胃癌組織中FOXP1和FOXQ1的表達(dá)水平與臨床病理特征及預(yù)后關(guān)系

朱 濤，王 偉，吳和剛

（1.宜賓市中醫(yī)醫(yī)院普外科,四川宜賓 644000；2.宜賓市第一人民醫(yī)院,a.普外科；b.病理科，四川宜賓 644000）

胃癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率在消化道腫瘤中居首位，其病死率居于惡性腫瘤第三位，且5年生存率低于30%[1-2]。目前探究胃癌的生物學(xué)特性與復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系，并找到相關(guān)的分子靶點(diǎn)予以靶向治療研究已成為當(dāng)今胃癌臨床研究的熱點(diǎn)。叉頭框(forkhead box, FOX)蛋白作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，參與脂類的新陳代謝、細(xì)胞周期的調(diào)控、胚胎發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)及生物老化等多種生物過程，其異常表達(dá)與代謝性疾病、發(fā)育畸形及腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在密切相關(guān)[3-4]。多個(gè)FOX 家族的亞族廣泛地參與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，其中叉頭框蛋白P1(forkhead box P1, FOXP1)和叉頭框蛋白Q1(forkhead box Q1, FOXQ1)屬于重要的叉頭轉(zhuǎn)錄因子[4]。研究報(bào)道，F(xiàn)OXP1 與FOXQ1 參與機(jī)體多種生理生化過程，在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)[5-6]。但關(guān)于FOXP1 和FOXQ1 在胃癌中的作用研究鮮有報(bào)道。本研究采用免疫組化EnVision 法檢測(cè)胃癌組織和癌旁組織中FOXP1，F(xiàn)OXQ1 的表達(dá)情況，并分析兩者與臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系，旨在探討二者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)胃癌預(yù)后診斷的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2014年1月～2017年2月在宜賓市中醫(yī)醫(yī)院普外科接受手術(shù)治療的156 例胃癌患者，選取胃癌組織作為觀察組，同時(shí)選取癌旁正常組織(距腫瘤邊緣＞5cm)作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者診斷均經(jīng)術(shù)前影像、胃鏡檢查和術(shù)后病理證實(shí)；所有患者均行胃癌根治術(shù)；術(shù)前未接受免疫治療、放化療或靶向治療；臨床隨訪資料完整者；患者或家屬簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前接受新輔助治療者；并發(fā)有其他原發(fā)性腫瘤者；行姑息性手術(shù)者；伴發(fā)血液、內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)等對(duì)腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)有影響的相關(guān)疾??；隨訪資料缺失。156例患者中男性91例，女性65例；年齡32～79歲，平均年齡55.26±8.59 歲；脈管神經(jīng)侵犯67 例，未侵犯89 例；區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移92 例，未轉(zhuǎn)移64 例；低分化69 例，中、高分化87 例； Lauren 分型彌漫型81 例，腸型75 例。

1.2 儀器與試劑 鼠抗人單克隆FOXP1,FOXQ1 抗體(美國Santa Cruz 公司)，免疫組化EnVision 試劑盒和DAB 顯示試劑盒（中杉金橋有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化檢測(cè):所有胃癌組織標(biāo)本均以10g/dl 甲醛固定，石蠟包埋。免疫組化染色(EnVision二步法)：常規(guī)脫蠟水化，抗原修復(fù)，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，芯片脫水，透明，封固，用自身對(duì)照作陽性對(duì)照，用PBS 代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3.2 免疫組化結(jié)果判定：FOXP1，F(xiàn)OXQ1 蛋白陽性顯色為淺黃色至棕黃色顆粒。FOXP1 陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核，F(xiàn)OXQ1 陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)和胞質(zhì)膜。根據(jù)染色強(qiáng)度與染色陽性細(xì)胞百分比對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)定。每張切片觀察5 個(gè)以上高倍視野(×400)，計(jì)數(shù)≥1 000 個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞比。染色細(xì)胞百分率評(píng)分：陽性細(xì)胞率≤10%為0 分，11%～25% 為1 分，26%～50% 為2 分，5l%～75%為3分，>75%為4分；染色強(qiáng)度評(píng)分：淺黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。FOXPl 和FOXQ1蛋白的表達(dá)結(jié)果為2 項(xiàng)乘積，0～3 分為低或無表達(dá)，4～12 分為高表達(dá)。本研究根據(jù)FOXPl 和FOXQ1蛋白表達(dá)將標(biāo)本分為高表達(dá)組和低或無表達(dá)組。

