一株太子參內(nèi)生真菌Aspergillus terreus TZS-201607中抗腫瘤活性代謝產(chǎn)物研究

胡曉峰，柴海全，賈林川，邵 露，劉曉曉，陳 野

青島市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，青島 266071

植物內(nèi)生真菌(plant endophyte)是指生活在健康植物組織體內(nèi)或生活史的某一階段生活在植物組織體內(nèi)，對宿主植物沒有引起明顯病害癥狀的一類微生物菌群[1,2]。近幾十年來，內(nèi)生真菌已被證實具有合成獨特的次級代謝產(chǎn)物的能力，成為近些年來天然產(chǎn)物領(lǐng)域研究的熱點[2]。植物內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物具有結(jié)構(gòu)多樣、活性顯著的特點。目前已從內(nèi)生真菌中發(fā)現(xiàn)了具有抑菌、殺蟲、抗腫瘤、抗氧化等活性的次級代謝產(chǎn)物，涵蓋了聚酮類(大環(huán)內(nèi)酯類、醌類、氧雜蒽酮類等)、萜類、生物堿類、肽類等多種結(jié)構(gòu)類型[3]。內(nèi)生真菌在與宿主植物長期的協(xié)同進(jìn)化過程中，能夠產(chǎn)生與宿主相同或相似的活性成分[4]。因此，藥用植物內(nèi)生真菌的研究引起了人們越來越多的關(guān)注[5-7]。特別是從植物內(nèi)生真菌中發(fā)現(xiàn)了眾多抗腫瘤先導(dǎo)化合物或藥物，如紫杉醇(taxol)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、喜樹堿(camptothecin)等，表明從藥用植物內(nèi)生真菌中發(fā)掘新的抗腫瘤活性先導(dǎo)化合物具有較大的潛力。

太子參為石竹科植物孩兒參Pseudostellariaheterophylla(Miq) Pax的干燥塊根，為我國常用傳統(tǒng)中藥，具有益氣健脾、生津潤肺等功效，用于治療肺燥干咳、自汗口渴、脾虛體倦、食欲不振等癥狀[8]。與其他藥用植物相比，關(guān)于太子參內(nèi)生真菌分離鑒定的研究較少。Cai等[9]從太子參中分離獲得18株內(nèi)生真菌，其中有6株菌株發(fā)酵產(chǎn)物具有顯著的抗腫瘤活性，3株菌株發(fā)酵產(chǎn)物具有較好的抗氧化活性。但是，目前缺乏對太子參內(nèi)生真菌活性次級代謝產(chǎn)物的深入研究。為了研究內(nèi)生真菌這一特殊的微生物資源，我們從太子參中分離獲得了12株內(nèi)生真菌，并對其次級代謝產(chǎn)物的多樣性和活性進(jìn)行了篩選分析。其中菌株AspergillusterreusTZS-201607次級代謝產(chǎn)物具有豐富的化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣性。在抗腫瘤活性篩選中，該菌株馬鈴薯葡萄糖肉湯(PDB)發(fā)酵產(chǎn)物對HeLa細(xì)胞表現(xiàn)出一定的抑制活性(48 h抑制率>50%)。為從該菌株中獲得具有抗腫瘤活性的次級代謝產(chǎn)物，本文對其化學(xué)成分及活性進(jìn)行了進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

主要儀器：UV-2700紫外分光光度計(Shimadzu公司，日本)；Agilent DD2-500 MHz型核磁共振波譜儀(Agilent公司，美國)，TMS內(nèi)標(biāo)；LTQ Orbitrap XL混合線性離子阱質(zhì)譜儀(Thermo Scientific公司，美國)；Waters Acquity UPLC超高效液相色譜儀(配置PDA二極管陣列檢測器，Waters公司，美國)；Waters 2545制備色譜儀(Waters公司，美國)；快速純化制備液相色譜Flash Isolera one(Biotage公司，瑞典)；R-100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Buchi公司，瑞士)；MD 4C NT型化學(xué)隔膜泵(Vacuubrand公司，德國)。

