中含有豐富的革蘭陰性桿菌，如腸桿菌屬和沙門(mén)菌屬等。在腸桿菌科的生物膜中，主要成分包括卷曲纖維、纖維素、1型菌毛、胞外DNA等。這些基質(zhì)中的成分可與腸黏膜免疫系統(tǒng)相互作用，誘導(dǎo)IBD的發(fā)生。巨噬細(xì)胞是腸道固有免疫的重要組成部分，通過(guò)模式識(shí)別受體識(shí)別致病菌合成的保守分子模式，包括細(xì)菌胞外結(jié)構(gòu)(如菌毛、鞭毛、脂多糖和肽聚糖)、卷曲纖維、1型菌毛等，可消滅潛在的致病菌。此外，微生物產(chǎn)物的模式識(shí)別受體參與激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)吞噬作用和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[14]。

①卷曲纖維：卷曲纖維是由腸桿菌科的共生菌和致病菌分泌至生物膜胞外基質(zhì)中的一種淀粉樣蛋白，可抵抗蛋白酶的消化作用，增強(qiáng)生物膜抵抗外界惡劣環(huán)境的能力。大腸埃希菌分泌卷曲纖維主要由操縱子基因csg(curli subunit genes)編碼和轉(zhuǎn)錄，而卷曲纖維的主要成分通過(guò)細(xì)菌分泌的csgA蛋白亞基自組裝而成。Bian等[15]的研究使用不同大腸埃希菌菌株感染人體巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)表達(dá)csgA蛋白的菌株誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子水平均高于不表達(dá)csgA蛋白的菌株，證實(shí)csgA蛋白可刺激炎癥因子的分泌。此外，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)大腸埃希菌在卷曲纖維表達(dá)缺失時(shí)并不能發(fā)育為成熟的生物膜，可見(jiàn)卷曲纖維與生物膜的成熟和播散相關(guān)[16]。

大量研究認(rèn)為淀粉樣蛋白可促進(jìn)神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展，并且作為損傷相關(guān)的分子模式(DAMPs)與小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的Toll樣受體(TLRs)相互作用[17]，而細(xì)菌分泌的淀粉樣蛋白有可能調(diào)節(jié)宿主與微生物的相互作用。卷曲纖維作為T(mén)LRs異源二聚體TLR1/2的配體可刺激多種細(xì)胞類(lèi)型的免疫反應(yīng)[5,18]。NOD樣受體(NLRP3)可激活NLRP3炎癥小體，誘導(dǎo)caspase-1的激活和白細(xì)胞介素1β(IL-1β)的成熟[19]。Th17細(xì)胞是組織炎癥的有效誘導(dǎo)劑，與許多實(shí)驗(yàn)性自身免疫病的發(fā)病相關(guān)。分泌卷曲纖維的沙門(mén)菌以TLR2依賴(lài)的方式增強(qiáng)了Th17的免疫反應(yīng)，TLR2的激活進(jìn)一步誘導(dǎo)了IL-17A和IL-22相關(guān)的炎性反應(yīng)[20]。此外，卷曲纖維可結(jié)合補(bǔ)體C1q，保護(hù)大腸埃希菌免受補(bǔ)體介導(dǎo)的吞噬作用，說(shuō)明卷曲纖維有助于細(xì)菌的免疫逃逸，從而提高細(xì)菌的毒性[21]。值得注意的是，共生菌和致病菌表達(dá)的卷曲纖維是同源的，卷曲纖維并不作為單獨(dú)的毒力因子而起作用。Oppong等[22]研究發(fā)現(xiàn)，口服卷曲纖維可改善TNBS誘導(dǎo)的小鼠腸炎，且與抗TNF-α治療組結(jié)果無(wú)明顯差異。上皮細(xì)胞可對(duì)卷曲纖維產(chǎn)生反應(yīng)，導(dǎo)致屏障功能的加強(qiáng)以及移位細(xì)菌的減少。目前關(guān)于腸道對(duì)卷曲纖維免疫反應(yīng)的研究結(jié)果差異較大，需未來(lái)進(jìn)一步研究明確具體機(jī)制。

