TUBA1C促進(jìn)人肺腺癌細(xì)胞系增殖和遷移的機(jī)制研究

王利民，劉 鍇

（河北省中醫(yī)院腫瘤科 石家莊 050011）

據(jù)最新癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，肺癌是臨床最常見的癌癥類型及癌癥死亡首要原因，主要以非小細(xì)胞肺癌居多，其中腺癌是非小細(xì)胞肺癌的主要類型[1-2]。在過去的幾十年中，肺癌的病理結(jié)構(gòu)逐漸改變，肺腺癌成為最流行的亞型，約占肺癌總數(shù)的70%，尤其是在東亞[2-3]。并有數(shù)據(jù)顯示，以實(shí)性或亞實(shí)性結(jié)節(jié)為特征的早期肺腺癌的比例顯著增加[4]。因此研究專注于肺腺癌的發(fā)生發(fā)展及其潛在發(fā)病機(jī)制，對(duì)其臨床治療具有積極意義。TUBA1C 是與微管結(jié)構(gòu)相關(guān)的α-微管蛋白亞型，微管結(jié)構(gòu)是一種多功能細(xì)胞骨架蛋白，參與關(guān)鍵的細(xì)胞作用，在有絲分裂和細(xì)胞分裂過程中必不可少[5]。研究表明TUBA1C 與許多癌癥的細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期有關(guān)，其表達(dá)上調(diào)可以顯著影響腫瘤的生長和進(jìn)展[6-7]。并發(fā)現(xiàn)，TUBA1C 是細(xì)胞周期信號(hào)通路中的關(guān)鍵中介，在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，參與腫瘤的增殖、遷移及侵襲，是腫瘤靶向治療的新靶標(biāo)[5,7-8]。基于此本研究擬探究TUBA1C 在肺腺癌中的表達(dá)作用機(jī)制，以期為臨床肺腺癌的診治提供新的研究靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫，含10ml/dl 胎牛血清RPMI-1640 培養(yǎng)液，同時(shí)加入青霉素（100 IU/ml）和鏈霉素（100μg/ml），在37℃，5ml/dl CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2 儀器與試劑 胎牛血清、DMEN 培養(yǎng)液購自美國Gibco 公司；Lipo2000 試劑盒購自美國Invitrogen 公司；MTS 反應(yīng)液購自南京凱基生物技術(shù)有限公司；酶標(biāo)儀購自美國Bio-rad 公司；胰酶購自美國Gibco 公司；流式細(xì)胞儀購自美國Beckman Coulter 公司；兔抗人E2F1 單克隆抗體、兔抗人MYC 單克隆抗體購自英國Abcam 公司；青霉素、鏈霉素購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 臨床數(shù)據(jù)庫篩選：在臨床數(shù)據(jù)庫GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)[9]中探索目的蛋白的表達(dá)特征以及臨床預(yù)后相關(guān)性。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞以1×106/孔濃度接種于6 孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)按照Lipo2000 試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.3.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：取轉(zhuǎn)染培養(yǎng)后各組細(xì)胞消化、重懸，5×103個(gè)/孔接種于96 孔板，每孔設(shè)3 個(gè)生物重復(fù)，37℃，5ml/dl CO2培養(yǎng)箱孵育48 h；按照MTS∶培養(yǎng)液=1∶20 比例配制MTS 反應(yīng)液，每孔加入100 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；采用酶標(biāo)儀在490 nm處測量各孔吸光度值，繪制細(xì)胞增殖曲線，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長期各組細(xì)胞胰酶消化吹打制成單個(gè)細(xì)胞，將細(xì)胞懸浮在含10ml/dl胎牛血清DMEN培養(yǎng)液中；細(xì)胞懸液梯度倍數(shù)稀釋，接種于10 ml 預(yù)溫培養(yǎng)液皿，37℃ 5ml/dl CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)6～14 天至出現(xiàn)肉眼可見克隆時(shí)終止培養(yǎng)；收集細(xì)胞，PBS 洗滌兩次，4g/dl 多聚甲醛固定15 min，0.5g/dl 結(jié)晶紫染色15 min，水洗直至背景紫色洗掉，室溫晾干；倒置培養(yǎng)皿疊加一張透明膠片，于顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成速率。

