胃癌患者血清miR-181b和PDCD4水平表達(dá)與幽門螺桿菌感染的關(guān)系

饒向東，劉振宇，湯紅亮，張 慧，白 雪，項(xiàng)夢(mèng)琦，謝瑞霞，徐 龍

（1.湖北省孝昌縣第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北孝感 432900;2.深圳大學(xué)總醫(yī)院消化內(nèi)科，深圳大學(xué)臨床科學(xué)研究院，深圳大學(xué)國(guó)際腫瘤中心，廣東深圳 518055）

胃癌是我國(guó)常見的起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，胃癌可發(fā)病于胃竇部、胃大、小彎等處，早期胃癌表現(xiàn)不明顯，易錯(cuò)過最佳治療期，晚期胃癌患者常有腹痛、貧血、消瘦、嘔血等臨床表現(xiàn)，生存率較低，對(duì)患者的生活質(zhì)量及生命安全造成較大影響[1]。胃癌病情發(fā)展復(fù)雜，與遺傳因素、個(gè)體因素、環(huán)境因素等多種因素均密切相關(guān)[2]，幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是一種微厭氧的螺旋形病菌，是胃癌、胃炎等消化系統(tǒng)疾病的主要感染菌，患者感染Hp 后，Hp相關(guān)的細(xì)胞毒素、酶類、細(xì)胞因子等均參與機(jī)體的不良反應(yīng)，對(duì)胃黏膜病變、消化道潰瘍、胃癌、胃炎等疾病的發(fā)生產(chǎn)生不利影響[3-4]。微小RNA是近年來發(fā)現(xiàn)的參與細(xì)胞增殖、腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移等多種生理活動(dòng)的非編碼單鏈RNA，具有促進(jìn)或抑制腫瘤發(fā)生等作用，miR-181 家族在人體細(xì)胞中廣泛存在，miR-181b 是其中之一，與多種腫瘤疾病密切相關(guān)[5]。程序性細(xì)胞死亡因子4（programmed cell death factor 4，PDCD4）是近年來發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，通過抑制細(xì)胞腫瘤性轉(zhuǎn)化發(fā)揮腫瘤抑制作用，在胃癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)，與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6]。本研究通過測(cè)定胃癌患者血清中miR-181b，PDCD4 表達(dá)情況，分析二者與胃癌患者Hp 感染情況之間的關(guān)系，為臨床診治胃癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2017年12月～2019年12月湖北省孝昌縣第一人民醫(yī)院收治的胃癌患者82例為胃癌組，其中男性42 例，女性40 例，年齡42～79 歲，平均年齡56.71±7.39 歲。同期選取本院健康體檢者91 例為對(duì)照組，其中男性46 例，女性45 例，年齡40～81 歲，平均年齡58.38±8.16 歲，兩組研究對(duì)象年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。納入標(biāo)準(zhǔn)：①診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)》[7]；②首次確診為胃癌；③未進(jìn)行生物治療、放療及化療等。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有其他部位惡性腫瘤患者；②伴有嚴(yán)重心、肺、肝功能不全者；③伴有嚴(yán)重血液疾病及免疫系統(tǒng)疾病等；④近6 個(gè)月服用抗生素、抗炎、胃黏膜保護(hù)類藥物等。本研究經(jīng)醫(yī)院道德倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，所有樣品采集均取得患者及家屬知情同意并簽字，符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》。

1.2 儀器與試劑 RNA 提取試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen 公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 購(gòu)于日本TAKARA 公司；miScript SYBR?Green qPCR Kit 購(gòu)于德國(guó)QIAGEN 公司；引物，由上海生工生物工程有限公司合成；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）儀、全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad 公司；13C 呼氣試驗(yàn)紅外光譜儀購(gòu)于安徽養(yǎng)和醫(yī)療器械設(shè)備有限公司；光學(xué)顯微鏡購(gòu)于上海兆儀光電科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Hp 感染檢測(cè)：采用13C 呼氣試驗(yàn)[8]測(cè)定對(duì)照組及胃癌組受試者的Hp 感染情況，受試者空腹服用13C 尿素膠囊后30 min 通過紅外光譜儀進(jìn)行呼氣，呼出氣中13C 原子峰大于基線5% 記為Hp 感染陽(yáng)性。

1.3.2 Hp 感染密度檢測(cè)：參考文獻(xiàn)[9]，采集胃癌組患者距離幽門2.5 cm 處的胃黏膜組織適量，光學(xué)顯微鏡中進(jìn)行病理診斷，在油鏡下分析Hp感染密度，Hp 輕度：樣本中Hp 小于1/3；Hp 中度：樣本中Hp 超過1/3 但小于2/3；Hp 重度：樣本中Hp 成堆存在。對(duì)照組不進(jìn)行鏡檢。