主要試劑：Lobar LiChroprep RP-18硅膠(40～63 μm，Merck公司，德國)；葡聚糖凝膠Sephadex LH-20(Merck公司，德國)；薄層色譜GF254硅膠預(yù)制板和柱色譜用硅膠(100～200目和200～300目，青島海洋化工廠)；色譜純級和分析純級乙腈、甲醇、二氯甲烷等有機(jī)溶劑(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 實驗樣品

供試菌株分離自2016年7月采集于臨沂市河?xùn)|區(qū)重溝鎮(zhèn)萬家湖村的太子參(標(biāo)本編號20160722A，經(jīng)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所張鵬副研究員鑒定為太子參Pseudostellariaheterophylla(Miq) Pax)。將采集的太子參經(jīng)表面消毒后，分離純化得到內(nèi)生真菌。通過形態(tài)學(xué)觀察與ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析，將供試菌株鑒定為A.terreus。菌種保存于中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院(編號：AspergillusterreusTZS-201607)。

將保藏于4 °C的菌株接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA，成分：馬鈴薯粉6 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L)平板上進(jìn)行活化，28 °C活化培養(yǎng)5～7天。然后用6 mm打孔器將菌體(含培養(yǎng)基)接種入裝有400 mL馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(PDB，成分：馬鈴薯粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖15 g/L，氯化鈉5 g/L)的1 L錐形瓶中。置于28 °C靜置培養(yǎng)30天。

1.3 提取分離

發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液與菌絲體分離。發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取3遍，經(jīng)減壓濃縮后得到粗提物A共10.6 g。菌絲體經(jīng)干燥后，采用高速分散器進(jìn)行組織破碎，然后用超聲波細(xì)胞破碎儀于95%乙醇中進(jìn)行萃取。處理3遍后獲得粗提物B共15.2 g。合并粗提物A和B得總浸膏25.8 g。

將獲得的浸膏用100～200目硅膠拌樣，經(jīng)正相硅膠柱(200～300目)采用石油醚-乙酸乙酯(30∶1→1∶1，體積比V/V)和二氯甲烷-甲醇(20∶1→1∶1，V/V)依次梯度洗脫后經(jīng)TLC和HPLC檢測合并得到6個流份(Fr.1～Fr.6)。采用活性追蹤的策略，以HeLa細(xì)胞為活性篩選模型，經(jīng)48 h細(xì)胞培養(yǎng)后進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)流分Fr.3、Fr.4和Fr.5均表現(xiàn)出一定的活性(樣品濃度為20 μg/mL時抑制率分別為62.5%、75.6%和59.3%)。因此，對上述3個流分進(jìn)行了系統(tǒng)的分離純化。流分Fr.3(1.6 g，石油醚-乙酸乙酯2∶1洗脫部分)經(jīng)二氯甲烷-甲醇(50∶1、30∶1、10∶1，V/V)梯度洗脫，合并得到3個子流分(Fr.3.1～Fr.3.3)。Fr.3.1(0.5 g)經(jīng)制備薄層層析(pTLC，展開體系為二氯甲烷-甲醇20∶1，80 mL)，然后經(jīng)Sephadex LH-20柱層析(甲醇洗脫)純化得到化合物2(5.6 mg)和15(6.3 mg)。Fr.3.2(0.2 g)使用半制備HPLC(甲醇-水45%∶55%，流速2 mL/min)分離得到化合物1(11.3 mg)。流分Fr.4(3.5 g，石油醚-乙酸乙酯1∶1洗脫部分)經(jīng)常壓Lobar LiChroprep RP-18(反相C18)柱層析，以甲醇-水梯度洗脫(10%→100%)，合并得到6個子流分(Fr.4.1～Fr.4.6)。Fr.4.3(1.0 g)經(jīng)制備薄層層析(pTLC，展開體系為二氯甲烷-甲醇15∶1，40 mL)，然后經(jīng)Sephadex LH-20柱層析(甲醇洗脫)純化得到化合物6(8.8 mg)和11(5.0 mg)。Fr.4.5(0.2 g)經(jīng)pTLC(展開體系為二氯甲烷-丙酮10∶1，40 mL)純化得到化合物5(6.2 mg)。Fr.4.6(1.3 g)經(jīng)硅膠柱層析(二氯甲烷-甲醇30∶1洗脫)，然后經(jīng)Sephadex LH-20柱層析(甲醇洗脫)純化得到化合物7(12.6 mg)、12(20.3 mg)和13(9.6 mg)。流分Fr.5(2.2 g，二氯甲烷-甲醇20∶1洗脫部分)經(jīng)反相C18柱層析，以甲醇-水梯度洗脫(10%→100%)，合并得到4個子流分(Fr.5.1～Fr.5.4)。Fr.5.2(0.2 g)使用半制備HPLC(甲醇-水35%∶65%，流速2 mL/min)分離得到化合物3(20.1 mg)。Fr.5.3(0.2 g)經(jīng)pTLC(展開體系為二氯甲烷-甲醇15∶1，40 mL)分離得到化合物4(7.8 mg)和8(9.9 mg)。Fr.5.4(1.1 g)經(jīng)硅膠柱層析(二氯甲烷-甲醇40∶1洗脫)，然后經(jīng)Sephadex LH-20柱層析(甲醇洗脫)純化得到化合物9(6.8 mg)、10(16.2 mg)、14(7.7 mg)和16(15.2 mg)。