1.3.5 劃痕遷移實(shí)驗(yàn)：取轉(zhuǎn)染培養(yǎng)后各組細(xì)胞胰酶消化，重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/ml 接種于6 孔板培養(yǎng)過夜；次日用10 μl 移液器槍頭垂直于6孔板在每孔底部劃線，加入無血清培養(yǎng)液分別培養(yǎng)0 和24 h，于倒置顯微鏡下觀察、拍照，測量細(xì)胞劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率。

1.3.6 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)：收集對(duì)數(shù)生長期各組細(xì)胞胰酶消化到離心管，3 000 g離心3 min，收集細(xì)胞沉淀，預(yù)冷PBS 洗滌2 次重懸，滴加等體積預(yù)冷的無水乙醇，吹打混勻，靜置24 h；細(xì)胞離心收集固定細(xì)胞，PBS 洗滌，加入500 μl PI/Triton X-100 染液[Triton X-100(0.10%)5μl, DNAsefree RNAsse A(sigma)2mg,PI(40μg/ml)10μl,補(bǔ)dd H2O 至500μl)]避光孵育30 min，于流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測分析。

1.3.7 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)：收集轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞加入裂解液進(jìn)行裂解，提取細(xì)胞總蛋白并測定其濃度和純度；取40 μg 蛋白樣品制樣，SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5g/dl 脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入待測蛋白稀釋一抗室溫孵育4h，搖床洗膜3 次，4℃過夜；次日去除多余一抗，洗膜4 次，加入標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，洗膜4 次，每次5 min，暗房顯影。1.3.8 基因功能分析：通過cBioPortal[10-11]臨床數(shù)據(jù)庫找到與TUBA1C 共表達(dá)的基因，利用metascape 進(jìn)行信號(hào)通路分析，找尋TUBA1C 可能參與癌癥進(jìn)程發(fā)揮功能的通路。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 25.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用one-way ANOVA 分析，組間兩兩比較采用LSD-t法檢驗(yàn)；癌組織及癌旁正常組織中基因表達(dá)差異比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TUBA1C 在肺腺癌中的表達(dá)屬性 見圖1。研究通過檢索GEPIA 數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，較相比鄰近正常組織，肺腺癌組織中TUBA1C 顯著高表達(dá)（P<0.05）（圖1a），且高表達(dá)與預(yù)后差具有明顯的臨床相關(guān)性（Logrank P=9.3e-5）（圖1b）；30 組肺腺癌臨床樣本中TUBA1C 表達(dá)水平（6.4±1.3）顯著高于癌旁正常組織（5.2±0.9），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.157，P＜0.001），且隨著癌癥的不斷惡化，TUBA1C 表達(dá)逐漸升高（P=0.003 49）（圖1c）。

圖1 TUBA1C 在肺腺癌中的表達(dá)屬性

2.2 TUBA1C 促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞增殖和遷移 見圖2。qRT-PCR 檢測顯示，與對(duì)照siCTL 組（1.02±0.13）相比，siTUBA1CA#1 組（0.25±0.06）和siTUBA1 CA#2 組（0.22±0.08） 細(xì)胞中TUBA1C 相對(duì)表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=68.799，P<0.001），表明轉(zhuǎn)染siRNA 介導(dǎo)敲低TUBA1C 表達(dá)的細(xì)胞系構(gòu)建成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測顯示，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)3，4 和5 天時(shí)siTUBA1CA#1組和siTUBA1CA#2 組細(xì)胞增殖A值明顯低于對(duì)照組（F=7.000～27.780，均P＜0.05）（見圖2a，表1）。siTUBA1CA#1 組（41.2±1.5）和siTUBA1 CA#2 組（40.3±1.3）細(xì)胞克隆形成率明顯低于對(duì)照組（72.4±2.2），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=342.482，P＜0.001）（如圖2b）；兩實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移率為73.4±3.2 和72.1±2.8，也明顯低于對(duì)照組（98.6±1.7），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=95.778，P＜0.001）（圖2c）；兩實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞周期為52.7%和50.1%，較對(duì)照組（41.8%）顯著阻滯在G1 期（圖2d）。

