消瘀泄?jié)犸媽?duì)慢性腎臟病2～4期患者Th17/Treg細(xì)胞免疫平衡的影響

來潔 王安妮 朱夢(mèng)潔 夏璁 魯科達(dá) 何靈芝

1.杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院 杭州 311201 2.杭州市中醫(yī)院丁橋院區(qū) 3.浙江綠城心血管病醫(yī)院4.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院

Harrington等[1]于2005年首次提出了輔助性T細(xì)胞17（T helper cell 17，Th17）的概念。 Th17能分泌特異性炎癥細(xì)胞因子白介素-17（interleukin-17，IL-17），廣泛參與多種自身免疫性疾病、感染性疾病、腫瘤以及慢性炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展[2]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory cells，Treg）是一群具有免疫抑制功能的T細(xì)胞，在維持機(jī)體的免疫平衡、免疫耐受方面具有重要作用[3]。Th17/Treg保持平衡，有利于機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)的維持，如果Th17/Treg失衡將會(huì)導(dǎo)致疾病發(fā)生乃至惡化。

消瘀泄?jié)犸嬍菄?guó)家級(jí)名中醫(yī)李學(xué)銘教授的自擬方，在臨床上廣泛應(yīng)用于慢性腎衰竭氣虛夾瘀證的治療[4]。在前期研究中，本課題組發(fā)現(xiàn)慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）2～4期患者存在微炎癥狀態(tài)，體內(nèi)促炎因子白介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-17水平明顯增高，而抑炎因子白介素-10（interleukin-10，IL-10）顯著降低，促炎和抑炎因子水平呈現(xiàn)失衡狀態(tài)[5]。在既往研究的基礎(chǔ)上，本課題組進(jìn)一步研究了消瘀泄?jié)犸媽?duì)CKD 2～4期氣虛夾瘀證患者外周血Th17/Treg細(xì)胞水平的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）依據(jù)2002年美國(guó)國(guó)家腎臟基金會(huì)所屬腎臟病預(yù)后質(zhì)量倡議（Kidney Disease Outcomes Quality Initiative，K/DOQI）專家組發(fā)布的《K/DOQI慢性腎臟病臨床實(shí)踐指南》[6]，符合CKD 2～4期的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[7]，符合中醫(yī)氣虛夾瘀證的辨證分型；（3）年齡18～65歲，感染、酸中毒、電解質(zhì)紊亂、高血壓等得到較好控制；（4）所有患者均自愿接受臨床研究并簽署知情同意書。本研究通過浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)要求（倫理審批號(hào)碼：2017-KL-056-01）。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）近1個(gè)月參加過或正在參加其他臨床研究者；（2）急性腎功能衰竭以及行腎臟替代治療者；（3）近6個(gè)月內(nèi)接受血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（angiotension converting enzyme inhibitors，ACEI）、血管緊張素受體阻滯劑（angiotensin receptor blocker，ARB）、激素或免疫抑制劑治療者；（4）酸中毒、水電解質(zhì)紊亂、感染、出血等無法糾正者，臟器功能嚴(yán)重受損者；（5）惡性腫瘤患者；（6）近期有手術(shù)史者；（7）不配合治療者；（8）妊娠和哺乳期女性。

1.3 分組 根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，選取在浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎臟內(nèi)科診治的門診及住院患者80例，按照隨機(jī)數(shù)字表分成治療組和對(duì)照組，每組40例。對(duì)照組男21例、女19例；年齡26～65歲，平均（51.83±10.81）歲；病程3～9年，平均（6.25±2.16）年；CKD 2期10例、CKD 3期14例、CKD 4期16例。治療組男22例、女18例；年齡19～65歲，平均（49.93±13.00）歲；病程3～9年，平均（6.18±1.78）年；CKD 2期9例、CKD 3期18例、CKD 4期13例。兩組患者性別、年齡、病程、疾病分期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.4 治療方法 兩組患者均給予優(yōu)質(zhì)低蛋白飲食，配合復(fù)方α-酮酸片治療，并控制血壓、血糖、血脂，同時(shí)給予糾正水、電解質(zhì)和酸堿平衡紊亂等基礎(chǔ)治療。治療組在此基礎(chǔ)上結(jié)合中醫(yī)辨證，予以中藥消瘀泄?jié)犸嫓珓┲委?。方藥組成：生黃芪30g，牛膝12g，桃仁12g，地龍12g，制大黃10g，車前草20g。 所有藥物均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥房統(tǒng)一提供，1劑/d，分早晚兩次服用。兩組患者均治療12周。