1.3.3 血清標(biāo)本采集：采集對(duì)照組及胃癌組受試者空腹靜脈血5～6 ml，室溫靜置20 min，4℃下3 000×g 離心10 min，采集血清至RNA 酶離心管中，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，用于后續(xù)RNA的提取。

1.3.4 qRT-PCR 法測(cè)定受試者血清中miR-181b，PDCD4 的表達(dá)水平：利用RNA 提取試劑盒（Invitrogen 公司）提取血清總RNA，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法（qRT-PCR）對(duì)miR-181b，PDCD4 進(jìn)行擴(kuò)增。qRT-PCR 反應(yīng)體系共20μl：miScript SYBR?Green Mix 10 μl，cDNA（50ng/μl）2μl，上下游引物（10μmol/L）各1μl，ddH2O 6.0μl。反應(yīng)條件：95 ℃90s；95 ℃30s；62 ℃30s；72 ℃15s；共40 個(gè)循環(huán)。miR-181b，PDCD4 及內(nèi)參U6，GAPDH 的引物序列見表1。采用2-??Ct法對(duì)血清miR-181b，PDCD4 相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行分析。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用軟件SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行表述，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用n進(jìn)行描述，行χ2檢驗(yàn)；Spearman 法分析miR-181b,PDCD4 與胃癌Hp 感染的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 Hp 感染檢測(cè) 對(duì)照組中79 例為Hp 感染陰性，12 例為Hp 感染陽(yáng)性，Hp 感染陽(yáng)性率為13.19%；胃癌組19 例為Hp 感染陰性，63 例為Hp 感染陽(yáng)性，Hp 感染陽(yáng)性率為76.83%；與對(duì)照組相比，胃癌組Hp 感染陽(yáng)性率顯著升高, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=68.571，P＜0.05）。

2.2 對(duì)照組與胃癌組血清中miR-181b，PDCD4 表達(dá)水平比較 見表2。與對(duì)照組相比，胃癌組Hp陰性、Hp 陽(yáng)性患者血清中miR-181b 表達(dá)水平均顯著升高（t=13.779，8.158，均P＜0.05），PDCD4 表達(dá)水平均顯著降低（t=8.432，19.087，均P＜0.05），且胃癌組及對(duì)照組Hp 陽(yáng)性患者血清中miR-181b 表達(dá)水平高于Hp 陰性患者（t=3.469，4.163，均P＜0.05），PDCD4 表達(dá)水平低于Hp 陰性患者（t=8.878，16.470，均P＜0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 兩組受試者血清中miR-181b，PDCD4 表達(dá)水平比較（±s）

表2 兩組受試者血清中miR-181b，PDCD4 表達(dá)水平比較（±s）

項(xiàng) 目對(duì)照組胃癌組tP Hp 陰性miR-181b0.98±0.191.67±0.2213.7790.000 PDCD41.06±0.180.69±0.138.4320.000 Hp 陽(yáng)性miR-181b1.19±0.232.28±0.458.1580.000 PDCD40.76±0.110.34±0.0619.0870.000

2.3 不同Hp 感染密度與血清中miR-181b，PDCD4 表達(dá)水平比較 見表3。隨著胃癌患者Hp感染密度的增加，Hp 陽(yáng)性患者血清中miR-181b 表達(dá)水平呈依次升高趨勢(shì)（t=5.476，7.479，2.227，均P＜0.05），PDCD4 表達(dá)水平均呈依次降低趨勢(shì)（t=10.216，14.014，9.199，均P＜0.05）。

表3 不同Hp 感染程度的胃癌患者血清中miR-181b，PDCD4 表達(dá)水平比較（±s）

表3 不同Hp 感染程度的胃癌患者血清中miR-181b，PDCD4 表達(dá)水平比較（±s）

注：中度組與輕度組相比，miR-181b/U6：t=5.476，P=0.000，PDCD4/GAPDH：t=10.216，P=0.000；重度組與中度組相比：miR-181b/U6：t=2.227，P=0.034，PDCD4/GAPDH：t=9.199，P=0.000；重度組與輕度組相比：miR-181b/U6：t=7.479，P=0.000，PDCD4/GAPDH：t=14.014，P=0.000。

項(xiàng) 目Hp 密度F P輕度（n=32）中度（n=19）重度（n=12）miR-181b/U61.87±0.372.54±0.502.98±0.598.8750.000 PDCD4/GAPDH0.48±0.090.25±0.050.11±0.0239.6440.000

