原發(fā)性舍格倫綜合征患者血漿弗林蛋白酶和Th1型細(xì)胞因子水平表達(dá)與唇腺損害及相關(guān)腺體功能的關(guān)系研究

岳曉琳，米曉燕，白圓圓，周紅敏

（邯鄲市中心醫(yī)院免疫科 河北邯鄲 056000）

原發(fā)性舍格倫綜合征（primary Sjogren’s syndrome，pSS）是一種自身免疫性疾病，在全球患病率約為0.05%～4.80%，在我國患病率約為0.77%[1]。該病主要癥狀為口眼干燥，部分患者伴有關(guān)節(jié)疼痛、血液系統(tǒng)損害、腮腺腫大等表現(xiàn)，多數(shù)病人發(fā)病隱匿，癥狀進(jìn)展緩慢，部分患者確診時，內(nèi)分泌腺已嚴(yán)重受損[2]。研究表明，pSS 發(fā)病是多種因素綜合作用的結(jié)果，如感染因素、免疫紊亂、遺傳因素等，但具體作用機(jī)制尚不明確[3]。近年來，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，輔助性T 細(xì)胞1（helper T cell 1，Th1）型與pSS 發(fā)病有關(guān)，Th1 型細(xì)胞可產(chǎn)生多種致炎因子，這些因子能促進(jìn)B 細(xì)胞活化，參與pSS 發(fā)生與進(jìn)展[4]。而患者的腺體在炎癥作用下，可能引起不可逆性的腺泡損害與腺體功能破壞，影響腺體功能[5]。另有研究認(rèn)為，弗林蛋白酶（FURIN）對外周免疫耐受性有調(diào)節(jié)作用，其在Th1 型淋巴細(xì)胞中呈過表達(dá)[6]?；谏鲜霰尘埃狙芯繑M分析pSS 患者血漿FURIN和Th1 及Th2 型細(xì)胞因子水平與唇腺損害及相關(guān)腺體功能指標(biāo)的關(guān)系，進(jìn)一步明確pSS 發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對象 納入邯鄲市中心醫(yī)院2017年8月～2019年8月收治的pSS 患者109 例作為pSS 組，臨床表現(xiàn)：口干62 例，眼干46 例，關(guān)節(jié)疼痛35 例，呼吸困難21 例，咳嗽38 例。其中男性44 例，女性65 例，年齡30～58 歲，平均年齡46.54±8.36 歲；體質(zhì)量指數(shù)19～24kg/m2，平均22.29±1.43kg/m2；抗SSA 抗體：陽性85 例，陰性24 例；抗SSB 抗體：陽性69 例，陰性40 例。選取同期于邯鄲市中心醫(yī)院體檢的健康體檢者90 例作為對照組。其中男性38 例，女性52 例，年齡32～59 歲，平均年齡47.10±9.03 歲；體質(zhì)量指數(shù)18～24 kg/m2，平均22.65±1.32kg/m2。兩組基線資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①pSS 組：滿足pSS 的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；首次入院就診；在治療前配合完成相關(guān)檢查；認(rèn)知功能、精神狀態(tài)正常；簽署知情同意書。②對照組：身體健康狀況較好；性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)與pSS 組匹配；認(rèn)知功能、精神狀態(tài)正常；知情同意。

