胸部放療患者血漿外泌體中miR-7-5p與miR-17-5p的表達(dá)及臨床意義

邰國梅，郭 京，王高仁

(南通市腫瘤醫(yī)院/南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療科，江蘇南通 226019)

放療是胸部腫瘤病人主要的治療方式之一。在胸部腫瘤放射治療期間，肺部的周圍組織無法避免的接受照射，發(fā)生炎癥反應(yīng)和促纖維化因子表達(dá)增強，引起放射性肺損傷（radiation-induced lung injury，RILI）。RILI 疾病的發(fā)展是一個變化的過程，大多從急性放射性肺炎的第一階段漸漸轉(zhuǎn)變?yōu)榈诙A段的放射性肺纖維化。目前，臨床上并無特效治療RILI 疾病的方法，嚴(yán)重者發(fā)生進(jìn)行性肺纖維化，肺功能逐步降低，最終會造成并發(fā)感染及呼吸衰竭而死亡[1]。因此，如何提前預(yù)防RILI 產(chǎn)生是成功治療胸部腫瘤的重點環(huán)節(jié)。但RILI 早期癥狀不具有特異性，缺乏特異性預(yù)測因子，導(dǎo)致患者常常錯過最佳治療期，不可避免進(jìn)入肺纖維化期[2]。因此，尋找早期預(yù)測發(fā)生的因子具有重要意義。臨床影像學(xué)上常常觀察到照射野外發(fā)生RILI 表現(xiàn)，輻射旁效應(yīng)是RILI 的重要機制[3]。外泌體是介導(dǎo)電離輻射旁效應(yīng)的一種可能機制，并且外泌體中的RNA 發(fā)揮著重要作用，但臨床真實環(huán)境下研究仍較少[4]。我們考慮靶區(qū)受照50Gy，達(dá)姑息放療劑量，故研究放療至靶區(qū)達(dá)到姑息劑量50Gy 時，血漿中外泌體miRNA 變化與≥3 級RILI 關(guān)系，評估外泌體miRNA 預(yù)測≥3 級RILI 的臨床價值，為減少≥3 級RILI 提供臨床參考方案。

1.材料與方法

1.1 研究對象 本研究發(fā)生RILI 的胸部放療患者80 例均來自南通市腫瘤醫(yī)院，于放療前及放療95%PTV（planning target volume，計劃靶面積）50Gy 時采集患者血漿備用。根據(jù)患者放療后發(fā)生RILI 嚴(yán)重程度分為≥3 級RILI 患者組16 例和<3 級RILI 患者組64 例，其中≥3 級RILI 組中男性10 例，女性6 例；年齡28～73 歲，平均年齡48.5±11.8 歲。<3 級RILI 患者組中男性40 例，女性24 例；年齡26～75 歲，平均年齡9.6±12.1 歲。兩組患者年齡、性別等資料具有可比性（P＞0.05）。

1.2 儀器與試劑 枸櫞酸抗凝采血管，離心機（美國貝克曼庫爾特公司）；移液槍，透視電鏡（德國蔡司公司）；電泳儀（美國伯樂公司）；實時定量PCR 儀（美國伯樂公司）；2g/dl 醋酸雙氧鈾染色液，Western blot 檢測試劑盒（美國伯樂公司），CD9，CD63，TSG101，Albumin 及GAPDH 抗體，二抗（美國艾博抗公司）；RNA 提取試劑盒（美國伯樂公司）；SDS-PAGE 凝膠（上海生工生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 血漿收集：收集胸部患者放療前、放療50Gy 新鮮全血20ml 置于枸櫞酸抗凝采血管，4℃1h 進(jìn)行凝固分層后，3 000 r/min 離心取上清轉(zhuǎn)至干凈的離心管中。然后12 000 r/min 4℃離心10min，取上清分裝到 1.5ml 離心管中，-80 ℃冰箱保存。