1.5 觀察指標(biāo) 治療前和治療12周后分別以流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組患者外周血Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例，以全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血肌酐（serum creatinine，Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、24h尿蛋白定量（24 hour urinary protein quantity，24UPr）、白蛋白（albumin，ALB）、低密度脂蛋白膽固醇 （low density lipoprotein cholesterin，LDLC），以貝克曼庫(kù)爾特血細(xì)胞分析儀檢測(cè)血紅蛋白（hemoglobin，HGB）水平。

1.6 安全性指標(biāo) 治療過程中監(jiān)測(cè)患者肝功能和心電圖等安全性指標(biāo)的變化。

1.7 療效標(biāo)準(zhǔn) 療效判定標(biāo)準(zhǔn)參照 《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[7]制定。顯效：相關(guān)臨床癥狀、體征明顯減輕，Scr降低≥30%；有效：相關(guān)臨床癥狀、體征均有減輕，Scr降低＜30%且≥20%；無效：相關(guān)臨床癥狀、體征沒有改善，甚至惡化?？傆行剩?）=（顯效例數(shù)+有效例數(shù)）/總例數(shù)×100%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較，滿足正態(tài)分布的用t檢驗(yàn)，不滿足的用秩和檢驗(yàn)；兩組內(nèi)比較，滿足正態(tài)分布的用配對(duì)t檢驗(yàn)，不滿足的用配對(duì)秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分?jǐn)?shù)描述，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者治療前后Scr、BUN、24UPr、LDL-C、ALB、HGB水平比較 治療前兩組患者Scr、BUN、24UPr、LDL-C、ALB、HGB水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 與治療前比較，治療后治療組Scr、BUN、24UPr水平下降，ALB水平上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；LDL-C水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；HGB差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療后組間比較，治療組Scr、BUN低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；24UPr、HGB、LDL-C、ALB水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見表1、2。

表1 兩組患者治療前后Scr、BUN、24UPr比較

表2 兩組患者治療前后LDL-C、ALB、HGB比較

2.2 兩組患者治療前后Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞數(shù)量比較 治療前兩組Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與治療前比較，治療后對(duì)照組Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療組Th17細(xì)胞數(shù)量降低，Treg細(xì)胞數(shù)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。 治療后組間比較，治療組Th17細(xì)胞數(shù)量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Treg細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 兩組患者治療前后Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞數(shù)量比較（%）

2.3 兩組患者總體療效比較 治療12周后，對(duì)照組總有效率為15.0%，治療組總有效率為42.5%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。 見表4。

表4 兩組患者療效比較

2.4 兩組患者不良反應(yīng)觀察 本研究期間，對(duì)照組1例患者血鉀輕度升高（5.9mmol·L-1），予利尿排鉀等治療后，血鉀恢復(fù)正常，其他患者未發(fā)生明顯不良反應(yīng)，無患者退出臨床研究。

3 討論

CD4+T細(xì)胞在不同的作用下可分化為輔助性T細(xì)胞1（T helper cell 1，Th1）、輔助性T細(xì)胞2（T helper cell 2，Th2）、Th17和Treg四個(gè)不同的亞群。其中，Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞是近年來新發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)細(xì)胞亞群，其分化發(fā)育、功能發(fā)揮受到Th1型、Th2型效應(yīng)T細(xì)胞以及自身分泌產(chǎn)生的細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，廣泛參與自身免疫性疾病、感染、腫瘤等疾病的發(fā)生和發(fā)展[8]。

Th17細(xì)胞由IL-6和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β） 共同誘導(dǎo)輔助性T細(xì)胞分化而成。分化成熟后的Th17細(xì)胞能分泌一系列的細(xì)胞因子，如IL-17、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等，在防御病原菌感染、介導(dǎo)炎性反應(yīng)、參與機(jī)體免疫應(yīng)答方面具有廣泛的作用[9-10]。目前研究顯示，在T細(xì)胞與B細(xì)胞均缺陷小鼠的腎小球內(nèi)注射Th17細(xì)胞或Th1細(xì)胞，均能導(dǎo)致腎小球腎炎[11]，表明Th17細(xì)胞和Th1細(xì)胞均與腎小球腎炎的發(fā)生有關(guān)。另有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在抗腎小球基底膜腎小球腎炎、抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體相關(guān)性腎炎、狼瘡性腎炎、IgA腎炎、膜性腎病等各種不同類型的腎炎中，Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例均有不同程度升高[12-13]。由此，筆者推測(cè)Th17細(xì)胞可促進(jìn)腎小球疾病的發(fā)生和發(fā)展。