②纖維素：細(xì)菌合成纖維素與其產(chǎn)生卷曲纖維相關(guān)。研究證實(shí)纖維素的合成是生物膜形成的主要原因，且纖維素可增強(qiáng)AIEC的促炎能力[14,23]。Monteiro等[24]的研究表明，當(dāng)大腸埃希菌Nissle 1917缺乏纖維素時(shí)并不能黏附于上皮細(xì)胞，說(shuō)明纖維素是其形成生物膜所必需的，但該研究使用的是特定的菌株，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一定適用于其他菌株。Ellermann等[14]的研究進(jìn)一步指出，細(xì)菌性纖維素可加劇AIEC誘導(dǎo)的IL-10-/-小鼠腸炎，并誘導(dǎo)Th17黏膜免疫反應(yīng)，但確切的作用機(jī)制并不清楚，只能說(shuō)明纖維素以一種間接機(jī)制調(diào)節(jié)宿主黏膜免疫反應(yīng)，具體調(diào)控機(jī)制有待未來(lái)進(jìn)一步闡明。腸道細(xì)菌性纖維素與膳食來(lái)源的纖維素難以區(qū)分，因此導(dǎo)致目前腸道細(xì)菌性纖維素的研究并不廣泛。

③ 1型菌毛：腸桿菌科的1型菌毛可介導(dǎo)細(xì)菌附著，有助于生物膜的形成[25-26]。1型菌毛由FimA亞基組成，菌毛末端的FimH黏附素可與宿主細(xì)胞直接相互作用。此外，F(xiàn)imH通過(guò)TLR4激活先天免疫系統(tǒng)，促進(jìn)炎癥因子表達(dá)和中性粒細(xì)胞遷移[27]。腸上皮細(xì)胞頂端表達(dá)的癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子6(CEACAM6)即為一種1型菌毛受體[28]，Denizot等[29]的研究發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，感染AIEC的CEABAC10小鼠出現(xiàn)腸道屏障功能障礙，表現(xiàn)為更嚴(yán)重的結(jié)腸炎。而阻斷CEACAM6表達(dá)或感染AIEC的突變菌株(FimH缺陷)后，炎癥減輕。由此可見(jiàn)，CEACAM6高表達(dá)促進(jìn)了AIEC以FimH依賴(lài)的方式進(jìn)行定植，從而進(jìn)一步介導(dǎo)炎癥的發(fā)生。

2. 細(xì)菌生物膜的間接促炎作用：腸黏膜細(xì)菌除直接促炎作用，還可通過(guò)產(chǎn)生基因毒素參與炎癥的發(fā)生，其中以脆弱擬桿菌腸毒素(Bacteroidesfragilisenterotoxin, BFT)與IBD和結(jié)直腸癌的相關(guān)性較為清楚。當(dāng)產(chǎn)腸毒素脆弱擬桿菌(ETBF)定植于腸黏膜時(shí)，可通過(guò)激活STAT3和Th17免疫應(yīng)答多種途徑促進(jìn)結(jié)腸炎的發(fā)展[30-32]。此外，BFT可刺激T84等結(jié)腸細(xì)胞株中精胺氧化酶(spermine oxidase, SMO)表達(dá)持續(xù)增高，造成細(xì)胞內(nèi)活性氧含量升高和NLRP3炎癥小體的激活，這一過(guò)程與IBD的發(fā)生密切相關(guān)[33]。

BFT還可增加腸上皮細(xì)胞的通透性，使致病菌與腸上皮細(xì)胞直接接觸而誘發(fā)炎癥，而反復(fù)炎癥是IBD相關(guān)結(jié)直腸癌發(fā)生的基礎(chǔ)。有研究[34]發(fā)現(xiàn)，在生物膜覆蓋的腸黏膜中E-cadherin表達(dá)下調(diào)，腸上皮通透性增加，腸腔內(nèi)抗原、內(nèi)毒素等進(jìn)入固有層誘發(fā)炎癥反應(yīng)，而低水平E-cadherin會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致下游炎癥性疾病和腫瘤相關(guān)通路的激活。由此可見(jiàn)，黏膜細(xì)菌可通過(guò)改變上皮細(xì)胞的通透性參與IBD相關(guān)結(jié)直腸癌的發(fā)生。