1.3.2 外泌體分離：將-80℃儲存的血漿在冰上融化，采用梯度離心法提取胸部放療患者放療前、放療50Gy 時患者血漿中的外泌體，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。外泌體鑒定：從-80℃冰箱取出已分離的外泌體樣本后置于冰盒中，溶解后稍離心，使用移液槍吸取15μl 的外泌體樣本于銅網(wǎng)上靜置1min。用鑷子夾取銅網(wǎng)，使用濾紙將銅網(wǎng)上的外泌體樣本吸干，然后使用移液槍吸取15μl 的2g/dl 醋酸雙氧鈾染色液室溫染色1min。將染色完成的樣本放于燈下干燥10min，在透視電鏡下觀察拍照，保存圖片。將外泌體樣本裂解后，將外泌體中的蛋白提取出來，通過Western blot 分別檢測患者放療前以及放療50Gy 時外泌體標(biāo)志蛋白CD9，CD63，TSG101 以及Albumin 的表達(dá)變化。

1.3.3 外泌體RNA 提取與RT-qPCR 檢測：提取≥3 級RILI 患者放療前及放療50Gy 時，以及<3 級RILI 患者相應(yīng)時間血漿外泌體中RNA做miRNA 芯片進(jìn)行鑒定，篩選外泌體中差異明顯miRNA 為觀察對象，對血漿外泌體 miR-7-5與miR-17-5p 和≥3 級RILI 進(jìn)行相關(guān)性研究；利用RT-qPCR 技術(shù)驗證miRNA 分子表達(dá)差異。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE）表達(dá)計量資料，使用 Prism6.0 軟件進(jìn)行兩組間分析，采用t檢驗。構(gòu)建受試者工作特性曲線（ROC 曲線）以評估m(xù)iR-7-5p 與miR-17-5p 測量值的敏感度和特異度，并比較其預(yù)測嚴(yán)重RILI 的價值。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分離的血漿外泌體鑒定 分別于胸部放療患者放療前以及放療50Gy 時采集患者血漿，提取血漿內(nèi)外泌體，通過透射電鏡觀察外泌體，見圖1。血漿外泌體為直徑約100 nm的雙層膜球形囊泡結(jié)構(gòu)，符合外泌體的特征，證明分離外泌體方法可以用于后續(xù)實驗。

圖1 電鏡鑒別外泌體形態(tài)

2.2 放療前及放療50Gy 后血漿外泌體標(biāo)志蛋白相對表達(dá)量變化 見表1。放療50Gy 后外泌體標(biāo)志蛋白CD9，CD63 和TSG101 表達(dá)較放療前明顯升高，而Albumin 較放療前明顯下降，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）。

表1 放療前及放療50Gy 后血漿外泌體標(biāo)志蛋白相對表達(dá)量變化（n=80，Mean±SE）

2.3 放療50Gy 后外泌體中miRNA 表達(dá)豐度對比見表2。放療50Gy 后兩組患者外泌體中miR-7-5p與miR-17-5p 表達(dá)豐度顯著升高，且≥3 級RILI組升高幅度高于<3 級RILI 患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

表2 放療50Gy 后外泌體中miRNA 表達(dá)豐度對比（Mean±SE）

2.4 ROC 分析外泌體miR-7-5p 與miR-17-5p 預(yù)測遠(yuǎn)期發(fā)生≥3 級RILI 價值 見圖2。圖2A 所示：miR-7-5p 的曲線下面積（AUC）為 0.705（95%置信區(qū)間：0.618～0.795），靈敏度和特異度分別為0.762 和0.681。圖2B 所示：miR-17-5p 的曲線下面積（AUC）為 0.683（95%置信區(qū)間：0.585～0.764），靈敏度和特異度分別為0.708 和0.715。

圖2 ROC 分析分泌體miR-7-5p 與miR-17-5p 預(yù)測遠(yuǎn)期發(fā)生≥3RILI 曲線圖

3 討論

放療是胸部惡性腫瘤重要治療手段，RILI 是胸部腫瘤放射治療較為常見的并發(fā)癥，該疾病是一個動態(tài)變化過程，若不能有效干預(yù)，極易從急性放射性肺炎階段轉(zhuǎn)變?yōu)榉派湫苑卫w維化階段。病人在肺部纖維化后會極大地影響其肺功能，造成其日常生活質(zhì)量大大下降；同時RILI 無效治療后會造成病人并發(fā)感染和呼吸衰竭，最終導(dǎo)致死亡[5]。臨床上，目前尚沒有特異性治療RILI 方法，因此，尋找有效地特異性篩查及早期預(yù)測放射性肺損傷發(fā)生的因子，并基于此調(diào)整治療，制定科學(xué)、合理的精準(zhǔn)治療手段，對高風(fēng)險的患者在放療前以及放療中進(jìn)行預(yù)防放射肺損傷處理，成為胸部腫瘤患者治療中發(fā)生RILI 的治療重點[6]。