1.3.3 隨訪:采用來院就診和電話等方式對(duì)患者進(jìn)行5年隨訪。隨訪截至2020年8月31日，隨訪時(shí)間為3～60 個(gè)月。隨訪內(nèi)容為患者總體生存時(shí)間(overall survival time, OS)。OS 為手術(shù)開始至末次隨訪或死亡的時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料以陽性率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Spearman 相關(guān)分析胃癌組織中FOXP1 與FOXQ1 表達(dá)的相關(guān)性；采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析胃癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素；采用Kaplan-Meier 生存法分析胃癌患者術(shù)后OS，比較采用Log-rank 檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FOXP1，F(xiàn)OXQ1 蛋白在胃癌和癌旁組織中表達(dá)情況 胃癌組織中FOXPl蛋白高表達(dá)率（38.46%）低于癌旁組織（86.67%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=23.521,P＜0.05)；胃癌組織中FOXQl 蛋白高表達(dá)率(65.38%)高于癌旁組織（6.67%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=35.193,P＜0.05)。

2.2 胃癌患者FOXPl，F(xiàn)OXQl 蛋白表達(dá)情況與臨床病理特征的關(guān)系 見表1。胃癌組織中FOXPl，F(xiàn)OXQl 蛋白表達(dá)與年齡、性別、Lauren 分型、腫瘤部位無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)；胃癌組織中FOXPl，F(xiàn)OXQl 蛋白表達(dá)與腫瘤大小、病理分化程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度及脈管神經(jīng)侵犯相關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.668～14.909, 均P＜0.05)。

表1 FOXP1，F(xiàn)OXQ1 蛋白表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系(%)

2.3 胃癌組織中FOXP1 和FOXQ1 蛋白的相關(guān)性分析 在156 例胃癌中，96 例FOXP1 低或無表達(dá)的胃癌組織中，F(xiàn)OXQ1 高表達(dá)92 例，而低或無表達(dá)僅有4 例；60 例FOXP1 高表達(dá)的胃癌組織中，F(xiàn)OXQ1 低或無表達(dá)的50 例，而高表達(dá)僅有10 例。經(jīng)Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，F(xiàn)OXP1和FOXQ1 蛋白在胃癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.526,P＜0.001)。

2.4 預(yù)后影響因素分析 見表2。將胃癌患者OS 作為因變量，以腫瘤大小、病理分化程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、脈管神經(jīng)侵犯、FOXP1 表達(dá)、FOXQ1 表達(dá)、FOXP1低或無表達(dá)/FOXQ1高表達(dá)為自變量進(jìn)行多因素Cox 回歸分析，結(jié)果顯示TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、FOXP1 低或無表達(dá)、FOXQ1 高表達(dá)、FOXP1低或無表達(dá)/FOXQ1高表達(dá)均是影響胃癌患者OS 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P＜0.05)。