四、抗生物膜治療

生物膜是腸道細(xì)菌一種自然的生活方式，其本身并不一定是疾病的標(biāo)志。對(duì)于生物膜的研究應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注其在疾病中的行為特征，如遠(yuǎn)端結(jié)腸的生物膜雖然不能代表疾病的發(fā)生，但當(dāng)黏附于上皮細(xì)胞的生物膜增多時(shí)應(yīng)引起關(guān)注。在某些特定條件下，生物膜不需要被破壞，而部分黏附于上皮細(xì)胞的生物膜則需要被根除。越來(lái)越多的證據(jù)表明，細(xì)菌生物膜可改變腸上皮通透性，誘發(fā)持續(xù)的炎癥反應(yīng)。因此推測(cè)在腸道菌群誘發(fā)IBD的過(guò)程中，生物膜的形成與疾病的發(fā)生、發(fā)展息息相關(guān)。防止生物膜的過(guò)度生長(zhǎng)以及破壞已建立的生物膜至關(guān)重要，抗生物膜治療可能是未來(lái)治療IBD的一個(gè)新方向。目前抗生物膜策略主要包括阻止細(xì)菌黏附、防止生物膜的形成、直接殺滅細(xì)菌、破壞EPS的結(jié)構(gòu)和功能等。

1. 細(xì)菌生物膜的常規(guī)治療：抗菌藥物是目前細(xì)菌感染的首選治療方法，但并不能完全根除生物膜。這是由于包裹在基質(zhì)中的細(xì)菌大部分處于“休眠”狀態(tài)，整體代謝水平下降，同時(shí)EPS中高金屬離子濃度和低pH值使抗菌藥物失活，導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感性下降。低劑量抗菌藥物會(huì)激活生物膜內(nèi)的細(xì)菌，促使其向外界播散，而大量證據(jù)又表明過(guò)多使用抗菌藥物會(huì)導(dǎo)致一系列不良反應(yīng)，如宿主菌群失調(diào)、機(jī)會(huì)致病菌感染風(fēng)險(xiǎn)增加、細(xì)菌耐藥等。值得一提的是，生物膜細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性較浮游細(xì)胞高出1 000倍。除受上述生物膜特性影響外，生物膜耐藥性與其膜內(nèi)細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)，生物膜中無(wú)數(shù)細(xì)胞通過(guò)群體感應(yīng)彼此以建立通信來(lái)共享信息細(xì)菌，促進(jìn)病原菌對(duì)抗菌藥物耐藥性的增加。因此，群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制劑被認(rèn)為是抗生物膜治療的新策略，可有效減少細(xì)菌毒力，提高抗菌療效。然而，目前群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控生物膜的具體機(jī)制尚不明確，且許多抑制劑具有細(xì)胞毒性，其安全性有待未來(lái)進(jìn)一步研究[35]。

2. 腸道生物膜的治療：EPS構(gòu)成了細(xì)菌的直接生活環(huán)境，致密結(jié)構(gòu)使抗菌藥物難以滲透至菌膜內(nèi)部的細(xì)菌，大大降低了抗菌藥物的殺菌作用。因此，靶向EPS將成為瓦解細(xì)菌生物膜的有效方法[36]。

