冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者血清骨形態(tài)發(fā)生蛋白4，N1-甲基煙酰胺和血管生成素樣蛋白8水平檢測的臨床意義

關(guān)小明，陳 鍇，王文會

(佛山市中醫(yī)院 a.檢驗(yàn)科;b.內(nèi)科;c.心血管內(nèi)科 ,廣東佛山 528000)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病簡稱為冠心病（coronary heart disease，CHD），是心血管疾病中最常見的致死疾病。我國CHD 的患病數(shù)約1 100 萬，死亡率約為140/10 萬，并且發(fā)病率及患病率有不斷升高的趨勢，嚴(yán)重威脅我國人民的健康[1]。CHD常見的危險(xiǎn)因素包括高血壓、糖尿病、高血脂等，多種因素共同作用，損傷冠狀動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致動脈粥樣硬化的發(fā)生[2]。深入研究反映冠脈狹窄程度及病變程度的血清學(xué)指標(biāo)，有助于CHD 的早期診斷及治療效果的評估。血清骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（bone morphogenetic protein 4，BMP-4）屬于轉(zhuǎn)化生長因子β 家族成員，研究表明，BMP-4 不僅具有促進(jìn)成骨的功能，在調(diào)控胚胎分化發(fā)育、腫瘤發(fā)生發(fā)展及心血管疾病中均發(fā)揮重要的功能[3,4]。N1-甲基煙酰胺（N1-methylnicotinamide，me-Nam)是一種煙酰胺的代謝產(chǎn)物，煙酰胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶（nicotinamide N-methyltransferase，NNMT）可催化甲基從s-腺苷甲硫氨酸向煙酰胺的轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生me-Nam 和s-腺苷同型半胱氨酸。研究顯示，人類血清me-Nam 活性增加與肥胖、糖尿病及CHD 有關(guān)，由于肥胖和糖尿病是CHD 發(fā)展的危險(xiǎn)因素，因此血清me-Nam 水平升高可能參與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[5]。血管生成素樣蛋白8（angiopoietin like 8，ANGPTL8）編碼基因位于19p13.2，是一種由肝臟分泌的促炎因子，在CHD 等心血管疾病中存在ANGPTL8 表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象，其可通過抑制脂蛋白脂肪酶的活性促進(jìn)動脈粥樣硬化的進(jìn)展[6]。但目前三者在CHD 中的表達(dá)情況及臨床意義尚不清楚，本研究通過檢測CHD 患者血清BMP-4，me-Nam 及ANGPTL8 水平，初步分析三者與血脂、炎癥因子及冠脈病變的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 研究對象 選取2018年1月～2020年1月佛山市中醫(yī)院收治的86 例CHD 患者為CHD 組。其中，男性53 例、女性33 例，平均年齡為53.61±5.63歲，平均體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）為25.72±3.15kg/m2，并發(fā)高血壓史55 例，并發(fā)糖尿病史52 例，并發(fā)吸煙史33 例。CHD 組根據(jù)冠狀動脈的狹窄程度和冠脈病變支數(shù)分為三個(gè)亞組，其中單支病變組（主要?jiǎng)用}有一支狹窄程度≥50%）25 例，兩支病變組（主要?jiǎng)用}有兩支狹窄程度≥50%）39 例及三支病變組（主要?jiǎng)用}有三支狹窄程度≥50%）22 例；CHD 組中穩(wěn)定性冠心病21例、急性冠脈綜合征（ACS）65 例，其中急性冠脈綜合癥（acute coronary syndromes, ACS）中包括不穩(wěn)定型心絞痛47 例和急性心肌梗死18 例。此外，以同期我院健康查體的60例受試者為對照組，其中，男性32 例、女性28 例，平均年齡為54.93±5.30 歲，平均BMI 為24.93±4.21kg/m2，并發(fā)高血壓史28 例，并發(fā)糖尿病史23 例，并發(fā)吸煙史30 例。CHD 組與對照組在年齡、性別、BMI，吸煙史之間相比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）。