圖2 TUBA1C 促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞增殖和遷移

表1 不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞增殖A 值比較（±s）

表1 不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞增殖A 值比較（±s）

時(shí)間（天）siCTL 組siTUBA1CA#1 組siTUBA1CA#2 組FP 1 0.20±0.010.20±0.030.19±0.020.2140.813 2 0.32±0.030.28±0.040.28±0.031.4120.314 3 0.41±0.040.31±0.020.33±0.047.0000.027 4 0.52±0.030.36±0.040.37±0.0321.265＜0.001 5 0.61±0.050.39±0.030.40±0.0427.780＜0.001

2.3 TUBA1C 激活E2F1 和MYC 的表達(dá) 見圖3。通過metacape 網(wǎng)站分析與TUBA1C 共表達(dá)基因參與的信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)TUBA1C 可能參與調(diào)控E2F1和MYC 的表達(dá)，從而促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞增殖和遷移（圖3a）。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，siTUBA1CA#1組（0.21±0.02，0.33±0.03）和siTUBA1CA#2 組（0.20±0.03，0.36±0.02）細(xì)胞中E2F1 和MYC mRNA 表達(dá)水平較對(duì)照組（1.01±0.03，1.00±0.02）明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=883.773，758.294，均P＜0.001）（圖3b）；同時(shí)E2F1 和MYC 的蛋白水平也顯著降低（圖3c）。

圖3 TUBA1C 激活E2F1 和MYC 的表達(dá)

2.4 TUBA1C 通過激活E2F1 和MYC 的表達(dá)促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞增殖和遷移 見圖4，表2?；匮a(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，敲低TUBA1C 顯著抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，同時(shí)將細(xì)胞周期顯著阻滯在G1 期。但在敲低TUBA1C 表達(dá)的肺腺癌細(xì)胞中分別回補(bǔ)E2F1 和MYC 以及共回補(bǔ)E2F1 和MYC 后，細(xì)胞增殖速率（圖4a）、遷移速率（圖4b）以及細(xì)胞周期（如圖4c）較單純敲低TUBA1C 組相比均逐漸恢復(fù)正常（P<0.01），證明TUBA1C 通過激活E2F1和MYC 的表達(dá)促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。

圖4 TUBA1C 通過激活E2F1 和MYC 的表達(dá)促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞增殖和遷移

表2 不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞增殖A 值比較（±s）

表2 不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞增殖A 值比較（±s）

注：與siCTL 組相比，*P<0.05.

時(shí)間（天）siCTL 組siTUBA1CA 組 siTUBA1CA+ E2F1 組 siTUBA1CA+ MYC 組 siTUBA1CA+ E2F1+MYC 組FP 10.20±0.010.20±0.020.21±0.010.20±0.030.22±0.021.0910.412 20.32±0.030.25±0.030.30±0.020.30±0.010.40±0.0216.556＜0.001 30.41±0.040.32±0.030.39±0.030.39±0.020.52±0.0316.691＜0.001 40.52±0.030.36±0.020.50±0.040.50±0.030.63±0.0329.426＜0.001 50.61±0.050.38±0.030.58±0.040.58±0.030.74±0.0433.240＜0.001