1.4 細(xì)胞毒活性測試

采用MTT法對分離獲得的單體化合物進(jìn)行細(xì)胞毒活性測試[10]。供試腫瘤細(xì)胞包括：人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549)、人乳腺管癌細(xì)胞(BT-549)、人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)、人肝癌細(xì)胞(HepG2)、人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)和人髓系白血病單核細(xì)胞(THP-1)。上述細(xì)胞均購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。將待測樣品分別設(shè)2、4、8、16、32和64 μg/mL共6個濃度梯度。取對數(shù)生長期的細(xì)胞分別接種在96孔板上，每孔加入不同濃度化合物100 μL，培養(yǎng)24～72 h后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)。然后，每孔加入10 μL濃度為5 mg/mL的MTT，置于37 °C下反應(yīng)4 h。棄去上清液，每孔中加入150 μL的DMSO振蕩混勻。490 nm下用酶標(biāo)儀測定每孔的OD值。以表阿霉素(epirubicin)為陽性對照。計算不同化合物的IC50值。

2 結(jié)果

2.1 菌株鑒定

菌株在PDA平板上初期為白色菌絲體，后變?yōu)辄S色到褐色(圖1)。其孢子小、圓形，地毯狀，深褐色或褐色。將擴(kuò)增的ITS序列在GenBank上進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該菌株與A.terreusEBF108(MF377552.1)、A.terreusJJGG-54(MK644096.1)、A.terreusGKF25(MK713427.1)等菌株相似度均為99%。因此，鑒定該菌株為土曲霉A.terreus(GenBank序列號：MW534402)。