排除標(biāo)準(zhǔn)：患其他自身免疫性疾病者；惡性腫瘤者；因血管性假血友病、白細(xì)胞減少癥、骨髓增生異常綜合癥等其他疾病引起的血液系統(tǒng)癥狀者；糖尿病患者；慢性病毒感染者。研究方案獲邯鄲市中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 儀器與試劑 主要儀器為酶標(biāo)分析儀（山東競道光電科技有限公司，JD-SY96S），主要試劑為人FURIN 酶聯(lián)免疫吸附（簡稱酶免）檢測試劑，血清白介素（interleukin，IL）-2，IL-7，γ 干擾素（interferon-γ，INF-γ）酶免試劑，均由上海臻科生物科技有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 血漿、血清指標(biāo)檢測：所有受試者在治療前或體檢當(dāng)日行各指標(biāo)檢測，采集4ml 空腹靜脈血，分裝于兩管。將其中一管血樣行抗凝處理，3 000r/min 離心20min，離心半徑10cm，分離血漿，存放至-70℃冰箱備用，經(jīng)酶免法測定血漿FURIN 水平。另一管血樣無需行抗凝處理，離心20min，轉(zhuǎn)速、離心半徑同上，分離血清，保存方法同上，經(jīng)酶免法測定血清IL-2，IL-7，INF-γ，IL-4 和IL-13 水平。酶免檢測基本方法如下：根據(jù)指標(biāo)選擇以血漿或血清為待測樣本，常規(guī)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測樣品孔、空白孔，依次加入100μl 標(biāo)準(zhǔn)品溶液、稀釋緩沖液，其中空白孔僅加稀釋緩沖液，充分混合，封孔，在37℃下反應(yīng)2h。洗板4 次，取稀釋緩沖液1ml 將檢測抗體稀釋，充分混合，取已稀釋抗體100μl 加入各孔，封孔，在37℃下反應(yīng)1h。洗板4 次，取生物素抗體1ml 加稀釋緩沖液9ml，充分混合，取已稀釋生物素抗體100μl 加入，封孔，在37℃下反應(yīng)30min。洗板4 次，取TMB 底物100μl 加入，封孔，在37℃下反應(yīng)10min，取終止液100μl 加入，在主波長450nm 處檢測吸光度值。以INF-γ/IL-4比值表示Th1/Th2 比值。

1.3.2 唇腺損害及相關(guān)腺體功能指標(biāo)檢測:經(jīng)涎棉棒法測定唾液流率，觀察15min 的唾液分泌量，并據(jù)此明確單位時間內(nèi)的分泌量。唇腺病理分級[8]：若唇腺組織4mm2范圍內(nèi)的淋巴結(jié)細(xì)胞數(shù)量≥50 個，則提示1 灶，未見淋巴細(xì)胞浸潤提示0 級；輕度浸潤提示1 級；中度浸潤，但未達(dá)1 灶標(biāo)準(zhǔn)提示2 級；達(dá)1灶標(biāo)準(zhǔn)提示3級；＞1灶即4級，分別賦1，2，3，4，5 分，便于比較。Schirmer 試驗(yàn)：在檢測前3min 行麻醉，取受檢者下眼瞼部位，將Schirmer 試紙懸掛在該處，在5min 后測定試紙淚液濕潤長度，待檢測完畢，立即將試紙放置在無菌試管中，經(jīng)鹽酸緩沖液給予稀釋。

1.3.3 疾病嚴(yán)重程度評估：利用歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟舍格倫綜合征疾病活動指數(shù)（European league against rheumatism sjgren’s syndrome disease activity index，ESSDAI）評估pSS 嚴(yán)重程度。ESSDAI 評價[9]包括12個項(xiàng)目：如皮膚病變、全身癥狀、關(guān)節(jié)病變等，每項(xiàng)計(jì)0～3 分，總分范圍0～36 分。其中總分≤12分為輕度組（n=37），13～24 分為中度組（n=48），≥25 分為重度組（n=24）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 經(jīng)SPSS20.0 軟件行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用百分比（%）表示，行χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，三組間比較行方差分析，經(jīng)Pearson線性相關(guān)分析患者血漿FURIN 和Th1 及Th2 型細(xì)胞因子水平、唇腺損害及相關(guān)腺體功能指標(biāo)的相關(guān)性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血漿FURIN 及血清Th1，Th2 型細(xì)胞因子水平比較 見表1。pSS 組血漿FURIN 及血清IL-2，IL-7，INF-γ，IL-4和IL-13水平均高于對照組，而Th1/Th2 低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表1 兩組血漿FURIN 及血清Th1，Th2 型細(xì)胞因子水平比較（±s）

表1 兩組血漿FURIN 及血清Th1，Th2 型細(xì)胞因子水平比較（±s）

指標(biāo)pSS 組（n=109）對照組（n=90）tP FURIN（pg/ml）7 534.62±198.631 412.54±323.25156.8750.000 IL-2（pg/ml）2.34±0.871.25±0.3212.1250.000 IL-7（pg/ml）38.15±7.7524.42±5.9914.0890.000 INF-γ（pg/ml）2.91±0.872.15±0.428.0540.000 IL-4（pg/ml）3.39±1.122.10±0.849.0280.000 IL-13（pg/ml）43.29±8.5430.13±5.5312.5970.000 Th1/Th20.86±0.251.02±0.373.6240.000

