MTHFR基因多態(tài)性與脊髓亞急性聯(lián)合變性的相關(guān)性分析

陳靜非，徐志昊，高媛雪，李建剛，魚 海，張建軍，侯瑞華

(寶雞市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西寶雞 721000)

脊髓亞急性聯(lián)合變性（subacute combined degeneration，SCD）是一種主要累及脊髓側(cè)索和錐體束的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，臨床上多表現(xiàn)為雙下肢深感覺缺失、感覺性共濟(jì)失調(diào)、痙攣性癱瘓及周圍性神經(jīng)病變。長(zhǎng)期以來(lái)，維生素B12（vitamin B12，VitB12）缺乏被認(rèn)為是本病最主要的致病原因，其機(jī)制在于VitB12 參與神經(jīng)系統(tǒng)甲基化過(guò)程，可影響髓磷脂合成，長(zhǎng)期缺乏會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)脫髓鞘及軸索變性改變[1-2]。但是，臨床工作中常發(fā)現(xiàn)部分SCD 患者無(wú)確切VitB12 缺乏證據(jù)，提示可能還存在其他潛在致病原因。有研究發(fā)現(xiàn)SCD 患者血清同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）水平顯著升高[3]，而Hcy 水平過(guò)高可反饋性抑制甲基化過(guò)程[4]。5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶（5,10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是葉酸代謝通路的關(guān)鍵酶之一，為Hcy提供甲基形成甲硫氨酸。近年來(lái)，相繼有研究發(fā)現(xiàn)MTHFR 基因存在多個(gè)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)可影響MTHFR 正常生理功能，進(jìn)而影響機(jī)體Hcy表達(dá)和代謝[5-8]。本研究將觀察SCD 患者血清VitB12，葉酸、Hcy 和MTHFR 基因多態(tài)性的關(guān)系，旨在探討MTHFR 基因多態(tài)性與SCD 發(fā)病的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 連續(xù)性選擇2017年1月～2020年7月于寶雞市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科診治的85 例SCD 患者作為病例組，其中男性49 例，女性36例，平均年齡56.77±10.82 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18 歲；②SCD 診斷參考HEMMER 等[9]提出的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①血清檢測(cè)前3月內(nèi)應(yīng)用過(guò)VitB12 和（或）葉酸治療；②并發(fā)嚴(yán)重肝腎功能障礙、惡性腫瘤等；③妊娠期婦女。選擇同期于我院體檢的健康志愿者100 例作為對(duì)照組，其中男性55 例，女性45 例，平均年齡57.03±9.66 歲，對(duì)照組成員均接受詳細(xì)問診排除脊髓疾病可能。病例組和對(duì)照組性別、年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 儀器與試劑 7900 HT 型熒光定量PCR 儀（美國(guó)ABI 公司），Unicel Dxl 800 Access 免疫分析系統(tǒng)（美國(guó)Beckman Coulter 有限公司），日立7170A 分析儀（日本日立有限公司），VitB12 及葉酸檢測(cè)試劑盒（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司），Hcy 檢測(cè)試劑盒（北京康思潤(rùn)業(yè)生物技術(shù)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 基因多態(tài)性檢測(cè)：本研究采用熒光定量PCR 法檢測(cè)MTHFR 基因C677T 和A1298C 位點(diǎn)多態(tài)性。引物均購(gòu)至生工生物工程（上海）股份有限公司，C677T 位點(diǎn)上游引物：5’-GAA AAGCTGCGTGATGATG-3’；下游引物：5’-TTGA AGGAGAAGGTGTC-3’。A1298C 位點(diǎn)上游引物：5’-AAGAACGAAGACTTCAAA-3’； 下游引物：5’-TGGGGGGAGGAGCTGAC-3’。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物移至熒光定量PCR 儀上讀取樣品孔中的終點(diǎn)熒光，利用分析軟件確定各樣本的基因型結(jié)果。