CHD 組納入標(biāo)準(zhǔn)：①CHD 的診斷結(jié)合患者的臨床癥狀、心肌酶學(xué)檢查、冠狀動脈造影等檢查，符合心血管病學(xué)分會介入心臟病學(xué)組制定的CHD診斷標(biāo)準(zhǔn)，即冠狀動脈15 個(gè)不同節(jié)段中至少一個(gè)節(jié)段的管腔狹窄程度≥20%[7]；②CHD 患者及其家屬對本研究知情同意并簽字；③半年內(nèi)無創(chuàng)傷手術(shù)史、心臟疾病治療史等；④受試者簽署知情同意協(xié)議。排除標(biāo)準(zhǔn)：①并發(fā)其他器官惡性腫瘤；②并發(fā)急慢性感染性疾病、自身免疫性疾??；③近一個(gè)月有糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑的用藥史。

對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①既往無CHD 癥狀及CHD病史；②半年內(nèi)無創(chuàng)傷手術(shù)史、心臟疾病治療史等。排除標(biāo)準(zhǔn)：并發(fā)其他器官惡性腫瘤、急慢性感染性疾病、自身免疫性疾??；③近期有糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑的用藥史。

1.2 儀器和試劑 BMP-4，me-Nam 和ANGPTL8檢測試劑盒均購自上海穎心生物科技公司（貨號YX80322B，YX80061B 及TX21792）；Beckman Coulter AU5800 全自動生化分析儀及配套試劑盒檢測血生化指標(biāo)。

1.3 方法

1.3.1 檢驗(yàn)方法:患者于治療前、體檢者于體檢當(dāng)日取清晨空腹靜脈血5ml，以3 000r/min 離心10min，離心半徑10cm，取上層血清置于凍存管中，并于-20℃保存，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測所有研究對象血清中的BMP-4，me-Nam 和ANGPTL8 水平，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。應(yīng)用氧化酶法檢測總膽固醇（total cholesterol，TC），三酰甘油（triacylglycerol，TG）水平；應(yīng)用酶法檢測高密度脂蛋白（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C），低密度脂蛋白（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平；應(yīng)用乳膠凝集反應(yīng)法檢測超敏C 反應(yīng)蛋白（high sensitivity C reactive protein，hs-CRP）水平，白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6），腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平檢測采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。

1.3.2 冠狀動脈狹窄程度評價(jià)方法:所有患者進(jìn)行冠狀動脈造影檢查，檢查成功后采用Gensini 積分系統(tǒng)對冠狀動脈狹窄程度進(jìn)行評價(jià)[7]，Gensini 積分=Gensini 評分×各段系數(shù)。根據(jù)Gensini 積分將CHD 組患者進(jìn)行分組，Ⅰ組（4～8 分）14 例，Ⅱ組（9～12 分）24 例，Ⅲ組（13～33 分）27 例，Ⅳ組（34 分及以上）21 例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS23.0 進(jìn)行研究資料分析。觀測資料中的計(jì)量數(shù)據(jù)，均通過正態(tài)性檢驗(yàn)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述。兩組間的比較為成組t檢驗(yàn)或校正t檢驗(yàn)（統(tǒng)計(jì)量為t）。多組間的比較為單因素方差分析（統(tǒng)計(jì)量為F）+兩兩比較HSD-q檢驗(yàn)（統(tǒng)計(jì)量HSD-q）。趨勢檢驗(yàn)為兩分類轉(zhuǎn)化后的Cochran Armitage 趨勢檢驗(yàn)（統(tǒng)計(jì)量為Cochran Armitage 趨勢χ2）。此外，相關(guān)分析為Pearson 相關(guān)檢驗(yàn)，ROC 曲線分析血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 及聯(lián)合檢測對CHD 組患者的診斷價(jià)值。統(tǒng)計(jì)推斷的檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 CHD 組與對照組血脂及炎癥因子水平比較見表1。與對照組相比，CHD 組患者TC，TG，LDL-C，IL-6，TNF-α 及hs-CRP 明顯較高，HDL-C明顯較低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。