2.2 不同pSS 嚴(yán)重程度患者的血液指標(biāo)和唇腺損害及相關(guān)腺體功能指標(biāo)比較 見表2。整體比較知：各指標(biāo)整體差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各指標(biāo)水平隨pSS 嚴(yán)重程度的變化趨勢有顯著性意義（P＜0.05）。多重比較并結(jié)合主要數(shù)據(jù)分析：中、重度組血漿FURIN 及血清IL-2，IL-7，INF-γ，IL-4，IL-13 水平、唇腺病理評分高于輕度組（t中vs輕=13.491，7.559，7.783，13.540，19.272，5.339，13.502；t重vs輕=19.600，16.414，8.763，19.734，36.092，11.192，23.032，均P＜0.05），且重度組高于中度組（t=13.707，6.403，4.710，4.240，12.280，6.917，6.457，均P＜0.05），而中、重度組Th1/Th2，唾液流率及左、右眼Schirmer 試紙浸濕長度低于輕度組（t中vs輕=7.548，3.013，14.134，24.229；t重vs輕=8.115，6.803，33.086，42.715，均P＜0.05），且重度組低于中度組（t=3.178，8.000，18.043，18.641，均P＜0.05）。

表2 不同pSS 嚴(yán)重程度患者的血液指標(biāo)和唇腺損害及相關(guān)腺體功能指標(biāo)比較（±s）

表2 不同pSS 嚴(yán)重程度患者的血液指標(biāo)和唇腺損害及相關(guān)腺體功能指標(biāo)比較（±s）

注：差異分析的整體比較為單因素方差分析。多重比較為LSD-t 檢驗(yàn)，顯著性標(biāo)記a,b 分別為和輕、中度組相比P ＜0.05。趨勢檢驗(yàn)為兩分類轉(zhuǎn)化后的Cochran Armitage 趨勢檢驗(yàn)。兩分類轉(zhuǎn)化界值為對應(yīng)指標(biāo)的3 組總均值，統(tǒng)計(jì)賦值：≥總均值為1，＜總均值為0。

指標(biāo)輕度組（n=37）中度組（n=48）重度組（n=24）差異檢驗(yàn)趨勢檢驗(yàn)F P χ2P FURIN（pg/ml）7 417.31±56.377 551.91±35.20a7 680.89±42.19ab218.9040.00065.2580.000 IL-2（pg/ml）1.89±0.262.42±0.36a2.93±0.21ab87.8250.00061.5030.000 IL-7（pg/ml）34.63±2.1337.72±1.53a40.06±2.69ab54.7060.00026.0760.000 INF-γ（pg/ml）2.41±0.113.07±0.28a3.36±0.26ab158.2300.00064.5820.000 IL-4（pg/ml）2.48±0.233.60±0.29a4.37±0.14ab468.8920.00060.4150.000 IL-13（pg/ml）39.84±3.2543.48±3.01a48.23±2.11ab59.9620.00022.9410.000 Th1/Th20.97±0.040.85±0.09a0.76±0.15ab37.6790.0009.1560.000唾液流率（ml/min）0.08±0.020.07±0.01a0.05±0.01ab33.5760.00029.0200.000唇腺病理評分（分）2.76±0.203.61±0.34a4.12±0.26ab187.1930.00065.9840.000 Schirmer 試紙浸濕長度（mm）左眼7.00±0.465.56±0.47a3.78±0.15ab428.8760.00060.8220.000右眼7.22±0.335.41±0.35a3.95±0.22ab786.7390.00067.5960.000

2.3 抗SSA 抗體、抗SSB 抗體與血漿FURIN 及血清Th1，Th2 型細(xì)胞因子的關(guān)系 見表3?？筍SA抗體、抗SSB 抗體陽性患者的血漿FURIN 水平及血清IL-2，IL-7，INF-γ，IL-4，IL-13 水平高于陰性患者，Th1/Th2 低于陰性患者（P＜0.05）。