圖1 菌株A.terreus在PDA平板上的形態(tài)Fig.1 Morphology of strain A.terreus on PDA plate

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1淡黃色固體；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：13.21(1H，s，8-OH)，7.48(1H，t，J= 8.3 Hz，H-6)，6.81(1H，dd，J= 8.3，0.7 Hz，H-5)，6.81(1H，d，J= 7.0 Hz，H-1′)，6.74(1H，dd，J= 8.3，0.7 Hz，H-7)，6.49(1H，dd，J= 2.0，2.6 Hz，H-4′)，6.42(1H，s，H-2)，5.44(1H，t，J= 2.6 Hz，H-3′)，4.78(1H，dt，J= 7.0，2.0 Hz，H-2′)，3.98(3H，s，1-OMe)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：181.3(s，C-9)，164.5(s，C-3)，163.3(s，C-1)，162.3(s，C-8)，154.9(s，C-10a)，154.0(s，C-4a)，145.4(d，C-4′)，135.6(d，C-6)，113.2(d，C-2′)，111.2(d，C-7)，108.9(s，C-8a)，106.5(s，C-4)，105.9(s，C-9a)，105.9(d，C-5)，102.5(d，C-3′)，90.5(d，C-2)，56.8(q，1-OMe)，48.0(d，C-1′)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]中基本一致，故鑒定化合物1為雜色曲霉素(圖2)。

圖2 化合物1～16的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.2 The chemical structures of compounds 1-16

化合物2淡黃色無定形粉末；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：12.60(1H，s，8-OH)，7.19(1H，d，J= 8.9 Hz，H-6)，6.83(1H，d，J= 7.2 Hz，H-1′)，6.68(1H，d，J= 9.0 Hz，H-7)，6.49(1H，dd，J= 2.7，2.2 Hz，H-4′)，6.44(1H，s，H-2)，5.51(1H，t，J= 2.7 Hz，H-3′)，4.86(1H，d，J= 7.1 Hz，H-2′)，3.99(3H，s，1-OMe)，3.92(3H，s，5-OMe)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：181.4(s，C-9)，164.7(s，C-3)，163.5(s，C-1)，155.5(s，C-8)，154.2(s，C-10)，145.4(d，C-4′)，144.9(s，C-13)，139.6(s，C-5)，120.7(d，C-6)，113.5(d，C-1′)，109.8(d，C-7)，109.7(s，C-11)，107.0(s，C-4)，106.3(s，C-12)，102.7(d，C-3′)，90.8(d，C-2)，57.9(q，5-OMe)，57.0(q，1-OMe)，48.3(d，C-2′)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]中基本一致，故鑒定化合物2為5-甲氧基柄曲霉素。

化合物3淡黃色油狀物；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：12.65(1H，s，1-OH)，7.59(1H，t，J= 8.3 Hz，H-7)，7.30(1H，s，H-1)，6.90(1H，dd，J= 8.4，0.8 Hz，H-8)，6.79(1H，dd，J= 8.2，0.8 Hz，H-6)，5.61(1H，m，H-16)，5.09(2H，s，H-20)，4.45(2H，d，J= 7.2 Hz，H-15)，2.46(3H，s，H-14)，1.81(3H，s，H-18)，1.72(3H，s，H-19)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：184.4(s，C-13)，161.8(s，C-5)，155.6(s，C-12)，154.0(s，C-3)，152.6(s，C-9)，142.8(s，C-2)，139.1(s，C-17)，136.8(d，C-7)，134.3(s，C-4)，119.6(d，C-16)，119.4(d，C-1)，118.0(s，C-10)，110.5(d，C-8)，106.5(s，C-6)，72.2(t，C-15)，57.1(t，C-20)，25.9(q，C-18)，18.1(q，C-19)，17.7(q，C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報道基本一致，故鑒定化合物3為variecoxanthone A。