2.4 胃癌患者Hp 感染與血清miR-181b，PDCD4表達(dá)水平相關(guān)性分析 Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果顯示血清中miR-181b 水平與胃癌患者Hp 感染呈正相關(guān)性，與Hp 陽(yáng)性相關(guān)系數(shù)為0.659，與Hp 陰性相關(guān)系數(shù)為0.685（P＜0.001），血清中PDCD4 水平與胃癌患者Hp 感染呈負(fù)相關(guān)性，與Hp 陽(yáng)性相關(guān)系數(shù)為-0.611，與Hp 陰性相關(guān)系數(shù)為-0.702（P＜0.001）。

3 討論

胃癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，隨著現(xiàn)代飲食結(jié)構(gòu)及生活方式的改變以及環(huán)境污染加重、農(nóng)藥、化肥等藥品的大量使用，造成胃癌發(fā)病率逐年升高，胃癌患者常會(huì)有上腹疼痛、進(jìn)行性吞咽困難、嘔血、黑便等不良表現(xiàn)，對(duì)患者的身體、心理健康及生活質(zhì)量造成較大的影響[10]。引起胃癌發(fā)生的原因多樣，Hp 感染是引發(fā)胃癌的重要危險(xiǎn)因素，資料顯示Hp具有調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的作用，進(jìn)而引發(fā)機(jī)體的炎癥反應(yīng)，加劇胃黏膜損傷，從而引起癌變[11]。本研究結(jié)果顯示，胃癌組Hp 感染陽(yáng)性率顯著高于健康體檢者，提示胃癌患者中具有較高的Hp 感染陽(yáng)性率，表明Hp 感染與胃癌發(fā)生密切相關(guān)，Hp 常存在于胃竇部、胃小凹等胃癌常發(fā)部位，這些部位長(zhǎng)期受到Hp 的感染，引發(fā)癌變的幾率會(huì)大大增加[12]。

miRNA 為一類具有多種生物學(xué)功能的進(jìn)化保守的短序列小RNA，主要通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)作為抑癌基因或原癌基因參與機(jī)體腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，諸多研究表明miRNA 異常表達(dá)與胃癌的發(fā)生發(fā)展聯(lián)系密切[13]，資料顯示miR-181 家族在胃癌、肝癌、肺癌等腫瘤的形成發(fā)展中起到重要作用，miR-181b 是其中一員，miR-181b 在胃癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，高表達(dá)的miR-181b 對(duì)于胃癌患者的生存具有不利影響[14]。本研究結(jié)果顯示，胃癌組Hp陰性、Hp 陽(yáng)性患者血清中miR-181b 表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組，且胃癌組及對(duì)照組Hp 陽(yáng)性患者血清中miR-181b 表達(dá)水平高于Hp 陰性患者，提示miR-181b 可能參與了胃癌疾病的進(jìn)展。

PDCD4 是近年來發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤抑制基因，與胃癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其在胃癌中的具體機(jī)制尚不清晰[15]。研究發(fā)現(xiàn)PDCD4 在胃癌患者血清中呈現(xiàn)低表達(dá)，且與患者的不良飲食習(xí)慣呈現(xiàn)相關(guān)性[16]。LI 等[17]人研究發(fā)現(xiàn)在高表達(dá)的miR-183 通過抑制PDCD4 的表達(dá)來促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移等。本研究結(jié)果顯示，胃癌組Hp 陰性、Hp 陽(yáng)性患者血清中PDCD4 表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照組，且胃癌組及對(duì)照組Hp 陽(yáng)性患者血清中PDCD4 表達(dá)水平低于Hp 陰性患者，與miR-181b 表達(dá)水平呈現(xiàn)相反趨勢(shì)，提示PDCD4低表達(dá)可能對(duì)于胃癌疾病具有不利影響，提示miR-181b 與PDCD4 具有一定的負(fù)向調(diào)控關(guān)系，表明miR-181b 可能通過靶向PDCD4 來發(fā)揮促癌作用；隨著胃癌患者Hp 感染密度的增加，Hp 陽(yáng)性患者血清中miR-181b 表達(dá)水平呈依次升高趨勢(shì)，PDCD4表達(dá)水平均呈依次降低趨勢(shì)，Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果顯示血清中miR-181b 與胃癌患者Hp 感染呈正相關(guān)性，血清中PDCD4 與胃癌患者Hp 感染呈負(fù)相關(guān)性，表明Hp 感染可能具有一定影響miR-181b，PDCD4 表達(dá)水平的作用，可能共同參與了胃癌的發(fā)生。

胃癌的發(fā)生與多種因素相關(guān)，其發(fā)生機(jī)制復(fù)雜。本研究通過測(cè)定胃癌患者的Hp 感染情況及血清中miR-181b，PDCD4 的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)Hp 感染程度的加深與miR-181b 表達(dá)水平的升高及PDCD4 表達(dá)水平的降低密切相關(guān)，三者的異常表達(dá)均參與了胃癌的發(fā)生及發(fā)展，但其中的潛在機(jī)制尚不清晰，仍需進(jìn)一步研究。