復(fù)方黑芝麻丸的制備工藝研究

北京城市學(xué)院（100094）盧思潮 白楊 周云灝 劉祺 李紀飛 敖冬梅

復(fù)方黑芝麻丸一方出自清代鮑相璈所著的《驗方新編》卷一，烏須黑發(fā)方，由九制黑芝麻、紅棗肉和墨旱蓮組成。具有烏須黑發(fā)，兼有氣血陰陽并補等保健功能。目前由于生活節(jié)奏加快，壓力大，早衰白發(fā)的現(xiàn)象有愈發(fā)年輕的趨勢。方中黑芝麻具有補肝腎，益精血，潤腸燥。其中含有芝麻素等豐富的木脂素類物質(zhì)，并含有黑芝麻色素這一抗氧化天然堿溶性色素[1]。黑芝麻采用九蒸九曬法清蒸，又稱“九制”或“九蒸九曝”。首見于南朝梁國醫(yī)藥大家陶弘景在其著作《本草經(jīng)集注》。九蒸九曬后的黑芝麻氨基酸等有效成分發(fā)生改變[2]。后世皆沿用陶弘景的方法將黑芝麻進行九蒸九曝后制成大蜜丸，輔料蜂蜜作為賦形劑、甜味劑，易于服用且具有防腐的作用。此后這一劑型便規(guī)定下來并流傳至今[3]。黑芝麻丸通常采用塑制法，此法的差異性小，生產(chǎn)效率高，使得生產(chǎn)周期短、損耗小、成品率不斷提高[4]。本實驗?zāi)康木耪艟艜窆に囍姓糁茣r間對黑芝麻中芝麻素和黑色素的影響；使用光譜法進行測定，以芝麻素含量為主要評價指標，黑芝麻色素的得率和色價為次要評價指標，采用單因素實驗優(yōu)化研究；在這一基礎(chǔ)上以蜜丸圓整度、丸重差異為評價指標，采用正交實驗法確定復(fù)方黑芝麻丸劑型工藝。得到穩(wěn)定、優(yōu)化的復(fù)方黑芝麻丸制備工藝。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗藥品與試劑 經(jīng)鑒定的黑芝麻、大棗、墨旱蓮，三種中藥飲片均來自北京太洋樹康飲片廠，批號分別為2002008、2009017、1912083；芝麻素標準品（上海源葉生物科技有限公司，批號：C07M7H10462）；95%乙醇（現(xiàn)代東方（北京）科技發(fā)展有限公司，批號：20200830）；碳酸氫鈉（北京化工廠，批號：20140103）；多花蜂蜜（北京百花蜂業(yè)科技發(fā)展股份公司，批號：20201021C2C3）。

1.1.2 實驗藥品與試劑 十萬分之一電子天平（日本島津公司，批號：AUW120D）；超聲波清洗器（深圳市深華泰有限公司，批號：PS-70AL）；電熱恒溫水浴鍋（北京長安科學(xué)儀器廠，批號：HHS1NI2）可傾式多功能制丸機（溫嶺市林大機械有限公司，批號：DZ-40）；雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司，批號：TU-1900）；臺式電磁爐（佛山市宏基電子科技有限公司，批號：H35FP3A）；電熱恒溫鼓風干燥箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司，批號：OHG-914385）；高速多功能粉碎機（武義意中廚具有限公司，批號：BJ-800A）；30/80/120目篩（浙江省上虞市紗篩廠，批號：G1-1997）；循環(huán)水式多用真空泵（上海滬析實業(yè)有限公司，批號：SHBIII）；蒸屜、甑均由北京城市學(xué)院生物醫(yī)藥學(xué)部定制。

1.2 實驗藥品與試劑

1.2.1 九蒸九曬黑芝麻的制備 根據(jù)相關(guān)研究，多將黑芝麻的蒸制時間設(shè)定為6h[5]。為證實其可靠性，采取單因素實驗為預(yù)實驗，以芝麻素和黑芝麻色素為評價指標，將九蒸九曬的蒸制時間設(shè)為2h、4h、6h、8h、10h五種不同水平，以測定不同的蒸制時間對黑芝麻中有效成分含量的影響。各取生品黑芝麻80g，放在紗布上攤開，平鋪厚度均為