Treg細(xì)胞是具有免疫抑制功能的一群T細(xì)胞，主要分泌IL-10和TGF-β等細(xì)胞因子，廣泛參與了自身免疫性疾病、移植免疫、腫瘤免疫等病理生理過程。免疫抑制是Treg細(xì)胞最重要的特性，其能夠有效抑制效應(yīng)T細(xì)胞的增生和活化[3]。關(guān)于Treg細(xì)胞與CKD的關(guān)系，張俊濤等[14]研究發(fā)現(xiàn)，尿毒癥患者的外周血中，Treg細(xì)胞、TGF-β1及IL-10的含量顯著下降，而且三者均與BUN、Scr、腎功能恢復(fù)正常所需時(shí)間呈明顯負(fù)相關(guān)，即Treg細(xì)胞、TGF-β1及IL-10含量越低，患者的腎功能越差，因此腎功能恢復(fù)所需時(shí)間及住院時(shí)間越長(zhǎng)。

劉璠娜等[15]研究發(fā)現(xiàn)，尿毒癥患者的維甲酸相關(guān)孤 核 受 體 γ t（retinoid-related orphan receptor γt，RORγt）/叉頭框轉(zhuǎn)錄因子p3（forkhead box p3，F(xiàn)oxp3）的比值明顯高于健康志愿者，而且外周血中Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞比例增高，Treg細(xì)胞減少。廉琳等[16]通過檢測(cè)外周血Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組比較，原發(fā)性膜性腎?。╬rimary membranous nephropathy，PMN）組患者Th17細(xì)胞表達(dá)增加，Treg細(xì)胞表達(dá)減少，證實(shí)PMN患者體內(nèi)存在著Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞免疫紊亂的現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)，在CKD 2～4期的患者中，Treg細(xì)胞可明顯降低，Th17細(xì)胞可明顯升高，患者體內(nèi)存在著Th17、Treg的免疫失衡，影響著患者疾病的發(fā)生、發(fā)展。

消瘀泄?jié)犸嬙谂R床上廣泛用于氣虛夾瘀慢性腎衰竭患者的治療[4]，方中重用生黃芪補(bǔ)氣行氣，制大黃通腑泄?jié)幔Ｏ?、桃仁、車前草、地龍活血祛瘀通利，可有效減輕患者氣虛夾瘀所致的臨床癥狀。藥理學(xué)研究提示，高劑量黃芪能夠抑制Th17的分化，減少IL-17分泌，減輕炎癥反應(yīng)[17]；大黃素同樣能抑制Th17增殖，并通過拮抗IL-17產(chǎn)生，影響核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB） 核轉(zhuǎn)位，減少IL-6等炎癥因子釋放，抑制炎癥反應(yīng)[18]。研究證實(shí)，消瘀泄?jié)犸嬆芡ㄟ^降低TGF-β1水平[19]，抑制α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的表達(dá)[20]，從而能夠抗腎間質(zhì)纖維化；還能通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）和下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1（tissue inhibitor of metalloproteinases-1，TIMP-1）的表達(dá)，減少鐵蛋白（ferritin，F(xiàn)N）、Ⅳ型膠原（collage type Ⅳ，Col Ⅳ）沉積，保護(hù)殘腎功能[19]。上述機(jī)制說明，消瘀泄?jié)犸嬇浜螩KD基礎(chǔ)治療對(duì)改善腎功能，延緩CKD進(jìn)程具有積極作用。本研究也顯示，消瘀泄?jié)犸嬇浜螩KD基礎(chǔ)治療能降低Th17細(xì)胞比例，升高Treg細(xì)胞比例，使Th17/Treg免疫失衡逐漸恢復(fù)。

綜上所述，本研究提示CKD 2～4期患者體內(nèi)存在免疫平衡異常，主要表現(xiàn)為外周血Treg細(xì)胞比例降低，Th17細(xì)胞比例增高。消瘀泄?jié)犸嬇浜蠌?fù)方α-酮酸片等基礎(chǔ)治療能夠上調(diào)CKD 2～4期氣虛夾瘀證患者Treg細(xì)胞水平，下調(diào)Th17細(xì)胞水平，恢復(fù)Th17/Treg免疫平衡；同時(shí)保護(hù)腎臟功能，延緩疾病進(jìn)程，提高患者生存質(zhì)量。本研究的不足之處在于樣本量小、研究周期較短，未來的研究可擴(kuò)大樣本量、延長(zhǎng)研究周期，進(jìn)一步明確消瘀泄?jié)犸嬇浜匣A(chǔ)治療對(duì)CKD患者免疫平衡的影響；并開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，深入探討消瘀泄?jié)犸嬇浜匣A(chǔ)治療對(duì)免疫平衡調(diào)節(jié)的具體機(jī)制。