表2 影響胃癌患者OS 的多因素Cox 回歸分析

2.5 生存分析 Kaplan-Meier 法分析結(jié)果顯示FOXP1 低或無表達(dá)組和高表達(dá)組5年生存率分別為50.00%，68.30%，F(xiàn)OXP1 低或無表達(dá)組者OS短于高表達(dá)患者(χ2=6.570,P=0.010)；FOXQ1 高表達(dá)組和低或無表達(dá)組5年生存率分別為50.98%和68.52%，F(xiàn)OXQ1 高表達(dá)組OS 短于低或無表達(dá)組(χ2=7.045,P=0.008)；FOXP1低或無表達(dá)/FOXQ1高表達(dá)組和其他患者5年生存率分別為32.60%和92.20%，F(xiàn)OXP1低或無表達(dá)/FOXQ1高表達(dá)患者OS 短于其他患者(χ2==57.228,P=0.000)；FOXP1低或無表達(dá)/FOXQ1高表達(dá)組、FOXP1 低或無表達(dá)組和FOXQ1 高表達(dá)組5年生存率分別為32.60%，50.00%，50.98%，F(xiàn)OXP1低或無表達(dá)/FOXQ1高表達(dá)組OS 短于FOXP1 低或表達(dá)組和FOXQ1 高表達(dá)組(χ2=8.112,P=0.017) 。

3 討論

近年來，胃癌的診斷技術(shù)水平已獲得較大進(jìn)步，但因胃癌起病隱匿，早期無癥狀或癥狀不明顯，很多患者被確診時(shí)已是臨床晚期[7]。手術(shù)治療仍是當(dāng)前治療胃癌的重要方法，胃癌根治術(shù)是主要的手術(shù)方式[8]。胃癌根治術(shù)盡管已進(jìn)行了廣泛的淋巴結(jié)清掃，但中晚期患者術(shù)后復(fù)發(fā)率仍較高，5年生存率低于20%[9]。胃癌的發(fā)病與體內(nèi)癌基因及抑癌基因表達(dá)異常造成細(xì)胞增殖異常及凋亡受到抑制有關(guān)[10]。對(duì)胃癌的生物學(xué)特性、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及預(yù)后從基因?qū)用嫔线M(jìn)行探索，并找到相關(guān)分子靶點(diǎn)予以靶向治療研究已成為當(dāng)今胃癌研究的熱點(diǎn)。

叉頭框蛋白(forkhead box, FOX)是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，具有進(jìn)化保守的“叉頭”或“翼狀螺旋結(jié)構(gòu)”的DNA 結(jié)合域，在細(xì)胞周期調(diào)控、增殖、分化及DNA 損傷反應(yīng)等多種生物學(xué)過程中扮演著重要角色[11]。研究報(bào)道，F(xiàn)OX 家族通過復(fù)雜廣泛的網(wǎng)絡(luò)，在不同的調(diào)控水平上促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12]。叉頭框蛋白P1(FOXP1)是FOX 家族成員之一，定位于3p14.1 的腫瘤抑制基因座，此區(qū)域與許多腫瘤類型雜合性缺失相關(guān)，F(xiàn)OXP1 可能是一種潛在的惡性腫瘤抑制基因[13]。FOXP1 轉(zhuǎn)錄活性在許多惡性腫瘤中受到抑制，可能與FOXP1 mRNA 的下降、FOXP1 在細(xì)胞質(zhì)的異常定位或表達(dá)水平下降有關(guān)[14-15]。劉湘鄂等[16]研究報(bào)道，前列腺癌組織中FOXP1 蛋白表達(dá)缺失或低表達(dá)與預(yù)后不良密切相關(guān)。孫百爾等[17]研究報(bào)道，F(xiàn)OXP1 蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)下降，其表達(dá)水平越低患者生存時(shí)間越短。XIAO 等[18]研究報(bào)道，子宮內(nèi)膜癌組織中FOXP1 蛋白低表達(dá)，且與低氧介導(dǎo)因子1α，雌激素受體-α 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。目前，F(xiàn)OXP1 在胃癌中的研究報(bào)道較少。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中FOXPl 蛋白高表達(dá)率低于癌旁組織(P＜0.05)；胃癌組織中FOXPl 蛋白表達(dá)與腫瘤大小、病理分化程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度及脈管神經(jīng)侵犯相關(guān)(P＜0.05)；多因素Cox 回歸分析結(jié)果顯示，F(xiàn)OXP1 低或無表達(dá)是影響胃癌患者OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P＜0.05)；Kaplan-Meier 分析結(jié)果顯示，F(xiàn)OXP1 低或無表達(dá)組者OS 累積生存率低于高表達(dá)患者(P＜0.05)。結(jié)果表明，F(xiàn)OXP1 蛋白的表達(dá)在胃癌組織中被抑制，其在胃癌的發(fā)生發(fā)展中可能起到一定的促進(jìn)作用，且FOXP1 表達(dá)被抑制與胃癌患者不良預(yù)后存在密切聯(lián)系。

