人工遠(yuǎn)端肢體缺血再灌注對APAP誘導(dǎo)小鼠肝損傷的保護(hù)作用研究

鄭 偉，宋曉雪，嚴(yán) 翔，張智勇，?；⒘?/p>

（陜西省人民醫(yī)院肝膽外科，西安 710068）

對乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）誘導(dǎo)的急性肝損傷是藥物誘導(dǎo)的肝損傷及肝衰竭的主要原因[1]。目前對早期藥物性肝損傷的治療主要是服用解毒藥N-乙酰半胱氨酸（NAC），病人如果不及時接受NAC 治療則會導(dǎo)致嚴(yán)重的肝損傷，從而進(jìn)一步發(fā)展成肝衰竭遠(yuǎn)端肢體缺血再灌注處理是近年來研究發(fā)現(xiàn)的能有效抵抗缺血再灌注損傷從而對心臟和肝臟起到保護(hù)作用的一種方法[3-4]。根據(jù)其在靶器官缺血前還是缺血后處理分為遠(yuǎn)端肢體缺血再灌注預(yù)處理（R-IPC）和遠(yuǎn)端肢體缺血再灌注后處理（R-IPOST）?；赗-IPC 和R-IPOST 對遠(yuǎn)端器官缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用[5]，本研究旨在探究R-IPC 和R-IPOST 在APAP 誘導(dǎo)的藥物性肝損傷中的作用研究, 擬為急性藥物性肝損傷的治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 4～5 周齡、體重約20～26 g 的雄性C57BL/6 小鼠購買自陜西省人民醫(yī)院實驗動物中心[許可證號：SYXK（陜）2016-006]，并在該中心飼養(yǎng)。小鼠的飼養(yǎng)及監(jiān)管嚴(yán)格按照陜西省人民醫(yī)院倫理委員會規(guī)則執(zhí)行。

1.2 儀器及試劑 TNF-α 和IL-6 檢測試劑盒由深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司提供。ALT 試劑盒、AST 試劑盒、GSH 試劑盒、SOD 試劑盒和MDA試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。RIPA裂解液由上海碧云天生物技術(shù)有限公司提供。APAP 溶液的配制（將0.6g APAP 粉劑溶于100ml生理鹽水中，在40℃水浴鍋中晃動充分溶解、混勻，按300mg/kg 即50ml/kg 的劑量給藥準(zhǔn)備，每只小鼠約20g 重，平均給藥劑量約1ml）。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組及模型制作：實驗分組：①正常對照組：小鼠不做任何處理；②假手術(shù)組：小鼠遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理后腹腔注射1ml 生理鹽水；③APAP 組：小鼠腹腔注射1ml APAP 的生理鹽水溶液；④R-IPC+APAP 組：小鼠遠(yuǎn)端缺血處理后 5min 后腹腔注射1ml APAP 的生理鹽水溶液；⑤R-IPOST+APAP 組：小鼠腹腔注射1ml APAP 的生理鹽水溶液后，進(jìn)行遠(yuǎn)端缺血處理。各組小鼠均在APAP 暴露16 h 后處死，及時采集血液樣本和肝組織樣本。

遠(yuǎn)端肢體缺血再灌注處理：首先麻醉小鼠：將 25 mg 的氯胺酮和2.5 ml 甲苯噻嗪混合比例配制好麻藥，給每只小鼠注射麻藥，麻藥的給藥劑量為3～5 ml/kg；在雙側(cè)后肢股三角處剪毛，沿血管走行方向逐層切開皮膚、皮下組織，分離縫匠肌后部，游離出雙側(cè)股動脈待用。R-IPC 組用無損傷小血管夾夾閉雙側(cè)股動脈5 min 造成肢體缺血后，再松開血管夾，讓血液再灌注5min,連續(xù)操作4 個循環(huán)，再腹腔注射1ml 的APAP 鹽溶液（300 mg/kg 溶解于1ml 生理鹽水中）。R-IPOST 是先腹腔注射1ml的APAP 鹽溶液后，再進(jìn)行4 個周期的肢體遠(yuǎn)端缺血再灌注?？赏ㄟ^足部的顏色及雙下肢股動脈搏動情況來顯示血液流動情況進(jìn)而評價遠(yuǎn)端局部缺血的效果。

1.3.2 血清ALT, AST, TNF-α, IL-6 水平的測定：根據(jù)檢測試劑盒說明書指示，測定血清ALT, AST,TNF-α, IL-6 水平。

