家系不寧腿綜合征/Willis-Ekbom病患者NOTCH2NLC基因研究

畢鴻雁 王琳 杜藝彤 許曉嬌 薛云 脫厚珍

不寧腿綜合征(restless legs syndrome，RLS)是常見的神經(jīng)系統(tǒng)感覺運動障礙性疾病，主要表現(xiàn)為難以名狀的腿部不適感，迫使患者產(chǎn)生活動下肢的強烈沖動，嚴重影響睡眠，也是導致睡眠障礙的最常見原因[1]。該病1672年由英國醫(yī)師Thomas Willis 對一個家系疾病進行最早描述，1944 年瑞典神經(jīng)病學家Ekbom對其進行了更為詳細的描述，故將其命名為 Willis-Ekbom disease(WED)。目前國際RLS研究小組建議采用RLS/WED命名該病。該病發(fā)病機制尚不明確，可能與遺傳因素有關(guān)，約50%的18歲以上RLS/WED患者有陽性家族史[2]。國外對RLS/WED的研究較多，發(fā)現(xiàn)了一些與RLS/WED相關(guān)聯(lián)的基因位點，但均未得到大規(guī)模研究的驗證。因此，RLS/WED雖然有明顯的家族聚集現(xiàn)象，但是其遺傳病因?qū)W機制仍不清楚。

近年來，國內(nèi)外研究學者確定了神經(jīng)元核內(nèi)包涵體病的致病突變?yōu)镹OTCH2NLC基因的GGC重復擴增，該基因的變異除可引起經(jīng)典的發(fā)作性/進展性腦病、周圍神經(jīng)病和自主神經(jīng)病等核心癥狀外，在運動神經(jīng)元病、阿爾茨海默病、帕金森病(PD)、特發(fā)性震顫、多系統(tǒng)萎縮等神經(jīng)系統(tǒng)遺傳變性病中亦檢測到此基因的變異[3]。PD患者合并RLS明顯高于普通人群或與之匹配的對照組，RLS可能是PD的早期臨床特征[4]。本研究通過檢測我國35例家系原發(fā)RLS/WED患者NOTCH2NLC基因的GGC重復擴增情況，旨在探討NOTCH2NLC基因與RLS/WED發(fā)病的關(guān)系。

1 對象和方法

1.1 對象收集2016年1月至2020年10月首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院確診的RLS/WED患者35例，所有患者均有陽性家族史，并符合2014 年國際RLS研究小組公布的最新診斷標準[1]。排除繼發(fā)性RLS/WED，如繼發(fā)于貧血、腎功能不全、尿毒癥接受透析或腎移植、糖尿病性周圍神經(jīng)病、PD和帕金森綜合征、腦血管病、其他周圍神經(jīng)病、妊娠等；排除神經(jīng)痛、下肢動靜脈狹窄或血栓形成、下肢水腫、關(guān)節(jié)炎、腿部肌肉痙攣、位置性不適、習慣性拍打等容易與RLS/WED癥狀混淆情況。該研究得到首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院倫理委員會的批準通過，患者均簽署知情同意書，并建立臨床信息和遺傳信息檔案。

1.2 方法抽取患者肘靜脈血4 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，采用苯酚-氯仿-異丙醇法提取 DNA。根據(jù)文獻[5]方法，采用重復引物聚合酶鏈反應PCR方法(RP-PCR)和富含GC的毛細管電泳PCR方法(GC-PCR)對NOTCH2NLC基因中的GGC重復序列進行擴增，擴增產(chǎn)物在ABI 3730XL遺傳分析儀上進行檢測，檢測結(jié)果采用Genemaker軟件分析擴增產(chǎn)物大小，并計算GGC重復數(shù)。健康者該序列重復次數(shù)不超過40次。

2 結(jié)果

35例RLS/WED患者中男17例，女18例，發(fā)病年齡20～60歲，病程2～50年。35例患者中均未發(fā)現(xiàn)NOTCH2NLC基因異常GGC重復擴增(圖1)。NOTCH2NLC基因GGC重復數(shù)范圍為12～33次，平均(18.73±4.77)次，重復頻率最高的為14次，其次為19次。其分布情況見圖2。

注：RLS：不寧腿綜合征，WED：Willis-Ekbom disease，圖2同圖 1 RP-PCR和GC-PCR分析方法檢測某例原發(fā)性RLS/WED家系患者NOTCH2NLC基因未見GGC重復擴增

圖 2 35例原發(fā)性RLS/WED家系患者NOTCH2NLC基因不同GGC重復數(shù)量序列分布情況

3 討論

家族性RLS/WED患者非常多見，在RLS/WED患者家系中，60%的一級親屬患RLS/WED。盡管大多數(shù)報道的家系符合常染色體顯性遺傳模式，但也有家系遵循了常染色體隱性遺傳模式或非孟德爾遺傳模式。既往有研究通過假設RLS/WED為孟德爾單基因疾病，采用經(jīng)典的連鎖分析方法對RLS/WED的家庭進行調(diào)查，但未能鑒定出單致病基因。目前認為，RLS/WED是一種典型的復雜遺傳疾病，常見的和罕見的遺傳變異均可能引起該疾病。全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)已鑒定出部分共同變異[6]，包括MEIS1、BTBD9、PTPRD 等，其中MEIS1 與 RLS 相關(guān)性最高[7]，但這些基因位點的變異僅能解釋非常小一部分RLS/WED患者的發(fā)病，多數(shù)RLS患者的遺傳學特點仍無法解釋。目前已知的這些風險基因變異和相應的候選基因大多為尚未在生物分子網(wǎng)絡中建立聯(lián)系的孤立體。迄今為止，尚無有關(guān)RLS/WED遺傳研究對基因組的結(jié)構(gòu)變異如DNA序列的插入、缺失和易位進行深入分析。然而這些結(jié)構(gòu)變異在復雜疾病病因，如注意力缺陷/多動癥、自閉癥和精神分裂癥等具有重要地位。

NOTCH2NLC基因相關(guān)疾病具有高度復雜性和異質(zhì)性，GGC異常擴增表達可引起不同臨床表型的機制仍然不清楚，其GGC重復序列數(shù)量是否發(fā)揮重要作用亦不清楚。RLS可出現(xiàn)于PD等多種運動障礙相關(guān)疾病患者中，帕金森綜合征患者也被檢測到存在NOTCH2NLC基因的GGC重復異常擴增[2]。本研究結(jié)果未發(fā)現(xiàn)RLS/WED患者存在NOTCH2NLC基因GGC重復突變，提示GGC重復序列與RLS/WED發(fā)病可能無關(guān)。由于樣本量較小，且盡管目前研究顯示在一些家系中發(fā)現(xiàn)某些基因或者多態(tài)性與RLS/WED有關(guān)，但均未經(jīng)大樣本研究證實，90%的RLS/WED患者的致病基因仍不明確[8]，因此有關(guān)RLS/WED發(fā)病與NOTCH2NLC基因GGC重復擴增的確切關(guān)系仍不確定，需進一步研究驗證。深入探討RLS/WED的基因特點將有助于其診療。