化合物4淡黃色油狀物；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：7.12(1H，d，J= 8.3 Hz，H-3)，6.58(1H，s，H-5)，6.38(1H，d，J= 8.3 Hz，H-4)，6.26(1H，d，J= 9.9 Hz，H-14)，5.43(1H，d，J= 9.9 Hz，H-15)，4.82(1H，s，H-22α)，4.60(1H，s，H-22β)，4.52(1H，br s，H-25)，4.18(1H，m，H-19α)，4.12(1H，m，H-19β)，2.33(1H，br d，J= 11.2 Hz，H-20)，2.10(3H，s，H-24)，1.69(3H，s，H-23)，0.99(3H，s，H-17)，0.93(3H，s，H-18)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：200.6(s，C-13)，161.4(s，C-10)，154.1(s，C-1)，146.4(s，C-11)，144.2(s，C-7)，142.1(s，C-21)，132.8(d，C-3)，128.3(s，C-6)，127.0(d，C-15)，126.3(s，C-12)，121.6(d，C-14)，121.3(s，C-9)，117.4(d，C-5)，113.5(s，C-8)，112.6(s，C-2)，111.7(t，C-22)，108.5(d，C-4)，76.8(s，C-16)，62.9(t，C-19)，61.5(d，C-25)，44.5(d，C-20)，27.3(q，C-17)，26.6(q，C-18)，22.2(q，C-23)，16.1(q，C-24)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報道基本一致，故鑒定化合物4為chryxanthone A。

化合物5黃色固體；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：13.54(1H，s，1-OH)，7.43(1H，d，J= 2.1 Hz，H-5)，7.19(1H，s，H-4)，6.75(1H，d，J= 2.0 Hz，H-7)，5.37(1H，d，J= 3.1 Hz，H-1′)，4.00(3H，s，8-OMe)，3.96(3H，s，6-OMe)，2.06(1H，m，H-2′α)，2.05(1H，m，H-4′α)，1.88(1H，m，H-2′β)，1.84(1H，m，H-4′β)，1.66(1H，m，H-3′α)，1.59(1H，m，H-3′β)，1.58(3H，s，H-6′)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：186.7(s，C-9)，182.5(s，C-10)，164.9(s，C-6)，162.7(s，C-8)，159.5(s，C-1)，159.5(s，C-3)，137.5(s，C-10a)，132.5(s，C-4a)，116.8(s，C-2)，115.2(s，C-8a)，110.0(s，C-9a)，107.0(d，C-4)，104.8(d，C-7)，103.9(d，C-5)，100.8(s，C-5′)，67.1(d，C-1′)，56.6(q，8-OMe)，56.0(q，6-OMe)，35.9(t，C-4′)，27.8(q，C-6′)，27.4(t，C-2′)，16.0(t，C-3′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報道基本一致，故鑒定化合物5為6,8-di-O-methylaverufin。

化合物6黃色固體；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：13.57(1H，s，1-OH)，7.43(1H，d，J= 2.4 Hz，H-5)，7.20(1H，s，H-4)，6.76(1H，d，J= 2.4 Hz，H-7)，5.24(1H，s，H-1′)，4.06(1H，d，J= 2.4 Hz，H-2′)，4.01(3H，s，8-OMe)，3.96(3H，s，6-OMe)，2.19(1H，ddd，J= 11.8，6.7，2.9 Hz，H-3′α)，1.93(1H，m，H-3′β)，1.74(2H，m，H-4′)，1.63(3H，s，H-6′)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：186.7(s，C-9)，182.4(s，C-10)，165.0(s，C-6)，162.8(s，C-8)，159.7(s，C-1)，159.2(s，C-3)，137.4(s，C-10a)，132.9(s，C-4a)，115.1(s，C-2)，114.7(s，C-8a)，110.0(s，C-9a)，107.2(d，C-4)，104.8(d，C-7)，104.0(d，C-5)，100.8(s，C-5′)，71.3(d，C-1′)，65.2(d，C-2′)，56.6(q，8-OMe)，56.0(q，6-OMe)，30.8(t，C-4′)，27.6(q，C-6′)，23.2(t，C-3′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報道基本一致，故鑒定化合物6為6,8-di-O-methylnidurufin。