1.3.3 肝組織病理學(xué)檢查 ：取出分離后的肝臟組織利用甲醛溶液固定, 常規(guī)蘇木精-伊紅（H＆E）染色,觀察肝組織病理學(xué)改變。

1.3.4 氧化應(yīng)激程度的測定：根據(jù)檢測試劑盒說明書指示，測定肝組織MDA, GSH, SOD 含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 GraphPad Prism6.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）形式表示。多組的比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步組間比較采用LSD-t檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 R-IPC 和 R-IPOST 對APAP 肝損傷小鼠肝組織病理變化的影響 見圖1。與對照組和假手術(shù)組比較，APAP 組炎性細(xì)胞浸潤，肝竇擁擠出血，肝小葉中心廣泛壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞明顯；與APAP組比較，可見R-IPC+APAP 組和 R-IPOST+APAP組小鼠肝臟肝細(xì)胞壞死減少，肝竇無明顯擁擠現(xiàn)象，肝小葉中心未出現(xiàn)廣泛壞死。2.2 R-IPC 和R-IPOST 處理對APAP 肝損傷小鼠肝功能、炎癥水平和氧化應(yīng)激程度的影響 見表1。與對照組和假手術(shù)組ALT, AST 水平相比，APAP組小鼠血清中ALT, AST 水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=12.520～19.730, 均P<0.05），提示小鼠藥物性肝損傷造模成功。R-IPC+APAP 組血清ALT, AST 水平明顯低于APAP 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t＝7.032, 3.432, 均P<0.05)。R-IPOST+APAP組血清ALT, AST 明顯低于APAP 組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t＝4.981, 3.470，均P<0.05)。ALT, AST在R-IPC+APAP 組與R-IPOST+APAP 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t＝0.860, 0.231,P＞0.05)。

表1 遠(yuǎn)端缺血再灌注對APAP 誘導(dǎo)急性藥物性肝損傷小鼠各指標(biāo)的影響（±s）

表1 遠(yuǎn)端缺血再灌注對APAP 誘導(dǎo)急性藥物性肝損傷小鼠各指標(biāo)的影響（±s）

項 目正常對照組假手術(shù)組APAP 組R-IPC+APAP 組R-IPOST+APAP 組ALT(U/L)38.8±4.438.6±3.85 564± 621.73 742±519.73 410± 588.6 AST(U/L)28.6±3.527.8±4.24 647± 813.93 471± 631.43 546±499.5 TNF-α(pg/ml)45.0±5.247.2±4.2351.7 ± 52.3264.8± 70.4256.6± 48.1 IL-6(pg/ml)72.0±6.976.0±7.1929.7± 140.6738.7 ± 71.0775.4 ± 98.4 MDA (nmol/mg.prot)2.6±0.82.8±1.013.1± 1.78.9± 1.29.3 ±1.9 SOD(U/mg.prot)18.1±1.518.4±1.28.6± 1.111.0± 1.910.3± 1.6 GSH(U/mg.prot)14.2±1.014.6±2.57.9± 0.6 8.7±1.2 10.3±1.2

圖1 R-IPC 和 R-IPOST 處理對APAP 誘導(dǎo)的肝組織的病理學(xué)變化的影響(HE 染色)

與對照組和假手術(shù)組比較，APAP 組小鼠血清TNF-α, IL-6 水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝12.150～14.310, 均P<0.05）。R-IPC+APAP組血清TNF-a, IL-6 水平明顯低于APAP 組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t＝3.400, 3.602，均P<0.05)。R-IPOST+APAP 組血清TNF-a, IL-6 水平明顯低于APAP 組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t＝2.924, 2.196，均P<0.05)。TNF-α, IL-6 在R-IPC+APAP 組 與R-IPOST+APAP 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t＝0.162,0.660,P＞0.05)。

與對照組和假手術(shù)組比較，APAP 組小鼠MDA含量明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝16.090,14.150,P<0.05）。R-IPC+APAP 組和R-IPOST+APAP組肝組織MDA 含量明顯低于APAP 組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t＝3.483, 4.581，均P<0.05)。MDA在R-IPC+APAP 組與R-IPOST+APAP 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t＝0.347,P＞0.05)。