3 討論

肺腺癌是非小細(xì)胞肺癌最常見的組織學(xué)亞型，目前盡管有多種方法可以治療，但其臨床死亡率仍較高[12]。因此，尋找新的治療目標(biāo)以改善治療方法至關(guān)重要。本研究經(jīng)檢索GEPIA 數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)肺腺癌中TUBA1C 顯著高表達(dá)，惡性程度越高其表達(dá)水平越高，具有高表達(dá)預(yù)后差特征，暗示TUBA1C在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的致癌作用。因此研究通過分子生物學(xué)細(xì)胞研究對(duì)TUBA1C 在肺腺癌細(xì)胞中的作用進(jìn)行了驗(yàn)證，首先研究在肺腺癌細(xì)胞中通過轉(zhuǎn)染陰性干擾序列siRNA 介導(dǎo)敲低TUBA1C 表達(dá)，分別通過細(xì)胞增殖、遷移、克隆實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了TUBA1C 對(duì)肺腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，發(fā)現(xiàn)敲低TUBA1C 表達(dá)明顯抑制了肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移及克隆形成率，阻滯細(xì)胞周期在G1 期，提示TUBA1C 在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮致癌作用。故進(jìn)一步探究其在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的致癌作用分子機(jī)制具有重要意義。

研究通過分析與TUBA1C 共表達(dá)基因參與信號(hào)通路發(fā)現(xiàn)，TUBA1C 可能參與調(diào)控經(jīng)典致癌基因E2F1 和MYC。E2F 是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)與腫瘤抑制因子pRB 結(jié)合的細(xì)胞蛋白，當(dāng)與pRB 家族成員結(jié)合時(shí)，E2Fs 充當(dāng)轉(zhuǎn)錄抑制因子，而游離的E2Fs 激活轉(zhuǎn)錄[13]。E2F1 是E2F 之一，并且已知在不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑（例如細(xì)胞周期，細(xì)胞自我更新，分化和凋亡）中上調(diào)靶基因[14]。E2F1 在肝細(xì)胞癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、胰腺癌[15-17]等許多癌癥中被下調(diào)，而在黑色素瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)E2F1 的過度表達(dá)[18]。在具有促進(jìn)腫瘤作用的功能之后，E2F1 的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖和抗凋亡相關(guān)[19]。c-MYC 癌蛋白在腫瘤發(fā)生中起著重要作用[20]。正常細(xì)胞中，c-MYC的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后機(jī)制的嚴(yán)格控制[21]。通過基因擴(kuò)增，染色體易位或插入誘變，c-MYC 在一半以上的人類癌癥（包括肺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌）中被激活[22]。使用細(xì)胞培養(yǎng)和小鼠模型進(jìn)行的廣泛研究已很好地表征了c-MYC 的強(qiáng)致癌活性[23]。既往研究已證明c-MYC 控制基因組中10%～15%基因的表達(dá)[20]。最近研究也表明c-MYC 是已經(jīng)活躍的啟動(dòng)子的全局?jǐn)U增子[24]。通過調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，c-Myc 可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過程，包括細(xì)胞增殖、分化、代謝和基因組不穩(wěn)定性[25]。而本研究通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，敲低TUBA1C 表達(dá)明顯降低了E2F1和MYC mRNA 蛋白表達(dá)水平，說明在肺腺癌細(xì)胞中TUBA1C 正調(diào)控E2F1 和MYC 表達(dá)，因此猜測TUBA1C 可能通過激活E2F1 和MYC 從而促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞增殖和遷移。為進(jìn)一步驗(yàn)證該猜測，研究經(jīng)細(xì)胞回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲低TUBA1C 表達(dá)的細(xì)胞在回補(bǔ)E2F1 和MYC 后其細(xì)胞增殖、遷移速率及細(xì)胞周期較單純TUBA1C 低表達(dá)組明顯恢復(fù)，證實(shí)TUBA1C 通過激活E2F1 和MYC 的表達(dá)從而促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞增殖和遷移、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，參與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，TUBA1C 通過激活E2F1 和MYC的表達(dá)促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞增殖和遷移、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，參與肺腺癌的惡性發(fā)展進(jìn)程。