表1 CHD 組與對照組血脂及炎癥因子水平比較（±s）

表1 CHD 組與對照組血脂及炎癥因子水平比較（±s）

項(xiàng) 目CHD 組(n=86)對照組(n=60)t 值P 值TC（mmol/L）6.73±0.864.30±0.7217.9330.000 TG（mmol/L）1.51±0.341.03±0.269.6560.000 LDL-C（mmol/L）4.82±0.812.53±0.7017.7530.000 HDL-C（mmol/L）0.96±0.411.32±0.325.9500.000 IL-6 (pg/ml)8.18±2.212.73±0.7318.3980.000 TNF-α(pg/ml)9.24±2.534.52±0.4014.3120.000 hs-CRP（mg/L）1.87±0.350.71±0.1328.0840.000

2.2 血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 及Gensini積分對比 見表2，表3。與對照組相比，CHD 組患者血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 水平明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。三支病變組患者血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8，Gensini 積分明顯高于單支及雙支病變組患者，雙支病變組患者血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8，Gensini 積分高于單支病變組患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表2 CHD 組與對照組血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 及Gensini 積分對比（±s）

表2 CHD 組與對照組血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 及Gensini 積分對比（±s）

項(xiàng) 目對照組（n=60）CHD 組（n=86）t 值P 值BMP-4（μg/L）3.12±1.276.67±1.7514.201 0.000 me-Nam（ng/ml）5.21±1.439.74±2.6013.495 0.000 ANGPTL8（μg/L） 150.33±29.63 502.12±79.34 37.538 0.000 Gensini 積分-32.73±6.10--

表3 不同狹窄程度組血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 及Gensini 積分對比（±s）

表3 不同狹窄程度組血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 及Gensini 積分對比（±s）

注：*與對照組相比，P<0.05；#與單支病變組相比，P<0.05；&與雙支病變組相比，P<0.05。

指標(biāo)對照組（n=60）單支病變組（n=25）雙支病變組（n=39）三支病變組（n=22）差異分析趨勢分析FPχ2P BMP-4（μg/L）3.12±1.275.18±1.35*6.24±1.57*#9.13±2.14*#&93.6960.00080.9760.000 me-Na(ng/ml）5.21±1.438.31±2.71*9.79±2.50*#11.30±2.83*#&55.5150.00075.6880.000 ANGPTL8(μg/L）150.33±29.63468.94±84.72*503.34±75.81*#537.66±81.94*#&359.2590.000108.6410.000 Gensini 積分-25.73±7.1334.73±6.11#37.14±8.05#&--

2.3 不同冠狀動脈狹窄程度的血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 水平比較 見表4。隨著Gensini積分升高，CHD 患者的血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 有逐漸升高的趨勢（均P＜0.05）。

表4 不同冠狀動脈狹窄程度的血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 水平比較（±s）

表4 不同冠狀動脈狹窄程度的血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 水平比較（±s）

注：*與Ⅰ組比較，P ＜0.05；#與Ⅱ組比較，P ＜0.05，&與Ⅲ組比較，P ＜0.05。

指標(biāo)Ⅰ組（n=14）Ⅱ組（n=24）Ⅲ組（n=27）Ⅳ組（n=21）差異分析趨勢分析FPχ2P BMP-4(μg/L）5.25±1.036.04±1.13*6.81±1.11*#8.16±1.14*#&22.7920.00026.6820.000 me-Nam(ng/ml）7.22±1.828.73±1.97*10.09±2.03*#12.09±2.19*#&18.9280.00018.9550.000 ANGPTL8(μg/L)343.01±89.06420.54±74.75*564.57±79.12*#623.46±80.85*#&48.3340.00049.2520.000

2.4 CHD 患者血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8水平與血脂、炎癥因子和Gensini 積分的相關(guān)性 見表5。CHD 組患者血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 表達(dá)與Gensini 積分, TC, TG, LDL-C, IL-6, TNF-α 及hs-CRP 呈正相關(guān)，與HDL-C 呈負(fù)相關(guān)（均P<0.05）。

表5 CHD 患者血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 水平與血脂、炎癥因子和Gensini 積分的相關(guān)性

2.5 CHD 患者血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8表達(dá)的相關(guān)性 Pearson 線性相關(guān)分析結(jié)果CHD患者血清BMP-4 表達(dá)與me-Nam，ANGPTL8 表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=0.567，0.610，P=0.000，0.000），me-Nam 與ANGPTL8 的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=0.562，P=0.000）。