1.3.2 血清VitB12，葉酸和Hcy 水平檢測(cè)：所有研究對(duì)象在接受VitB12 治療之前空腹采集5ml 靜脈血，3 000 r/min，離心5 min。血清VitB12 和葉酸均按化學(xué)發(fā)光免疫法進(jìn)行檢測(cè)；血清Hcy 則按循環(huán)酶法進(jìn)行檢測(cè)。本研究定義血清VitB12濃度＜180pg/ml 為VitB12 缺乏、血清葉酸濃度＜3.1 ng/ml為葉酸缺乏、血清Hcy 濃度＞15μmol/L 為高Hcy。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，計(jì)數(shù)資料結(jié)果以構(gòu)成百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)?；蛐头植疾捎肏ardy-Weinberg平衡定律檢驗(yàn)。多因素分析采用二元Logistic 回歸分析法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般臨床資料比較 見表1。病例組貧血、VitB12 缺乏和高Hcy 發(fā)生率均高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。

表1 兩組基線資料比較[n(%)]

2.2 兩組MTHFR 基因C677T 和A1298C 位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率比較 見表2。研究對(duì)象C677T 和A1298C 位點(diǎn)上的基因型和等位基因分布頻率均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（均P＞0.05），具有群體代表性。兩組C677T 和A1298C 位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表2 兩組MTHFR 基因C677T 和A1298C 位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率比較[n(%)]

2.3 兩位點(diǎn)不同基因型與血清VitB12，葉酸和Hcy 水平的關(guān)系 見表3，表4。MTHFR 基因C677T 位點(diǎn)和A1298C 位點(diǎn)不同基因型人群VitB12 缺乏和葉酸缺乏發(fā)生率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；兩位點(diǎn)不同基因型人群高Hcy 發(fā)生率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。

表3 C677T 位點(diǎn)不同基因型與血清VitB12，葉酸和Hcy 水平的關(guān)系[n(%)]

表4 A1298C 位點(diǎn)不同基因型與血清VitB12，葉酸和Hcy 水平的關(guān)系[n(%)]

2.4 多因素分析 見表4。采用二元Logistics 回歸法分析SCD 發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，以單因素分析P＜0.05 的參數(shù)為自變量，包括貧血、VitB12 缺乏、高Hcy，C677T 位點(diǎn)TT 基因型和A1298C 位點(diǎn)CC基因型，但由于Hcy 升高是MTHFR 基因突變的直接結(jié)果，故從自變量中剔除；以SCD 發(fā)病為因變量，結(jié)果顯示攜帶C677T 位點(diǎn)TT 基因型是SCD 發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（OR=2.768，95% CI：1.487～5.516，P=0.005），A1298C 位點(diǎn)基因多態(tài)性與SCD 發(fā)病無(wú)明確相關(guān)性（OR=2.190，95% CI：0.958～5.004，P=0.067）。

表4 SCD 易感性的多因素分析

3 討論

目前，多數(shù)研究一致認(rèn)為早期診斷和及時(shí)治療是改善SCD 預(yù)后的關(guān)鍵因素，一般在發(fā)病的前三個(gè)月內(nèi)經(jīng)積極治療和康復(fù)鍛煉，SCD 患者預(yù)后相對(duì)較好，部分患者甚至可達(dá)到完全恢復(fù)，而當(dāng)進(jìn)展到病程后期時(shí)，即使給予相應(yīng)治療，仍然療效欠佳，多數(shù)患者可能遺留的部分神經(jīng)功能障礙不能恢復(fù)[10]。因此，對(duì)可疑SCD 患者在發(fā)病早期及時(shí)篩查和治療對(duì)患者預(yù)后具有重要臨床意義。長(zhǎng)期以來(lái)，VitB12 缺乏仍是SCD 最為公認(rèn)的假說(shuō)之一，本研究結(jié)果同樣顯示病例組患者血清VitB12 平均水平顯著低于對(duì)照組。但臨床中經(jīng)常出現(xiàn)部分SCD 患者無(wú)確切VitB12缺乏證據(jù)，甚至因此貽誤診治時(shí)機(jī)，影響患者預(yù)后。因此，繼續(xù)深入探討該病發(fā)病機(jī)制和分子遺傳學(xué)背景具有重要的臨床價(jià)值。

