應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)對HEK293細(xì)胞系TSC1基因穩(wěn)定敲除效果的實(shí)驗(yàn)鑒定

王 晶，高 倩，陳健康，劉家云

（空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床檢驗(yàn)研究所，西安 710032）

TSC1 基因位于染色體9q34，包含23 個外顯子，轉(zhuǎn)錄本mRNA 長8.6kb，是結(jié)節(jié)性硬化癥（tuberous sclerosis, TSC）的主要致病基因。TSC 是一種罕見的常染色體顯性多系統(tǒng)遺傳疾病[1]，可發(fā)病于全身各個組織，可累及腦、皮膚、視網(wǎng)膜、腎臟和心臟，以癲癇、智力缺陷，頭面部血管纖維瘤最為常見，稱為“TSC 三聯(lián)征”[2]。TSC1 基因編碼錯構(gòu)瘤蛋白（hamartin）和TSC2 基因編碼的馬鈴薯球蛋白（tuberin） 共同構(gòu)成復(fù)合體TSC1/TSC2，該復(fù)合體抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）信號通路。當(dāng)TSC1 或TSC2 基因發(fā)生突變，導(dǎo)致TSC1/TSC2 復(fù)合體功能異常，進(jìn)一步降低其對mTOR 信號通路的抑制作用，引起細(xì)胞的異常增殖，從而發(fā)生機(jī)體的病理變化[3]。

成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列/成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列相關(guān)蛋白 (clustered regularly interspaced short palindromic repeat / CRISPRassociated protein，CRISPR/Cas) 系統(tǒng)是細(xì)菌降解入侵的噬菌體或外源性遺傳物質(zhì)形成的獲得性免疫防御機(jī)制[4]。當(dāng)入侵的噬菌體將其DNA 片段整合到細(xì)菌CRISPR 序列中，細(xì)菌利用相應(yīng)的CRISPR RNAs(crRNAs)來指導(dǎo)同源序列的降解，從而提供細(xì)菌的免疫防御功能。張峰團(tuán)隊(duì)據(jù)此開發(fā)出基因編輯工具CRISPR/Cas9 系統(tǒng)[5]，該系統(tǒng)主要由單鏈引導(dǎo)RNA (single guide RNA, sgRNA)，Cas9 核酸酶和前間隔序列鄰近基序(protospacer adjacent motif,PAM)構(gòu)成，即在PAM 序列的引導(dǎo)下，sgRNA 準(zhǔn)確定位到目的片段，并與之互補(bǔ)配對結(jié)合，同時PAM 序列激活Cas9 核酸酶，使之完成對DNA 的剪切[6]，從而實(shí)現(xiàn)基因敲除的功能，該方法以其快速高效、操作便捷的特點(diǎn)現(xiàn)已成為首選的基因編輯工具。因此，我們擬利用CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)在HEK293 細(xì)胞中對TSC1 基因進(jìn)行敲除，從而為研究TSC1 基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源 人胚腎細(xì)胞HEK293 細(xì)胞系（本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)）。

1.2 儀器與試劑 lentiCRISPRv2 空載質(zhì)粒(本實(shí)驗(yàn)室保存)；sgRNA(生工合成)；限制性內(nèi)切酶BsmB Ⅰ，堿性磷酸酶、T4 多聚核苷酸激酶(ThermoFish Scientific）；DNA 膠回收試劑盒、基因組提取試劑盒（生工生物）；DMEM 培養(yǎng)基（Hyclone）；Opti-MEM 減血清培養(yǎng)基、胎牛血清（GIBCO）；兔抗TSC1 抗體、兔抗β-tubulin 抗體（Cell Signaling Technology），HRP 偶聯(lián)山羊抗兔二抗（Jackson Immuno Research）。

1.3 方法

1.3.1 設(shè)計(jì)并合成靶向TSC1 基因的sgRNA：在NCBI 中找到TSC1 的基因序列（Gene ID：7248），根據(jù)TSC1 的基因序列，使用CRISPR 的sgRNA 在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站http：//crispr.mit.edu/，選取分值高(score>95)且脫靶少的序列，網(wǎng)站分析結(jié)果為5’→3’端的正義鏈（20N），以原則：正義鏈序列為5’-GACC-G-20N-3’；反義鏈序列為5’-AAAC-(20N 的互補(bǔ)序列)-C-3’合成兩條部分互補(bǔ)的寡核苷酸鏈見表1。設(shè)計(jì)的sg-TSC1-1 位于6 號外顯子上游，sg-TSC1-2 位于6 號外顯子下游，若該系統(tǒng)正確切割，TSC1 基因的6 號外顯子則被整體刪除。

