老年糖尿病腎病患者血清SP-D水平表達及其基因多態(tài)性與并發(fā)肺部感染的相關(guān)性研究

閆海燕，楊云秀，楊云華，宋曉偉，緱 劍

（1.咸陽市第一人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 陜西咸陽 712000；2.陜西唐華四棉醫(yī)院呼吸科，西安 710038；3.西安北車醫(yī)院內(nèi)科，西安 710085）

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是因糖尿病進展累及腎臟微血管引起的腎小球硬化癥，DN 也成為終末期腎病的主要原因[1]。目前認為，肺部感染是DN 常見并發(fā)癥。糖脂代謝紊亂是DN 的重要機制，DN 患者長期處于高血糖狀態(tài)，自身免疫防御能力降低，尤其是老年患者，全身機體功能衰退，更易發(fā)生肺部感染[2-3]。而肺部感染可進一步加重腎損傷。因而，長期以來，肺部感染一直是老年DN 患者防治重點。表面活性蛋白D(surfactant protein D，SP-D)是由Ⅱ型肺泡細胞和呼吸性細支氣管clara 細胞分泌的蛋白，既往研究證實SP-D 與慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)發(fā)病和病理進展密切相關(guān)，SP-D 與肺功能水平具有顯著相關(guān)性[4-5]。但有關(guān)SP-D 與DN 患者并發(fā)肺部感染的關(guān)系，國內(nèi)卻少有報道。本研究納入108 例老年DN患者作為研究對象，探討SP-D 在DN 并發(fā)肺部感染中的作用和臨床應(yīng)用價值。報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2018年4月～2020年10月咸陽市第一人民醫(yī)院108 例老年DN 患者作為研究對象，納入標(biāo)準(zhǔn)：①DN 診斷參照中華醫(yī)學(xué)會內(nèi)分泌學(xué)會推薦共識標(biāo)準(zhǔn)[6]；②患者臨床病例資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①并發(fā)原發(fā)性腎小球腎炎、腎盂腎炎及腎病綜合征患者；②并發(fā)有惡性腫瘤者；③并發(fā)有肺結(jié)核、支氣管炎及肺間質(zhì)性疾病者。根據(jù)是否并發(fā)肺部感染，將108 例DN 患者分為感染組(n=26，并發(fā)肺部感染)和對照組(n=82，未并發(fā)肺部感染)。感染組26 例患者中男性17 例，女性9例；年齡70.21±4.75 歲；體重指數(shù)20.29±1.81kg/m2；病程3.58±1.09年。對照組82 例患者中男性64 例，女性18 例；年齡69.53±4.47 歲；體重指數(shù)20.34±2.01kg/m2；病程3.60±0.84年。兩組患者基本資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。根據(jù)肺炎嚴(yán)重指數(shù)(pneumonia severity index，PSI)評分[7]，將感染患者分為輕度組(PSI 評分<91 分)，中度組(91≤PSI評分≤130分)及重度組(PSI評分>130分)。

1.2 儀器和試劑 博科BIOBASE TGL-18M 型離心機，ELISA 試劑盒(上海賽默科技生物發(fā)展有限公司)，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)(上海純優(yōu)生物科技有限公司)，細胞裂解液(南京信帆生物技術(shù)有限公司)，蛋白酶K(洛陽惠爾納米科技有限公司)，酚氯仿異戊醇、醋酸鈉(北京普博欣生物科技有限責(zé)任公司)。

1.3 方法 血清SP-D 檢測：在DN 確診后3 天內(nèi)取108 例患者清晨空腹肘靜脈血5ml，3 000r/min 離心10min后取上清液，采用ELISA法檢測血清SP-D水平。

DNA 提取：取確診后3 天內(nèi)空腹肘靜脈血3ml作為檢測標(biāo)本，將靜脈血置于含有EDTA 的抗凝管中，冷凍備用。提取DNA 步驟：①先將標(biāo)本解凍，以等量PBS 與之混勻，3 000r/min 離心10min，棄上清液，加入細胞裂解液300μl，混勻后37℃下水浴60min，再依次加入20g/dl 的SDS 液25μl 和蛋白酶K 20μl，水浴過夜。②取水浴后的細胞液，按3:1比例與酚氯仿異戊醇混勻，離心后取上清液，再次重復(fù)上述操作1 次。③取上清液400μl，再加入無水乙醇和醋酸鈉800μl 和15μl，沉淀DNA，再以8 000r/min 離心，棄上清液。④以70ml/dl 乙醇洗滌沉淀，再加入Tris-EDTA 液20μl，溶解后冷凍保存。