0.5cm，分別放入蒸屜于水沸騰上氣后轉(zhuǎn)小火蒸2h、4h、6h、8h、10h后取出；于陽光下攤開曬到黑芝麻干燥，不粘連；如此共重復(fù)9次，即得九蒸九曬黑芝麻。通過紫外可見光分光光度計測出芝麻素含量最高的樣品，再采取相同單因素實驗進行細化，以30min為一個因素，確定最優(yōu)蒸制時間。分別制出每份式樣做三組平行實驗，根據(jù)結(jié)果和誤差來判斷炮制工藝的合理性，確定最佳炮制方案的準確性。

1.2.2 九制黑芝麻炮制品中芝麻素的提取與含量測定

1.2.2.1 芝麻素的提取 供試品溶液的配制：取九制黑芝麻粉碎，稱取8g粉末移入錐形瓶中，加入95%的乙醇溶液，其中黑芝麻與乙醇溶液的料液比為1∶15，放入功率調(diào)整為330W的超聲波提取器中，將提取的時間設(shè)定為33min，提取芝麻素的溫度設(shè)定為60℃，提取完畢后取出過濾[6]。取1mL的的黑芝麻提取液于25mL容量瓶中,加95%乙醇定容至刻度，搖勻備用。

對照品溶液的配制：使用十萬分之一電子天平精密稱取10mg純度為98%的芝麻素標準品，與95%乙醇溶液一同溶解定容于25mL容量瓶中搖勻，配制成母液濃度為380μg/mL。

1.2.2.2 方法學(xué)考察 將芝麻素的標準品溶液和供試品溶液分別進行全波長紫外掃描，確定標準品和供試品的最大吸收波長。木脂素類化合物在200～400nm處的紫外范圍內(nèi)具有明顯的吸收特征，利用其吸收的強弱來對黑芝麻炮制品中的芝麻素進行定量檢測[7]。

1.2.2.3 線性關(guān)系考察 使用移液管精密量取標準品溶液，分別在五個10mL容量瓶中加95%乙醇定容至刻度，搖勻。加入的標準品溶液的體積和濃度分別為0.1mL（3.8μg/mL）、0.2mL（7.6μg/mL）、

0.4mL（15.2μg/mL）、0.6ml（22.8μg/mL）、0.8ml（30.4μg/mL），空白對照品為95%乙醇溶液。放入紫外可見光分光光度計中檢測最大吸光度，將測出的結(jié)果換算出濃度后以芝麻素的質(zhì)量濃度（μg/mL）為x軸橫坐標，以吸光度A為y軸縱坐標進行標準曲線的繪制和回歸方程式的計算。

1.2.2.4 樣品測定結(jié)果 取各個批次的樣品，按“1.2.2.1”項下方法制備待測液。放入紫外可見光分光度計中測定芝麻素含量。其余方法學(xué)考察均采用測得含量最高的樣品進行測定。

1.2.2.5 精密度考察 按“1.2.2.1”項下方法制備待測液，取其中三批6h樣品提取液，進行五次吸光度的檢測，計算其平均得率及RSD值，以測得樣品精密度。

1.2.2.6 穩(wěn)定性考察 按“1.2.2.1”項下方法制備待測液，取其中三批6h樣品提取液，為證明提取液在常溫下具有很好的穩(wěn)定性，分別于常溫下放置0、10、20、30、40min后測定溶液的吸光度并計算其平均含量變化以及RSD值。

1.2.2.7 重復(fù)性考察 為證明本試驗的重現(xiàn)性，分別稱取五份6h黑芝麻炮制品，然后“1.2.2.1”項下方法進行提取處理后，對吸光度進行檢測，并計算樣品平均含量和RSD值。

1.2.2.8 加樣回收率實驗 精密稱取已知芝麻素含量的乙醇提取液四份，分成兩組，然后測定吸光度，分別測出其芝麻素含量。然后加入已知含量的標準品溶液于容量瓶中，測定其吸光度，并計算加樣回收率及RSD值。