表1 合成的寡核苷酸序列

1.3.2 構(gòu)建重組質(zhì)粒lentilCRISPRv2-sgTSC1：將合成的針對目的基因TSC1 的寡核苷酸進(jìn)行退火，形成雙鏈sgRNA。用限制性內(nèi)切酶BsmB I 對空載質(zhì)粒lentiCRISPRv2 進(jìn)行酶切，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，對目的片段進(jìn)行切膠回收。將回收的BsmBI 消化后載體和雙鏈sgRNA 進(jìn)行連接，將連接體系轉(zhuǎn)化入Stbl3 感受態(tài)細(xì)胞中，次日挑取單克隆菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，待菌液渾濁后將其送測序。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：將HEK293 細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，當(dāng)細(xì)胞密度約為70%時，更換無血清培養(yǎng)基，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。對照組轉(zhuǎn)染4μg lentilCRISPRv2 空載體，實(shí)驗(yàn)組共轉(zhuǎn)染lentilCRISPRv2-sgTSC1-1 和lentilCRISPRv2-sgTSC1-2 各2μg。

1.3.4 嘌呤霉素加壓篩選：轉(zhuǎn)染后48h 進(jìn)行換液并加入1μg/ml 嘌呤霉素，每2 天進(jìn)行一次換液，7天后將篩選的細(xì)胞消化收集，PBS 清洗三遍，制成單細(xì)胞懸液，重新鋪板于15cm 培養(yǎng)皿中，用于挑取單克隆細(xì)胞。

1.3.5 PCR 鑒定TSC1 基因敲除：培養(yǎng)5～7 天后，挑取單克隆細(xì)胞于48 孔板繼續(xù)培養(yǎng)。設(shè)計(jì)位于TCS1 基因的兩個切割位點(diǎn)的上游和下游各一個確認(rèn)引物TSC1-sg1up-Conf F 和TSC1-sg2down-Conf R(表1)，PCR 產(chǎn)物的片段大小等于兩引物之間的堿基數(shù)（1 218bp）減去兩切割位點(diǎn)間的堿基數(shù)(832bp)之差（386bp）時（圖1），初步判定為sgTSC1 雙切割成功。收集48 孔板每個孔中一半的細(xì)胞，提取基因組進(jìn)行PCR 鑒定，另一半細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。

圖1 PCR 鑒定原理示意圖

1.3.6 Western blot 鑒定TSC1 基因敲除效果：選取PCR 陽性的結(jié)果進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，收取細(xì)胞進(jìn)行Western blot 鑒定。收集待測細(xì)胞進(jìn)行裂解，離心取上清進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。凝膠電泳分離蛋白后，用PVDF 膜進(jìn)行轉(zhuǎn)印，封閉后用緩沖液洗膜后孵育一抗：內(nèi)源抗體anti-TSC1 和內(nèi)參抗體anti-β-tubulin。次日室溫孵育二抗2h 后顯影。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒lentilCRISPRv2-sgTSC1 的構(gòu)建 挑取單克隆菌落lentilCRISPRv2-sgTSC1-1 和lentilCRISPRv2-sgTSC1-2 送生工公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果見圖2，兩條目的sgTSC1序列分別已經(jīng)正確插入載體，證明用于TSC1 基因敲除的兩個重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 插入sgTSC1 的測序結(jié)果

2.2 PCR 鑒定lentilCRISPRv2-sgTSC1 成功轉(zhuǎn)染并對TSC1 基因進(jìn)行有效切割 對48 孔板中的單克隆細(xì)胞進(jìn)行PCR 鑒定，以轉(zhuǎn)染篩選后的混合細(xì)胞所提基因組為陽性對照，空轉(zhuǎn)的細(xì)胞為陰性對照，結(jié)果顯示2F6 和4C8 兩孔細(xì)胞出現(xiàn)386bp 的正確條帶（見圖3）。且條帶單一，無其他大小的雜帶，即初步鑒定TSC1 基因敲除成功。