表3 抗SSA 抗體、抗SSB 抗體與血漿FURIN 及血清Th1，Th2 型細(xì)胞因子的關(guān)系

2.4 血漿FURIN 和Th1 及Th2 型細(xì)胞因子水平、唇腺損害及相關(guān)腺體功能指標(biāo)的相關(guān)性 見表4。經(jīng)Pearson 線性相關(guān)分析提示，血漿FURIN 水平與血清IL-2，IL-7，INF-γ，IL-4，IL-13 水平及唇腺病理評分呈正相關(guān)（r=0.362，0.511，0.511，0.640，0.632，0.515，均P<0.05)，與Th1/Th2，唾液流率及左、右眼Schirmer 試紙浸濕長度呈負(fù)相關(guān)（r=－0.715，－0.404，－0.413，－0.505，均P＜0.05）。

3 討論

pSS 可導(dǎo)致多個系統(tǒng)受累，女性患者多于男性，這主要與性激素水平有關(guān)，性激素失衡在女性群體中較常見，其能對腺泡細(xì)胞凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)，靶細(xì)胞變化可以導(dǎo)致自身侵占的炎癥反應(yīng)加速，引起外分泌腺炎，促進(jìn)pSS 發(fā)生[10]。該病能引起眼部、口腔癥狀，病程長，治療難度大，復(fù)發(fā)率高[11]。臨床進(jìn)一步明確pSS 的發(fā)病機(jī)制，對改善預(yù)后而言至關(guān)重要，但該病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床尚未完全明確。目前，研究指出，F(xiàn)URIN 在多種疾病進(jìn)展中存在重要作用，其可能通過對蛋白代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)，參與自身免疫性疾病進(jìn)展[12]。pSS 作為自身免疫性疾病的一種類型，其病情進(jìn)展可能與FURIN 表達(dá)有關(guān)，但有待臨床證實(shí)。

FURIN 的作用底物包括血清蛋白酶、神經(jīng)肽等，具有重要生物功能，在多種疾病評估中有所應(yīng)用，劉恒等[13]發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者病灶組織內(nèi)的FURIN 水平顯著上調(diào)，其能促進(jìn)新生血管形成，增加癌細(xì)胞增殖風(fēng)險(xiǎn)。汪洋等[14]認(rèn)為，F(xiàn)URIN 參與了神經(jīng)精神病的進(jìn)展，如精神分裂、老年癡呆、癲癇等，其主要通過調(diào)節(jié)肽類激素、生長因子等發(fā)揮作用。本結(jié)果顯示，pSS 患者的血漿FURIN 水平較健康者明顯升高。FURIN 能促進(jìn)唾液內(nèi)B 細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤過度激活，導(dǎo)致多克隆抗SSA 抗體、抗SSB 抗體產(chǎn)生，其還能對細(xì)菌毒素進(jìn)入細(xì)胞進(jìn)行介導(dǎo)，通過細(xì)菌毒素發(fā)揮致病作用[15]。有學(xué)者[16]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)URIN 在其他自身免疫性疾病發(fā)生中也有參與，例如重組FURIN 對IL-7，IL-1α 釋放有促進(jìn)作用，導(dǎo)致患者炎癥加重，從而加重病情，此外，該研究還發(fā)現(xiàn)，炎癥因子活化能對FURIN 表達(dá)進(jìn)行誘導(dǎo)，進(jìn)一步證實(shí)其表達(dá)與炎癥因子密切相關(guān)。本研究則發(fā)現(xiàn)，pSS 患者的血清IL-2，IL-7，INF-γ，IL-40和IL-13 水平增高，而Th1/Th2 降低，提示炎癥因子參與了pSS 的進(jìn)展過程，患者存在Th1，Th2細(xì)胞表達(dá)紊亂。IL-2 作為典型促炎因子，可導(dǎo)致IFN-γ 釋放增加，唾液流速減緩，對唾液腺內(nèi)炎癥浸潤存在促進(jìn)作用[17]。IL-7 在正常情況下能確保T細(xì)胞穩(wěn)定性，在病理狀態(tài)下呈過表達(dá)，并能促進(jìn)唾液內(nèi)IL-7 誘導(dǎo)生成的T 細(xì)胞增加，加重淋巴細(xì)胞浸潤程度[18]。INF-γ 能促進(jìn)促炎趨化因子分泌，破壞內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能，促進(jìn)唾液內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤，降低唾液分泌量[19]。IL-4 可能利用IL-4/STAT6 轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，將自身抗體破壞，誘發(fā)分泌功能障礙，從而參與pSS 病情進(jìn)展[20]。IL-13 與IL-4 的作用非常相似，二者均能對B 淋巴細(xì)胞表面抗原表達(dá)進(jìn)行誘導(dǎo)，促進(jìn)其增殖、分化，當(dāng)T 細(xì)胞異常時，能釋放IL-3，導(dǎo)致其表達(dá)水平增高[21]。各炎癥因子水平增高可能進(jìn)一步誘導(dǎo)FURIN 表達(dá)，重組FURIN 可反過來促進(jìn)炎癥因子釋放，上述因子可能通過共同作用，引起免疫紊亂，促進(jìn)pSS 發(fā)生與進(jìn)展。