1.2.3 九制黑芝麻炮制品中黑色素的得率及色價的測定

1.2.3.1 黑芝麻色素的提取工藝 采用超聲波提取法提取黑芝麻色素[8]。準確稱取10g黑芝麻，水洗干凈后，濾干備用，配制8g/L碳酸氫鈉溶液作為萃取溶劑，pH值為8.8。使用料液比1∶5的溶液將芝麻浸沒后，在250kw功率的超聲波提取儀中，44℃超聲溫度提取45min，提取結(jié)束后將溶液進行抽濾，預(yù)先稱取蒸發(fā)皿的重量，將裝有黑芝麻色素的蒸發(fā)皿放入烘箱烘至完全干燥，恒溫70℃，通風。取出蒸發(fā)皿中殘留的干燥物即得黑芝麻黑色素，黑芝麻色素的得率計算公式為：D/%=m/W×100。

式中：D為得率，%；m為黑芝麻色素質(zhì)量，g；W為黑芝麻炮制品質(zhì)量，g。

1.2.3.2 黑芝麻色素色價的計算 精確稱取黑芝麻色素0.05g，放入100ml容量瓶中用pH值為8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液定容至刻度線后搖勻。之后使用移液管精密量取溶液1mL，放入10ml容量瓶中，用緩沖溶液液定容至刻度線后搖勻。使用紫外分光光度計對其進行全波長掃描，檢測到其最大吸收峰約在波長。測出黑芝麻色素經(jīng)過稀釋后的溶液的吸光值，計算色價。樣品色價的計算公式為：E=A×n/W。

式中：E為色價；A為吸光值；n為稀釋倍數(shù)；W為樣品質(zhì)量，g。

1.2.4 復(fù)方黑芝麻丸的制劑原料加工

1.2.4.1 藥粉的制備 黑芝麻、墨旱蓮和棗肉的配伍均為6∶1∶3。將炮制后的黑芝麻搗碎成稠糊狀。預(yù)先將墨旱蓮用打粉機打碎成最細粉，過120目篩。大棗中棗皮與棗肉的抗氧化成分含量較高，而棗核部分含量較低[9]。所以在使用過程中，應(yīng)去除棗核，只留棗肉部分并剪碎。粉碎大棗和墨旱蓮時，將50g藥材放入高速粉碎機中用串油法粉碎芝麻10s，如此反復(fù)三次后開蓋過篩，烘干成棗干后采用共研法與墨旱蓮粉混合粉碎，過80目篩。由于黑芝麻中含有大量油脂，故采用串油法將棗墨旱蓮藥粉與黑芝麻混合粉碎成細粉后混勻，過30目篩，制得藥粉。

1.2.4.2 煉蜜的制備 通過大蜜丸的制備要求顯示，傳統(tǒng)的中藥蜜丸應(yīng)選用百花蜜，加熱制成煉蜜后用于制劑。煉蜜的程度分為嫩蜜、中蜜和老蜜，不同程度的蜜的使用與藥材的質(zhì)地有關(guān)。方中九制黑芝麻含油量較高，大棗含糖量較高，二者都具有一定粘性，因此應(yīng)使用嫩蜜進行黏合。故本實驗中選取適量百花蜜生蜜加熱煮沸，直到溫度達到105℃～115℃，過濾去除浮沫和雜質(zhì)制成嫩蜜。其顏色無太大變化，兩指沾試不拉絲，稍有粘性。

1.2.5 復(fù)方黑芝麻丸的制劑工藝優(yōu)化

1.2.5.1 丸劑制備因素的確定 經(jīng)相關(guān)文獻的參考以及預(yù)實驗[10]，最終得出對大蜜丸的外觀質(zhì)量產(chǎn)生影響的主要三因素為：和坨中藥粉與煉蜜的不同配比、和藥時煉蜜的溫度以及餳藥的時間，從這三個因素中再設(shè)計出三個不同水平進行細化：將和坨時煉蜜的溫度分別設(shè)定在80℃、75℃和70℃；和坨中藥粉與煉蜜的不同配比分別設(shè)置為1/0.4、1/0.45和1/0.5進行混合，藥坨分別餳藥0.5h、1h、2h后糅合至軟化不開裂后放入甑中隔水加熱30min消毒，投入清潔后的制藥機中制成同等大小的大蜜丸。