圖3 瓊脂糖凝膠電泳檢測單克隆細(xì)胞基因敲除的DNA 片段

2.3 Western blot 鑒定HEK293 細(xì)胞TSC1 基因敲除 Western blot 顯影結(jié)果顯示2F6 細(xì)胞的140KD處仍有明顯條帶（見圖4），說明TSC1 沒有敲除，4C8 細(xì)胞的140KD 處無條帶，說明TSC1 基因無表達(dá)，提示成功敲除，即4C8 細(xì)胞為TSC1 敲除的穩(wěn)定細(xì)胞株，命名為HEK293-TSC1-KO，擴(kuò)大培養(yǎng)后及時凍存。

圖4 Western blot 檢測TSC1 的敲除效果

3 討論

TSC 幾乎累及所有器官，其中腎臟病變、癲癇及新生兒心臟橫紋肌瘤是TSC 患者常見的死因[7-8]。近年來有研究報道，TSC1 可調(diào)節(jié)骨髓造血干細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞的自我更新和分化；TSC1 通過不同信號通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2 極化減弱M1 極化而抑制炎癥反應(yīng)，在動物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，TSC1 的失活能促進(jìn)糖尿病小鼠腎小管上皮發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-tomesenchymal transition，EMT），mTOR 抑制劑在控制糖尿病腎纖維化有潛在意義[9-12]。因此，構(gòu)建TCS1基因敲除的穩(wěn)定細(xì)胞系能在細(xì)胞水平上模擬TSC1相關(guān)的分子機(jī)制。故本文利用CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)，采用雙位點(diǎn)切割的方法進(jìn)行敲除[13]，單個位點(diǎn)切割在一定程度上會發(fā)生脫靶效應(yīng)，而雙sgRNA 進(jìn)行雙位點(diǎn)切割，能夠顯著降低脫靶效應(yīng)[14-15]。本研究設(shè)計(jì)了針對TSC1 基因的兩條sgRNA，分別位于6 號外顯子的上游和下游。對6號外顯子進(jìn)行整體敲除，高效引發(fā)移碼突變，從而實(shí)現(xiàn)對TSC1 基因的編輯。

我們利用HEK293 細(xì)胞轉(zhuǎn)染lentilCRISPRv2-sgTSC1 的兩個切割質(zhì)粒后，對單克隆細(xì)胞進(jìn)行PCR 鑒定，結(jié)果挑取單一明亮的386bp 目的條帶，即2F6 和4C8 兩株細(xì)胞。部分泳道電泳結(jié)果有多條雜帶，可能是在挑取或培養(yǎng)單克隆細(xì)胞的過程中有攜帶污染。最后我們選取2F6 和4C8 兩株細(xì)胞進(jìn)行Western blot 鑒定，并進(jìn)行不同濃度的檢測。結(jié)果2F6 細(xì)胞中TSC1 蛋白并無明顯表達(dá)差異，可能是在培養(yǎng)過程中發(fā)生污染，應(yīng)注意移液槍吸取液體后不應(yīng)在樣品上方移動，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)輕柔，避免液滴飛濺污染其他細(xì)胞。4C8 細(xì)胞在上樣量為梯度的情況下，均無表達(dá)，說明該蛋白已被完全敲除，可用于后續(xù)細(xì)胞水平的研究。

本文利用分子克隆方法構(gòu)建了含有不同sgRNA 的重組質(zhì)粒lentilCRISPRv2-sgTSC1-1 和lentilCRISPRv2-sgTSC1-2，并測序驗(yàn)證了質(zhì)粒構(gòu)建的正確性。利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)構(gòu)建TSC1 基因敲除的HEK293 穩(wěn)定細(xì)胞株，經(jīng)PCR鑒定和Western blot 鑒定，TSC1基因被完全敲除。該敲除的細(xì)胞株為后續(xù)進(jìn)一步研究TSC1 在結(jié)節(jié)性硬化癥以及炎癥、腫瘤中的生物學(xué)功能奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。