2.6 血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 及聯(lián)合檢測對CHD 的診斷價(jià)值 見圖1。血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 及聯(lián)合檢測的敏感度分別為70.3%，75.3%，78.6% 及87.3%，特異度分別為63.1%，72.2%，70.9%及62.4%。ROC 曲線分析顯示，血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 及聯(lián)合檢測的曲線下面積分別為0.707（95%CI:0.601～0.812），0.713（95%CI:0.612～0.833），0.759（95%CI:0.667～0.850）及0.847（95%CI:0.722～0.908），聯(lián)合診斷的診斷效能大于任一單一指標(biāo)的診斷效能。

圖1 血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 及聯(lián)合檢測對CHD 的診斷價(jià)值

3 討論

CHD 是嚴(yán)重威脅人類健康的心血管疾病，近年來隨著我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平的提高及人口老齡化的加劇，其發(fā)病率不斷升高[8]。病理上，CHD 主要表現(xiàn)為動脈粥樣硬化及粥樣硬化斑塊的形成，伴有血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷、單核巨噬細(xì)胞的浸潤及泡沫細(xì)胞的形成。CHD 的發(fā)生和促炎與抗炎系統(tǒng)平衡失調(diào)有關(guān)，涉及血清白介素、基質(zhì)金屬蛋白酶等多種炎癥及炎癥因子的異常改變，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、血管膠原蛋白的降解，促進(jìn)CHD 的發(fā)生發(fā)展[9]。因此，有必要尋找反映CHD 病情嚴(yán)重程度的血清標(biāo)志物，探討其在CHD 發(fā)病中的作用，為CHD 的早期診斷、風(fēng)險(xiǎn)評估及治療提供新的思路。

BMP-4 是骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族成員，主要在脈管系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，近年來研究發(fā)現(xiàn)，BMP-4 是血管穩(wěn)態(tài)和疾病的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，BMP-4 能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化的作用，并導(dǎo)致一氧化氮依賴性血管舒張受損，引起內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[10]。本研究中，CHD 組患者血清BMP-4 水平較對照組人群均明顯升高，提示BMP-4 可能參與促進(jìn)CHD 的發(fā)生發(fā)展。此外，CHD 患者冠狀動脈狹窄程度越重或病變支數(shù)越多，血清BMP-4 水平越高。SUCOSKY等[11]學(xué)者報(bào)道，CHD 時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞處于氧化應(yīng)激的狀態(tài)，大量活性氧誘導(dǎo)BMP-4 的表達(dá)上調(diào)，BMP-4 作為一種促炎因子，能夠結(jié)合白細(xì)胞表面的細(xì)胞間黏附分子1，促進(jìn)白細(xì)胞的的黏附、聚集及活化，加重冠脈的病變程度，促進(jìn)CHD 的病變進(jìn)展。本研究中，BMP-4 與血脂相關(guān)指標(biāo)TC，TG，LDL-C 及炎癥因子IL-6，TNF-α 及hs-CRP 呈正相關(guān)，與HDL-C 呈負(fù)相關(guān)，表明BMP-4 還可能參與CHD 中脂質(zhì)代謝的生物學(xué)過程。目前BMP-4 對脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)的機(jī)制尚不清楚，WEI等[12]學(xué)者發(fā)現(xiàn)，BMP-4 能夠誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞向成熟的脂肪細(xì)胞進(jìn)行分化，發(fā)生CHD 時(shí)BMP-4 可能通過結(jié)合細(xì)胞表面的BMPR-IA 受體，激活下游信號通路，促進(jìn)冠狀動脈脂質(zhì)浸潤和內(nèi)皮損傷，導(dǎo)致CHD 的病變進(jìn)展。