臨床影像學(xué)上常常觀察到照射野外發(fā)生RILI表現(xiàn)，故我們推測輻射遠(yuǎn)隔效應(yīng)在肺放射性損傷中起重要作用。近年來研究表明電離輻射可影響和改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)物質(zhì)外泌體生成，通過輻射遠(yuǎn)隔效應(yīng)，產(chǎn)生多種不同的生物學(xué)效應(yīng)[7]。外泌體可廣泛而穩(wěn)定存在于體液中，系細(xì)胞間通訊交流的一種新發(fā)現(xiàn)途徑[8]。外泌體內(nèi)含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA，RNA以及miRNA 等多種物質(zhì)，另外，研究發(fā)現(xiàn)外泌體作為一種帶膜結(jié)構(gòu)，還能保護(hù)其中的miRNA 免受RNA 酶的降解，具有更穩(wěn)定、更高效的特性，可以向臨床提供一種獨特的、非創(chuàng)傷性、含相關(guān)大量寶貴生物學(xué)信息的動態(tài)標(biāo)本，可動態(tài)反映和監(jiān)測機體的生物狀態(tài)[9-10]。

miRNA 作為一種內(nèi)源性，包含19～23 個核苷酸結(jié)構(gòu)的小分子RNA，大多存在于真核生物細(xì)胞中，且具有很高的保守性。miR-7-5p 明顯抑制人支氣管上皮細(xì)胞BEP2D 的表皮生長因子受體（EGFR）表達(dá)，而且抑制AKT 和mTOR 的磷酸化，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生旁自噬效應(yīng)[11]。我們在本研究中發(fā)現(xiàn)放療50Gy 后外泌體標(biāo)志蛋白CD9，CD63 和TSG101 表達(dá)較放療前明顯升高，而Albumin 較放療前明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。HAO 等[12]研究發(fā)現(xiàn)小鼠腎臟缺血再灌注損傷和培養(yǎng)的腎小管細(xì)胞缺氧期間，miR-17-5p 明顯上調(diào)，其表達(dá)水平依賴于P53，在腎小管p53 基因敲除小鼠中，腎臟缺血再灌注損傷中的miR-17-5p 誘導(dǎo)作用減弱，支持p53 在體內(nèi)miR-17-5p 誘導(dǎo)作用，推測p53 -miR-17-5p -DR6 是腎臟缺血再灌注損傷中的一種新的保護(hù)途徑，可能是預(yù)防和治療缺血性急性腎臟損傷的靶點，可預(yù)測急性腎損傷。

在本研究中，我們胸部腫瘤患者放療前后血漿中分離并鑒定了外泌體，通過基因芯片分析，篩選出放療前、放療50Gy 差異明顯miR-7-5p 與miR-17-5p，兩組患者放療50Gy 后，miR-7-5p 與miR-17-5p 表達(dá)豐度顯著升高，且≥3 級RILI 組升高幅度高于<3 級RILI 患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。推測放療至50Gy 時出現(xiàn)miR-7-5p 與miR-17-5p 患者若按原計劃放療后，發(fā)生嚴(yán)重RILI幾率較高。此外，本研究發(fā)現(xiàn)血漿外泌體中miR-7-5p 與miR-17-5p 具有預(yù)測和診斷遠(yuǎn)期≥3 級RILI的臨床意義；臨床選擇95%PTV 50Gy/25f 時調(diào)整放療計劃，通過尋找到合適預(yù)測遠(yuǎn)期RILI 個體差異因子，基于此調(diào)整放療體積、照射劑量，對避免胸部腫瘤患者治療中發(fā)生嚴(yán)重RILI 具有重要意義。但是，還需要擴大樣本進(jìn)行多中心研究以確認(rèn)miR-7-5p 與miR-17-5p 在預(yù)測嚴(yán)重RILI 的臨床價值。

綜上所述，放療至50Gy，血漿外泌體中miR-7-5p 與miR-17-5p 高表達(dá)可能是預(yù)測與診斷嚴(yán)重RILI 的重要生物學(xué)標(biāo)志。