化合物7黃色固體；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：13.76(1H，s，1-OH)，9.43(1H，s，3-OH)，7.39(1H，s，H-5)，7.19(1H，s，H-4)，6.73(1H，s，H-7)，4.94(1H，m，H-1′)，3.99(3H，s，8-OMe)，3.94(3H，s，9-OMe)，3.45(3H，s，1′-OMe)，1.83(1H，m，H-2′α)，1.75(1H，m，H-2′β)，1.49(1H，m，H-3′α)，1.39(1H，m，H-3′β)，1.26(2H，m，H-4′)，1.25(2H，s，H-5′)，0.86(3H，m，H-6′)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：186.7(s，C-9)，182.4(s，C-10)，164.9(s，C-6)，162.8(s，C-8)，162.2(s，C-1)，162.1(s，C-3)，137.4(s，C-10a)，133.0(s，C-4a)，119.0(s，C-2)，115.1(s，C-8a)，110.2(s，C-9a)，108.4(d，C-4)，104.8(d，C-7)，103.8(d，C-5)，79.6(d，C-1′)，58.0(q，1′-OMe)，56.6(q，8-OMe)，56.0(q，6-OMe)，34.6(t，C-2′)，31.6(t，C-4′)，25.0(t，C-3′)，22.5(t，C-5′)，14.0(q，C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報道基本一致，故鑒定化合物7為6,8,1′-tri-O-methyl averantin。

化合物8白色粉末；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：3.63(1H，m，H-3)，5.57(1H，br d，J= 4.9 Hz，H-6)，5.38(1H，br s，H-7)，0.94(3H，s，H-18)，0.63(3H，s，H-19)，1.03(3H，d，J= 6.6 Hz，H-21)，5.17,5.24(2H，dd，J= 11.2，7.6 Hz，H-22/H-23)，0.83(6H，t，J= 7.1 Hz，H-26/H-27)，0.91(3H，d，J= 6.1 Hz，H-28)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：38.4(t，C-1)，32.0(t，C-2)，70.4(d，C-3)，40.8(t，C-4)，139.8(s，C-5)，119.6(d，C-6)，116.3(d，C-7)，141.3(s，C-8)，46.2(d，C-9)，37.0(s，C-10)，21.1(t，C-11)，39.1(t，C-12)，42.8(s，C-13)，54.5(d，C-14)，23.0(t，C-15)，28.3(t，C-16)，55.7(d，C-17)，12.0(q，C-18)，16.3(q，C-19)，40.4(d，C-20)，21.1(q，C-21)，135.5(d，C-22)，132.0(d，C-23)，42.8(d，C-24)，33.1(d，C-25)，19.6(q，C-26)，19.9(q，C-27)，17.6(q，C-28)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報道基本一致，故鑒定化合物8為(22E,24R)-ergosta-7,9(11),22-trien-3β-ol。

化合物9淡黃色粉末；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.73(1H，s，H-4)，6.03(1H，d，J= 9.5 Hz，H-6)，6.60(1H，d，J= 9.5 Hz，H-7)，0.96(3H，s，H-18)，0.99(3H，s，H-19)，1.05(3H，d，J= 6.4 Hz，H-21)，5.21(1H，dd，J= 14.1，7.2 Hz，H-22)，5.24(1H，dd，J= 14.1，8.3 Hz，H-23)，0.83(6H，t，J= 7.1 Hz，H-26/H-27)，0.93(3H，d，J= 6.6 Hz，H-28)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：34.1(t，C-1)，34.2(t，C-2)，199.5(s，C-3)，123.0(d，C-4)，164.4(s，C-5)，124.4(d，C-6)，134.0(d，C-7)，124.4(s，C-8)，44.3(d，C-9)，36.8(s，C-10)，19.0(t，C-11)，35.6(t，C-12)，44.0(s，C-13)，156.1(s，C-14)，25.4(t，C-15)，27.7(t，C-16)，55.7(d，C-17)，19.0(q，C-18)，16.6(q，C-19)，39.3(d，C-20)，21.2(q，C-21)，135.0(d，C-22)，132.5(d，C-23)，42.9(d，C-24)，33.1(d，C-25)，20.0(q，C-26)，19.7(q，C-27)，17.6(q，C-28)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報道基本一致，故鑒定化合物9為(22E,24R)-ergosta-4,6,8(14),22-trtraen-3-one。