1.2.5.2 復(fù)方黑芝麻丸的劑型工藝研究 在研究復(fù)方黑芝麻丸蜜丸劑型，以丸劑圓整度、重量差異為評價指標。由10個人組成評價組，依據(jù)上述指標分別進行打分，除去一個最高分和最低分，其余算出平均分。重量差異依照中國藥典相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。每份式樣做三組平行實驗，根據(jù)結(jié)果和誤差判斷制劑工藝的合理性，確定最佳制劑方案的準確性。

1.2.5.3 蜜丸圓整度檢測 丸劑外觀應(yīng)圓整，大小、色澤應(yīng)均勻，無粘連現(xiàn)象。采用塑制法制成的大蜜丸的圓整度為指標進行10人打分制。滿分為10分，評判標準從高到低為10分（十分圓整）、7.5分（一般圓整）、5分（較圓整）、2.5分（較不圓整）和0分（不圓整）五種等級并可在相應(yīng)范圍內(nèi)進行靈活打分。

1.2.5.4 蜜丸重量差異檢測 采用《中國藥典》所規(guī)定的丸劑重量差異進行實驗。實驗中大蜜丸質(zhì)量均超過1.5g，故以1丸為1份，共取1份供試丸劑，使用電子天平稱量其質(zhì)量，每份質(zhì)量比較平均重量，大于或小于藥典所規(guī)定的重量差異限度的丸數(shù)不得超過2份，超出平均重量差異限度的1倍的不能有1份。

1.2.5.5 復(fù)方黑芝麻丸的正交實驗 按“1.2.5.1”項下方法制備制得復(fù)方黑芝麻丸供試品，以圓整度、重量差異為指標，按“1.2.5.3”項下方法對成品圓整度進行打分，并按“1.2.5.4”項下方法，測出9批大蜜丸的重量差異。按設(shè)定好的因素和水平進行正交實驗。根據(jù)結(jié)果和誤差來判斷制劑工藝的合理性，確定最佳制劑方案的準確性。

2 結(jié)果與討論

2.1 九制黑芝麻炮制品中芝麻素和黑色素的提取結(jié)果

2.1.1 九制黑芝麻炮制品中芝麻素的含量測定及方法學(xué)考察通過對芝麻素的標準品和供試品進行全波長掃描（見附圖1、附圖2），二者均出現(xiàn)非常明顯的吸收峰，分別在235nm和287nm處，其中在287nm處較為明顯，且黑芝麻色素等成分的雜峰干擾小，因此后續(xù)方法學(xué)考察定位287nm處，對相關(guān)供試品溶液進行定量測定。芝麻素標準品五種不同濃度的標準品最大吸光度為0.113、0.206、0.378、0.571、0.758，將測出的結(jié)果換算出濃度后繪制出濃度標準曲線，回歸方程式為y=0.0246x+0.0108，回歸系數(shù)平方為0.9993（見附圖3）。

附圖1 芝麻素標準品的紫外掃描曲線

附圖2 芝麻素供試品的紫外掃描曲線

附圖3 芝麻素標準曲線

2.1.1.1 不同批次樣品中黑芝麻素的含量 經(jīng)過預(yù)實驗數(shù)據(jù)（見附表1）得知，蒸制時間6h的黑芝麻炮制樣品芝麻素含量最高，8h的次之，10h的芝麻素含量較低。故其余方法學(xué)考察均采用三批6h樣品進行測定。

附表1 九制蒸2～10小時供試品的吸光度及含量

根據(jù)附表2的數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，蒸制5.5h的黑芝麻炮制品中芝麻素的樣品含量較高，6h次之，7h得率最少。

附表2 九制蒸5～7小時供試品的吸光度及含量

2.1.1.2 精密度試驗 按“1.2.2.1”項下方法制備待測液，取其中三批6h樣品提取液，進行五次吸光度的檢測（見附表3），并計算其平均樣品含量為13.44μg/mL，RSD值為0.19%，由此可知提取液經(jīng)測定具有極好的精密度。