叉頭框蛋白Q1(FOXQ1)是轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，定位在6p25.3 的腫瘤基因座，可參與調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin 通路、抑制平滑肌特異性基因的啟動(dòng)子活性及促進(jìn)大多數(shù)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移等，與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[19-20]。FOXQ1 蛋白在胃癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌等多種消化道惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用國內(nèi)外已有研究。王城等[21]研究報(bào)道，沉默F(xiàn)OXQ1 基因的表達(dá)能夠抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞的遷移、侵襲能力。鄧大煒等[22]研究報(bào)道，F(xiàn)OXQ1 蛋白在胰腺癌干細(xì)胞中過表達(dá)，且FOXQ1的mRNA 表達(dá)量也增加。LIU 等[23]研究報(bào)道，結(jié)直腸癌組織中FOXQ1 蛋白過表達(dá)與患者預(yù)后不良密切相關(guān)。崔曉海等[24]研究報(bào)道，F(xiàn)OXQ1 蛋白在胃癌組織中高表達(dá)，且與TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中FOXQl 蛋白高表達(dá)率高于癌旁組織(P＜0.05)；胃癌組織中FOXQl 蛋白表達(dá)與腫瘤大小、病理分化程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度及脈管神經(jīng)侵犯相關(guān)(P＜0.05)；多因素Cox 回歸分析結(jié)果顯示，F(xiàn)OXQ1 高表達(dá)是影響胃癌患者OS 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P＜0.05)；Kaplan-Meier 分析結(jié)果顯示，F(xiàn)OXQ1 高表達(dá)組者OS 累積生存率低于高表達(dá)患者(P＜0.05)。結(jié)果表明，F(xiàn)OXQ1 蛋白高表達(dá)與胃癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。

本研究中，Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，在胃癌組織中，F(xiàn)OXP1 和FOXQ1 蛋白的表達(dá)情況呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)；Cox 回歸分析結(jié)果顯示，F(xiàn)OXP1低或無表達(dá)/FOXQ1高表達(dá)是影響胃癌患者OS 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P＜0.05)；Kaplan-Meier 分析結(jié)果顯示，F(xiàn)OXP1低或無表達(dá)/FOXQ1高表達(dá)患者OS 累積生存率低于其他患者(P＜0.05)；FOXP1低或無表達(dá)/FOXQ1高表達(dá)組OS 累積生存率低于FOXP1 低或表達(dá)組和FOXQ1 高表達(dá)組(P＜0.05)。結(jié)果表明，F(xiàn)OXQ1 在胃癌的發(fā)生發(fā)展中是致癌基因，而FOXP1 在胃癌發(fā)生發(fā)展中是抑癌基因，F(xiàn)OXP1 低或無表達(dá)和FOXQ1 高表達(dá)患者預(yù)后更差，二者聯(lián)合檢測(cè)可應(yīng)用于臨床判斷胃癌患者的預(yù)后。

綜上所述，F(xiàn)OXP1 在胃癌組織中低或無表達(dá)，F(xiàn)OXQ1 蛋白在胃癌組織中高表達(dá)，F(xiàn)OXP1 低或無表達(dá)和FOXQ1 高表達(dá)患者預(yù)后更差，兩者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)胃癌的預(yù)后診斷價(jià)值較單獨(dú)檢測(cè)更高，同時(shí)也為胃癌的靶向治療提供了新思路。