me-Nam 作為一種反映尼克酰胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶（NNMT）活性的血清學(xué)指標(biāo)，主要在脂肪組織和肝臟中高表達(dá)，在其他器官組織中低表達(dá)。研究表明，肥胖癥和2 型糖尿病小鼠和人類的NNMT活性增加，而肥胖和糖尿病是CHD 疾病發(fā)生發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素[13-14]。因此，可以推測CHD 患者血清me-Nam 水平可能影響CHD 的疾病進(jìn)展。本研究中，CHD 患者冠狀動脈狹窄程度越重或病變支數(shù)越多，血清me-Nam水平越高。MATEUSZUK等[15]研究證明，me-Nam 具有改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，抑制血小板活化和抑制炎癥的作用，并且在載脂蛋白E/LDL 雙敲除小鼠中顯示出抗動脈粥樣硬化作用。DOMAGALA 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，me-Nam 能通過增加內(nèi)皮細(xì)胞中內(nèi)皮型一氧化氮合酶介導(dǎo)的一氧化氮的釋放來改善內(nèi)皮功能障礙。因此，CHD 患者中血清me-Nam水平的增加可能作為一種防御反應(yīng)，me-Nam 通過改善血管內(nèi)皮功能障礙增加適應(yīng)動脈粥樣硬化的能力，導(dǎo)致動脈粥樣硬化的程度不斷加重。此外，me-Nam 水平與TC，TG，LDL-C，IL-6，TNF-α 及hs-CRP 呈正相關(guān)，與HDL-C 呈負(fù)相關(guān)，表明me-Nam 與CHD 中脂質(zhì)代謝及炎癥途徑關(guān)系密切。PISSIOS 等[17]發(fā)現(xiàn)，me-Nam 通過抑制活性氧的產(chǎn)生而具有抗炎特性和抗血栓的特性，對動脈粥樣硬化中內(nèi)源性me-Nam 通路的激活能夠抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生，因此CHD 中血清me-Nam表達(dá)升高可能作為一種炎癥反應(yīng)補(bǔ)償機(jī)制，增強(qiáng)機(jī)體抗炎能力。

ANGPTL8 主要表達(dá)于肝臟及脂肪組織中，結(jié)構(gòu)上缺乏C 端的纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域，在N 端與ANGPTL3 和ANGPTL4 具有共同的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域。研究表明，ANGPTL8 參與炎癥調(diào)節(jié)、脂肪代謝、葡萄糖代謝及動脈粥樣硬化等病理生理過程，并影響疾病的發(fā)生發(fā)展，可能是反映病情的重要標(biāo)志物[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，CHD 組患者血清ANGPTL8水平高于對照組，且血清ANGPTL8 水平與冠狀動脈的狹窄程度、病變支數(shù)有關(guān)，可能是ANGPTL8能促進(jìn)膽固醇吸收的主要受體巨噬細(xì)胞清除受體1的表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞中膽固醇的攝取并抑制膽固醇外排，促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成[19]。尚有研究發(fā)現(xiàn)，ANGPTL8 能夠通過增加血漿TG 水平，促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)生[20]。本臨床研究亦證實(shí)，CHD 組患者血清ANGPTL8 表達(dá)與血脂相關(guān)指標(biāo)TC，TG，LDL-C 呈正相關(guān)，與HDL-C 呈負(fù)相關(guān)。因此，血清ANGPTL8 的高表達(dá)參與CHD 患者機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)代謝的病理生理學(xué)過程，但具體機(jī)制有待深入研究。

本研究分析CHD 患者血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 水平的相關(guān)性，結(jié)果三者之間存在顯著正相關(guān)，三者之間的相互關(guān)系目前尚不清楚，結(jié)合本研究，三者可能通過參與調(diào)節(jié)慢性炎癥因子的產(chǎn)生，影響脂質(zhì)代謝的生物學(xué)過程，導(dǎo)致CHD 病情的發(fā)生發(fā)展。本研究進(jìn)一步分析三者對CHD 的診斷價(jià)值，結(jié)果聯(lián)合檢測對CHD 的診斷效能明顯升高，表明聯(lián)合檢測可能有助于CHD 的早期診斷，值得臨床深入探索。

綜上所述，血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8水平在CHD 患者中表達(dá)升高，冠狀動脈狹窄程度越重或病變支數(shù)越多，其水平越高，且三者與CHD 患者血脂、炎癥因子有關(guān)，檢測其水平可為CHD 病情評估提供一定參考。