本研究提示隨著pSS 病情越重，患者的血漿FURIN 水平及機(jī)體炎癥、唇腺損害及相關(guān)腺體功能下降也相應(yīng)加重。這可能是由于患者病情進(jìn)展后，局部應(yīng)激反應(yīng)加重所致，導(dǎo)致釋放的炎癥因子增多[22]，而炎癥因子能介導(dǎo)FURIN 表達(dá)，致血漿FURIN 水平增高，淚腺功能損害進(jìn)一步加重。本次結(jié)果顯示，抗SSA 抗體、抗SSB 抗體陽性患者的血漿FURIN 水平較陰性者下調(diào)，且炎癥更嚴(yán)重，而Th1/Th2 下降?？筍SA 抗體、抗SSB 抗體與皮膚疾病的發(fā)生密切相關(guān)，二者可直接參與皮膚損害。通過之前的分析提示，F(xiàn)URIN 可以通過過度激活淋巴細(xì)胞浸潤，致抗SSA 抗體、抗SSB 抗體生成增加，這可導(dǎo)致pSS 患病風(fēng)險(xiǎn)及皮膚受損程度加重。此外，炎癥反應(yīng)以及Th1/Th2 下降，表明患者機(jī)體存在明顯的免疫機(jī)制紊亂，可能導(dǎo)致抗SSA 抗體、抗SSB 抗體陽性率增高。通過進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，血漿FURIN 水平與血清IL-2，IL-7，INF-γ 水平及唇腺病理評分、唾液流率、Schirmer 試紙浸濕長度均有相關(guān)性。本研究通過之前的分析，認(rèn)為FURIN 過表達(dá)可能致唾液內(nèi)B 細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤激活，而在這種病理作用下，可刺激炎癥介質(zhì)釋放，致促炎因子上調(diào)，炎癥加重，唾液分泌減少，眼干癥狀也加重，且炎癥因子表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)FURIN表達(dá)增高，加重機(jī)體損害，引起異常。既往研究[23]局限于分析疾病活動評分、炎癥因子等常規(guī)指標(biāo)對pSS 的評估價值，而本研究則分析了pSS 患者血漿FURIN表達(dá)及其與Th1 及Th2 型細(xì)胞因子、唇腺損害及相關(guān)腺體功能的關(guān)系，更加了解該病的發(fā)病機(jī)制，臨床可考慮將下調(diào)血漿FURIN 水平作為其治療新靶點(diǎn)。綜上所述，F(xiàn)URIN 在pSS 患者的血漿中含量增高，血漿FURIN 與患者的Th1 及Th2 型細(xì)胞因子、唇腺損害及相關(guān)腺體功能指標(biāo)存在相關(guān)性，F(xiàn)URIN有望成為評估pSS 發(fā)生與進(jìn)展的重要指標(biāo)。本研究局限性在于因受納、排標(biāo)準(zhǔn)以及研究時限的限制，所收集到的病例樣本較少，未來還需增加樣本量進(jìn)行探討，提高研究數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。