近年來(lái)，多個(gè)研究結(jié)果表明高Hcy 可能與SCD發(fā)病相關(guān)，其機(jī)制尚未明確，可能在于Hcy 過(guò)多蓄積會(huì)反饋性抑制機(jī)體甲基化反應(yīng)，繼而導(dǎo)致核酸代謝和髓鞘合成受損[3-4,10]。MTHFR 是參與Hcy 轉(zhuǎn)化為蛋氨酸的關(guān)鍵酶，其在DNA 合成和甲基化過(guò)程中也起著重要作用[13]。C677T（rs1801133）和A1298C（rs1801131）是MTHFR 基因最常見的SNP位點(diǎn)，研究顯示攜帶突變基因個(gè)體的MTHFR 酶活性可明顯降低。因此，研究認(rèn)為C677T T 等位基因和A1298C C 等位基因與DNA 甲基化減少和Hcy濃度增加有關(guān)[5]。目前已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)C677T 和A1298C 基因多態(tài)性與各類疾病有關(guān)，如出生缺陷、阿爾茨海默病、卒中、惡性腫瘤等[5,13-14]。近期一項(xiàng)研究以中國(guó)北方漢人為研究對(duì)象，結(jié)果顯示攜帶C677T TT 基因型可增加SCD 患病風(fēng)險(xiǎn)，但該研究?jī)H納入31 例SCD 患者，且僅觀察C677T 一個(gè)SNP位點(diǎn)[15]。此外，既往研究表明不同地區(qū)、種族人群MTHFR 基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型分布頻率存在明顯差異，如歐洲和北美人群C677T 位點(diǎn)TT 純合子頻率為5%～15%，遠(yuǎn)低于中國(guó)人20%～25%[16-17]。在國(guó)內(nèi)不同地域不同民族之間，兩位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率也不一致，有薈萃分析結(jié)果顯示以秦嶺-淮河為界，中國(guó)北方人群C677T TT 基因型和T 等位基因頻率均高于南方人群，而A1298C CC 基因型和C 等位基因分布頻率均低于南方人群[18]。因此，有必要繼續(xù)開展相關(guān)研究以驗(yàn)證和進(jìn)一步探討MTHFR 基因多態(tài)性與SCD 的相關(guān)性。

本研究結(jié)果顯示攜帶C677T 位點(diǎn)TT 基因型可顯著增加SCD 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（OR=2.768，95% CI：1.487～5.516，P=0.005），與ZHANG 等[15]研究結(jié)果相符。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)C677T 位點(diǎn)不同基因型之間高Hcy 發(fā)生率存在顯著差異，尤其攜帶TT基因型人群顯著高Hcy 發(fā)生率高于CC 基因型人群，驗(yàn)證了本研究的前期推測(cè)，即MTHFR 基因突變可導(dǎo)致MTHFR 酶活性下降，進(jìn)而降低5-亞甲基四氫葉酸濃度，抑制Hcy-甲硫氨酸再甲基化，導(dǎo)致Hcy 在體內(nèi)不斷蓄積，使核酸代謝和髓鞘合成受損，導(dǎo)致SCD 發(fā)病。此外，本研究結(jié)果還顯示A1298C位點(diǎn)不同基因型之間高Hcy 發(fā)生率也存在顯著差異，但本研究未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)基因多態(tài)性與SCD 明顯相關(guān)，一方面可能與該位點(diǎn)突變基因頻率偏低，樣本量相對(duì)較少，檢驗(yàn)效能不足有關(guān)，另一方面也表明了SCD 發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在陜西地區(qū)漢族人群中，MTHFR C677T 多態(tài)性與SCD 易感性密切相關(guān)。本研究還有一定的局限性：首先，由于SCD 患病率相對(duì)較低，本研究納入的樣本量偏少。其次，如前所訴，不同地域不同民族患者該基因兩位點(diǎn)多態(tài)性分布頻率均存在一定差異，因此有必要繼續(xù)在多區(qū)域開展研究。第三，SCD 的其他潛在危險(xiǎn)因素，包括其他MTHFR 多態(tài)性，需要進(jìn)一步研究。最后，本研究未就MTHFR 基因多態(tài)性與神經(jīng)功能障礙嚴(yán)重程度和預(yù)后進(jìn)行觀察，也需要進(jìn)一步闡明。