與對照組和假手術(shù)組比較，APAP 組小鼠SOD 及 GSH 活性均明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝5.748～12.460, 均P<0.05）。R-IPC+APAP組SOD 明顯高于APAP 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝3.043，P<0.05）；GSH 活性高于APAP 組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t＝1.622，P=0.18）。R-IPOST+APAP 組SOD 高于APAP 組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t＝1.940，P=0.12）；GSH活性明顯高于APAP 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝3.702，P<0.05）。SOD, GSH 在R-IPC+APAP組與R-IPOST+APAP 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t＝0.488, 1.685, 均P＞0.05)。

3 討論

肝臟是人體主要的代謝器官，其主要參與體內(nèi)糖原儲存，分解血液中的紅細(xì)胞、蛋白合成以及解毒過程等功能[6-7]。由于其多方面生理功能導(dǎo)致其是許多藥物毒性作用的靶器官[8]。APAP 在治療劑量時是一種解熱鎮(zhèn)痛消炎藥且具有安全性。但是過量時會使肝小葉中心的肝細(xì)胞發(fā)生壞死，嚴(yán)重時可致命。

遠(yuǎn)端局部缺血因其使用便捷成為臨床中最具潛力的一種治療手段[9]。組織的短暫缺血比如遠(yuǎn)端肢體缺血再灌注預(yù)處理和后處理，能對靶器官產(chǎn)生保護(hù)作用，使其免受缺血或其他損傷[10]。而遠(yuǎn)端肢體缺血再灌注預(yù)處理和后處理僅在干預(yù)時機(jī)上有差別，本次研究發(fā)現(xiàn)兩種處理方式組間結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義，都能降低APAP 誘導(dǎo)的肝臟損傷程度，減少炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激程度，起到相近的保肝作用。

炎癥反應(yīng)在APAP 誘導(dǎo)的肝毒性的機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。既往研究發(fā)現(xiàn)APAP 處理能刺激機(jī)體分泌炎性因子，比如TNF-α, IL-1β 和IL-6 等，表明這些細(xì)胞因子在APAP 誘導(dǎo)的毒性作用中發(fā)揮潛在作用[11]。BLAZKA 等[12]人證明小鼠經(jīng)過APAP 處理后TNF-α 的血清水平明顯增加，使用TNF-α 抗體能夠抵抗APAP 誘導(dǎo)的毒性作用。以往的研究表明遠(yuǎn)端缺血后處理對肝缺血/再灌注損傷或脂多糖誘導(dǎo)的肝損傷產(chǎn)生的炎性反應(yīng)具有降低的效應(yīng)[3-4]。本次研究結(jié)果表明R-IPC 和 R-IPOST能降低APAP 誘導(dǎo)肝損傷TNF-α 和IL-6 水平，具有抗炎作用。

氧化應(yīng)激是APAP 誘導(dǎo)肝損傷的另一個重要原因。MDA 是脂質(zhì)過氧化的代謝產(chǎn)物，其含量反映了機(jī)體的脂質(zhì)過氧化程度[13]。而GSH，SOD 則是體內(nèi)最重要的抗氧化物質(zhì)，也是中和APAP 所致毒性的關(guān)鍵[14-15]。近年來，COSTA 等[16]人發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理能抵抗肝臟和腎臟細(xì)胞的氧化性損傷。XIN 等[17]人也發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)端缺血后處理能降低非酒精性脂肪肝大鼠MDA 和SOD 的水平。本研究顯示R-IPC 和R-IPOST 同樣能夠抑制APAP 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、改善氧化損傷，改善GSH 和SOD 水平，降低MDA 產(chǎn)生。

目前有報道稱R-IPC 能減輕非酒精性脂肪肝大鼠遭受缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能與誘導(dǎo)合成熱休克蛋白 70（HSP70）的表達(dá)有關(guān)[18]。SHIN 等[19]人發(fā)現(xiàn)NF-κB 是遠(yuǎn)端局部缺血條件作用的一個靶點，NF-κB 的激活和核內(nèi)轉(zhuǎn)錄可以被HO-1 抑制，從而發(fā)揮對脂肪肝細(xì)胞的保護(hù)作用。盡管如此，對于遠(yuǎn)端缺血處理降低肝臟再灌注或炎性損傷的機(jī)制仍未完全明確。

綜上所述，R-IPC 和R-IPOST 能降低APAP 誘導(dǎo)肝損傷的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激程度，對藥物性肝損傷具有保護(hù)作用。本研究僅對遠(yuǎn)端肢體缺血再灌注處理對APAP 誘導(dǎo)肝損傷的保護(hù)作用進(jìn)行初步觀察，而涉及其中的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。