化合物10白色粉末；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：4.03(1H，m，H-3)，5.63(1H，s，H-7)，0.59(3H，s，H-18)，0.93(3H，s，H-19)，1.03(3H，d，J= 6.6 Hz，H-21)，5.15(1H，dd，J= 15.3，8.3 Hz，H-22)，5.23(1H，dd，J= 15.2，7.6 Hz，H-23)，0.82(6H，t，J= 7.0 Hz，H-26/H-27)，0.92(3H，d，J= 6.7 Hz，H-28)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：27.8(t，C-1)，30.3(t，C-2)，67.4(d，C-3)，38.7(t，C-4)，77.6(s，C-5)，198.7(s，C-6)，119.7(d，C-7)，165.6(s，C-8)，38.8(s，C-9)，42.8(s，C-10)，27.8(t，C-11)，33.0(t，C-12)，44.7(s，C-13)，55.8(d，C-14)，22.5(t，C-15)，27.7(t，C-16)，56.0(d，C-17)，12.7(q，C-18)，16.4(q，C-19)，40.3(d，C-20)，21.1(q，C-21)，135.0(d，C-22)，132.4(d，C-23)，43.8(d，C-24)，33.0(d，C-25)，19.6(q，C-26)，19.9(q，C-27)，17.6(q，C-28)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報道基本一致，故鑒定化合物10為(22E,24R)-3β,5α-dihydroxy-ergosta-7,22-dien-6-one。

化合物11白色粉末；1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：3.95(1H，m，H-3)，5.64(1H，s，H-7)，0.67(3H，s，H-18)，0.99(3H，s，H-19)，1.06(3H，d，J= 6.6 Hz，H-21)，5.24(1H，dd，J= 15.3，8.0 Hz，H-22)，5.30(1H，dd，J= 15.3，7.4 Hz，H-23)，0.85(6H，t，J= 6.9 Hz，H-26/H-27)，0.95(3H，d，J= 6.8 Hz，H-28)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：26.3(t，C-1)，31.2(t，C-2)，67.0(d，C-3)，37.6(t，C-4)，79.9(s，C-5)，197.9(s，C-6)，120.5(d，C-7)，163.4(s，C-8)，75.4(s，C-9)，42.4(s，C-10)，29.2(t，C-11)，35.8(t，C-12)，45.7(s，C-13)，52.2(d，C-14)，23.0(t，C-15)，28.7(t，C-16)，56.8(d，C-17)，12.5(q，C-18)，20.6(q，C-19)，41.2(d，C-20)，21.5(q，C-21)，136.3(d，C-22)，133.0(d，C-23)，43.7(d，C-24)，33.8(d，C-25)，20.0(q，C-26)，20.3(q，C-27)，18.1(q，C-28)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報道基本一致，故鑒定化合物11為(22E,24R)-3β,5α,9α-trihydroxy-ergosta-7,22-diene-6-one。

化合物12白色粉末；1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：4.27(1H，m，H-3)，5.44(1H，d，J= 4.9 Hz，H-4)，6.18(1H，d，J= 9.7 Hz，H-6)，5.88(1H，d，J= 9.7 Hz，H-7)，0.99(3H，s，H-18)，0.84(3H，s，H-19)，1.07(3H，d，J= 6.7 Hz，H-21)，5.26(1H，dd，J= 14.9，7.4 Hz，H-22)，5.30(1H，dd，J= 14.7，6.7 Hz，H-23)，0.86(3H，d，J= 6.8 Hz，H-26)，0.87(3H，d，J= 6.8 Hz，H-27)，0.95(3H，d，J= 6.8 Hz，H-28)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：30.4(t，C-1)，26.9(t，C-2)，44.3(d，C-3)，124.1(d，C-4)，146.4(s，C-5)，127.2(d，C-6)，126.5(d，C-7)，125.8(s，C-8)，46.4(d，C-9)，36.5(s，C-10)，20.3(t，C-11)，37.6(t，C-12)，44.4(s，C-13)，149.8(s，C-14)，25.3(t，C-15)，28.7(t，C-16)，57.0(d，C-17)，19.6(q，C-18)，17.8(q，C-19)，40.3(d，C-20)，21.7(q，C-21)，136.5(d，C-22)，133.0(d，C-23)，43.9(d，C-24)，33.9(d，C-25)，20.1(q，C-26)，20.4(q，C-27)，18.2(q，C-28)，158.6(s，C-29)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報道基本一致，故鑒定化合物12為(22E,24R)-3α-ureido-ergosta-4,6,8(14),22-tetraene。