①促進(jìn)EPS解離：基質(zhì)中含有金屬陽(yáng)離子(如鈣、鐵、鎂)等，參與維持基質(zhì)的穩(wěn)定性，構(gòu)成了生物膜緊密連接的三維結(jié)構(gòu)支架。金屬離子的螯合劑除干擾細(xì)菌生物膜的穩(wěn)定性外，還可破壞已形成的生物膜。IBD患者腸黏膜細(xì)菌培養(yǎng)形成的生物膜更大、細(xì)胞更多，且胞內(nèi)鐵濃度含量更高，而普遍觀點(diǎn)認(rèn)為膳食補(bǔ)鐵會(huì)導(dǎo)致IBD疾病惡化和感染風(fēng)險(xiǎn)升高，推測(cè)可能是由于改變了共生菌群以及增加了腸桿菌豐度[37-38]。既往觀點(diǎn)認(rèn)為硫化氫是黏膜防御的重要介質(zhì)，可影響?zhàn)つぱ髁?、調(diào)節(jié)碳酸氫鹽和黏液的分泌[39]。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，硫化氫還可減少微生物鐵的攝入量以降低IBD相關(guān)生物膜的毒性，并重建黏液屏障，這一發(fā)現(xiàn)為未來(lái)靶向宿主炎癥與微生物失調(diào)提供了新的思路[40]。

②益生菌競(jìng)爭(zhēng)性抑制：益生菌菌株可在腸黏膜表面形成非致病性生物膜，故可阻斷病原菌的黏附。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究證實(shí)，益生菌可有效誘導(dǎo)IBD患者病情緩解。停止服用益生菌后，糞便中脫落的益生菌菌株急劇減少，推測(cè)是由于結(jié)腸多種細(xì)菌的混合菌膜通常不易滲透新的細(xì)菌，因此益生菌療效取決于具體的菌種組成及其自身性質(zhì)[41]。此外，有證據(jù)表明益生菌會(huì)干擾抗菌藥物治療后自身菌群的重建，因此未來(lái)需制定更個(gè)性化的益生菌治療方案以減少對(duì)宿主菌群穩(wěn)態(tài)的不良效應(yīng)[42]。

③藥物遞送系統(tǒng)：納米遞藥系統(tǒng)近來(lái)受到廣泛關(guān)注，因其具有良好的生物相容性、持續(xù)的穩(wěn)定性、較高的載藥量和包封率，可保證足量的藥物遞送至病變部位[43]。目前實(shí)驗(yàn)或臨床中應(yīng)用的納米遞藥系統(tǒng)主要包括脂質(zhì)體、無(wú)極材料粒子、膠束、聚合物納米粒子等。納米遞藥系統(tǒng)具有減少近端腸道藥物損失、提高局部藥物濃度等特點(diǎn)，在潰瘍性結(jié)腸炎的治療中具有廣闊的前景。Tian等[44]的研究制備了由聚乙二醇-b-聚己內(nèi)酯(PEG-b-PCL)和聚己內(nèi)酯-b-聚四氨酯(PCL-b-PQAE)共組裝的一種雙功能膠束，并修飾兩性離子(含羥基的pH敏感羧基甜菜堿衍生物)。這種新型膠束不僅可靶向生物膜，而且兩性離子基團(tuán)可與胞外DNA、蛋白等相互作用，瓦解生物膜的完整性，提高抗菌效能。目前納米遞藥系統(tǒng)尚未大規(guī)模投入臨床應(yīng)用，隨著后續(xù)研究的深入，相信未來(lái)可發(fā)揮更大的作用。

五、展望

關(guān)于腸道菌群在IBD中的發(fā)病機(jī)制，大部分傳統(tǒng)研究限于菌種的組成和豐度，而未涉及菌群的空間結(jié)構(gòu)。評(píng)估菌群與黏膜的位置關(guān)系有助于了解宿主與微生物群落間的相互作用，并指導(dǎo)未來(lái)IBD聯(lián)合治療的發(fā)展。目前IBD的藥物治療存在一定的局限性，尋找新的治療藥物刻不容緩，抗生物膜治療提供了一種新的選擇。然而生物膜同時(shí)參與腸道穩(wěn)態(tài)的構(gòu)建，未來(lái)需研究出更具特異性的生物膜清除方法。此外，生物膜究竟是疾病的病因還是結(jié)果，是疾病的標(biāo)志還是可以干預(yù)治療的潛在靶點(diǎn)，均需行進(jìn)一步探索。