PCR-RFLP 檢測：采用PCR-RFLP 法檢測SP-D基因多態(tài)性，記錄SP-D 基因Metll Thr (rs721917 T/C)位點頻率分布情況，PCR 擴增條件：PCR 擴增引物：上游：5’-TCACCTCTCAGGCCATGCTGCTCTT CCTCC-3’，下游：5’-GAGCTACACATGACCAG GGTGCAAGCACTG-3’。反應(yīng)體系：15μl 2×PCR PLUS MIX，1.5μl DNA 模板，上下游引物各0.5μl，10×PCR 緩沖液2.5μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5min，94℃ 變性0.5min，58℃退火 1min，72℃延遲0.5min，40 個循環(huán)。72℃延遲5min。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 選用SPSS 24.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間行t檢驗，計數(shù)資料以[n(%)]表示，組間行χ2檢驗，預(yù)測價值采用受試者工作曲線(receiver operator characteristic，ROC)分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組SP-D 和基因位點分布 感染組血清SP-D水平為24.18±5.39ng/L，對照組血清SP-D 水平為20.02±4.54ng/L，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.888，P<0.001）。SP-D 基因型位點率分布差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組基因位點分布[n(%)]

2.2 不同肺炎程度患者SP-D 水平比較 26 例肺部感染患者中輕度14 例，中度8 例，重度4 例。輕度組患者血清SP-D 為 17.24±3.77 ng/L，中度組23.17±3.82 ng/L，重度組25.29±2.18 ng/L。三組患者血清SP-D水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=11.325，P<0.001)。

2.3 不同肺炎程度患者SP-D基因多態(tài)性分布 見表2。不同程度肺部感染患者SP-D基因型頻率分布比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.288，P<0.001)。

表2 不同肺炎程度患者SP-D 基因多態(tài)性分布

2.4 SP-D 判斷DN 伴發(fā)肺部感染的價值分析 見圖1。ROC 分析顯示血清SP-D 判斷DN 并發(fā)肺部感染的AUC 為0.779(SE=0.056，95%CI=0.669～0.890，P=0.000)，敏感度為0.769，特異度為0.598。

圖1 SP-D 判斷DN 伴發(fā)肺部感染的ROC 分析

3 討論

DN 伴發(fā)肺部感染的病理機制較為復(fù)雜。長期的高血糖不僅可形成酸性環(huán)境，直接破壞機體抵抗力，還可導(dǎo)致和加重肺組織缺氧，增加肺部感染的易感性[8]。另外，隨著DN 患者體液免疫失調(diào)，白細胞粘附作用減弱，為致病菌的滋生繁殖創(chuàng)造了條件[9]。SP-D 是具有維持肺泡表面活性物質(zhì)穩(wěn)定和保護肺組織局部免疫功能的親水性蛋白，基礎(chǔ)實驗顯示SP-D對中性粒細胞、單核-巨噬細胞具有趨化作用，還可通過抑制炎性因子合成，緩解肺部炎癥，而對于肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌等肺部常見病原菌，則具有與IgG 相近的作用，增強吞噬細胞活性，促進病原菌的吞噬[10-12]。本研究對比DN 并發(fā)肺部感染與未感染者血清SP-D 水平，也發(fā)現(xiàn)兩組間血清SP-D 差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示監(jiān)測SP-D 有助于判斷肺部感染風(fēng)險。而ROC 分析顯示血清SP-D 判斷DN 并發(fā)肺部感染的AUC 為0.779，這進一步證實SP-D 水平對預(yù)測肺部感染具有一定應(yīng)用價值，但血清SP-D 敏感度和特異度均有限。這可能與SP-D 基因多態(tài)性有關(guān)。

SP-D基因多態(tài)性與肺疾病的關(guān)系已被臨床報道。SP-D Metll Thr（rs721917 T/C）的多態(tài)性是目前臨床關(guān)注較多的SP-D 基因，徐麗等[13]認為rs721917 等位基因與間質(zhì)性肺炎相關(guān)，而ISHII 等[14]的一項研究發(fā)現(xiàn)rs721917C 可能增加COPD 易感性。rs721917位點不同基因型表達可影響其正常結(jié)構(gòu)和功能[15]，本研究發(fā)現(xiàn)感染組與對照組rs721917 位點基因型分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示SP-D 基因rs721719 位點多態(tài)性與DN 患者并發(fā)肺部感染的易感性有關(guān)。對于血清SP-D 升高的CC 基因型DN 患者，并發(fā)肺部感染的機率更高。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)不同肺炎程度患者血清SP-D 及其基因型表達也存在顯著性差異，提示SP-D 可能參與肺部感染的病理進展。隨著肺部感染的發(fā)生發(fā)展，肺泡毛細血管屏障功能受損，使SP-D 進入血液循環(huán)，進而使血清SP-D 水平升高[16]。因而，血清SP-D 可作為判斷肺部感染嚴(yán)重程度的判斷依據(jù)。而對于rs721917 位點CC 基因型患者，較其他位點，肺功能損傷程度更重[17]。本研究也顯示CC 基因型肺部感染病情更為嚴(yán)重，與上述報道結(jié)果一致。

綜上，血清SP-D 水平有助于判斷DN 并發(fā)肺部感染風(fēng)險，CC 基因型患者較其他基因型患者更易發(fā)生肺部感染，且病情較重。