附表3 各批次6h供試品的精密度

2.1.1.3 穩(wěn)定性試驗 按“1.2.2.1”項下方法制備待測液，取其中三批6h樣品提取液，分別于常溫下放置0min、10min、20min、30min、40min后測定其吸光度（見附表4），計算其平均得率為13.44，RSD值為0.16%，芝麻素提取液在常溫下具有很好的穩(wěn)定性。

附表4 各批次6h供試品的穩(wěn)定性

2.1.1.4 重現(xiàn)性實驗 為證明本試驗的重現(xiàn)性，分別稱取五份6h黑芝麻炮制品，然后以“1.2.2.1”項下方法進行提取處理后，對吸光度進行檢測，并計算各供試品的含量后，測出RSD值為3.75%（見附表5），實驗具有較好的重現(xiàn)性。

附表5 各批次6h供試品的重現(xiàn)性

2.1.1.5 加樣回收率實驗 經(jīng)測定（見附表6），兩組芝麻炮制樣品中芝麻素的加樣平均回收率為97.81%，RSD值為2.71%。

附表6 兩組6h供試品的加樣回收率

2.1.2 九制黑芝麻中黑芝麻色素的得率及色價

2.1.2.1 黑芝麻色素的提取和得率的計算根據(jù)附表7所示，各黑芝麻炮制品的得率中得知，6h為最高，5.5h次之，7h得率最少。

附表7 黑芝麻色素得率

2.1.2.2 黑芝麻黑色素最大吸收波長的確定和色價的計算 通過對黑芝麻色素供試品的全波長掃描，檢測到其最大吸收峰約在波長在207nm處（見附圖4），黑芝麻炮制品的色價隨著炮制時間的增多而減少（見附表8）。樣品5h黑芝麻色素色價最高，樣品7h黑芝麻色素色價最低。

附表8 不同批次黑芝麻色素的色價

附圖4 黑芝麻色素的紫外掃描曲線

2.1.3 九制黑芝麻最佳炮制工藝的選擇 結(jié)合上述實驗，以芝麻素的含量為主要評價指標，以黑芝麻色素的得率和色價為次要指標。其中樣品5.5h的芝麻素含量最高，黑芝麻色素的得率和色價較高；樣品5h黑芝麻色素色價最高，得率較低，芝麻素含量較高；樣品6h黑芝麻色素得率最高，色價較低，芝麻素含量較高。綜合考慮選取樣品5.5h為最優(yōu)的炮制方案。

2.2 復(fù)方黑芝麻的圓整度與重量差異結(jié)果根據(jù)正交實驗表所列的數(shù)據(jù)進行分析（見附表9），圓整度極差R值大小顯示，各因素作用主次依次：A>B>C，最佳制備工藝為A2B3C3（藥粉：煉蜜配比為1/0.45、和坨時煉蜜溫度為80℃、餳藥時間2h）；在重量差異指標當中，各因素作用主次依次：C>B>A，最佳制備工藝為A3B3C3（藥粉：煉蜜配比為1/0.5、和坨時煉蜜溫度為80℃、餳藥時間2h）。由于九組樣品均沒有超過藥典規(guī)定的重量差異限度，結(jié)合藥效和經(jīng)濟成本，故選取A2B3C3（藥粉：煉蜜配比為1/0.45、和坨時煉蜜溫度為80℃、餳藥時間2h）最優(yōu)的制劑方案。

附表9 正交實驗結(jié)果

2.3 討論本實驗采用古法九蒸九曬黑芝麻后制成大蜜丸劑，運用紫外可見光分光光度計，此方法較為成熟，能夠較為精準的測出芝麻素、黑芝麻色素等重要指標。對于這一炮制方法是否對其他有效成分作用發(fā)生改變還有待進一步研究。本次實驗中黑芝麻種類來源較單一，市售的黑芝麻種類，來源極為廣泛，對于是否能夠應(yīng)用于其他市售黑芝麻有待證實。檢驗丸劑在制備過程中，各因素相對較好，能夠?qū)⒅苿┑膱A整度、重量差異等指標控制在合格范圍內(nèi)。優(yōu)化黑芝麻丸的制備工藝，為這一制劑提供規(guī)范的制備方法和完善的質(zhì)量檢測標準。