化合物13白色粉末；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：3.75(1H，m，H-3)，3.58(1H，br s，H-6)，5.06(1H，m，H-7)，0.52(3H，s，H-18)，0.89(3H，s，H-19)，0.97(3H，d，J= 6.5 Hz，H-21)，5.15(1H，dd，J= 15.3，8.1 Hz，H-22)，5.21(1H，dd，J= 15.3，7.2 Hz，H-23)，0.79(6H，t，J= 6.6 Hz，H-26/H-27)，0.87(3H，d，J= 6.8 Hz，H-28)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：31.6(t，C-1)，32.9(t，C-2)，66.4(d，C-3)，40.6(t，C-4)，74.9(s，C-5)，72.6(d，C-6)，119.9(d，C-7)，140.1(s，C-8)，42.7(d，C-9)，37.1(s，C-10)，21.8(t，C-11)，40.6(t，C-12)，43.4(s，C-13)，54.6(d，C-14)，23.0(t，C-15)，28.2(t，C-16)，55.8(d，C-17)，12.5(q，C-18)，18.2(q，C-19)，40.5(d，C-20)，21.4(q，C-21)，135.8(d，C-22)，131.8(d，C-23)，42.5(d，C-24)，32.9(d，C-25)，20.2(q，C-26)，19.9(q，C-27)，17.7(q，C-28)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報道基本一致，故鑒定化合物13為(22E,24R)-ergosta-7,22-dien-3β,5α,6β-triol。

化合物14白色粉末；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：3.93(1H，m，H-3)，6.48(1H，d，J= 8.5 Hz，H-6)，6.22(1H，d，J= 8.5 Hz，H-7)，0.79(3H，s，H-18)，0.82(3H，s，H-19)，0.89(3H，d，J= 6.8 Hz，H-21)，5.12(1H，dd，J= 15.3，8.3 Hz，H-22)，5.20(1H，dd，J= 15.3，7.6 Hz，H-23)，0.80(3H，d，J= 6.8 Hz，H-26)，0.88(3H，d，J= 6.8 Hz，H-27)，0.98(3H，d，J= 6.6 Hz，H-28)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：34.7(t，C-1)，30.0(t，C-2)，66.3(d，C-3)，39.3(t，C-4)，82.2(s，C-5)，135.2(d，C-6)，130.7(d，C-7)，79.4(s，C-8)，51.6(d，C-9)，36.9(s，C-10)，20.6(t，C-11)，36.9(t，C-12)，44.5(s，C-13)，51.6(d，C-14)，23.4(t，C-15)，28.6(t，C-16)，56.1(d，C-17)，12.9(q，C-18)，18.2(q，C-19)，39.7(d，C-20)，20.9(q，C-21)，135.4(d，C-22)，132.2(d，C-23)，42.7(d，C-24)，33.0(d，C-25)，19.6(q，C-26)，19.9(q，C-27)，17.6(q，C-28)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報道基本一致，故鑒定化合物14為(22E,24R)-5α,8α-epidioxyergosta-6,22-dien-3β-ol。

化合物15白色固體；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：5.74(1H，d，J= 1.2 Hz，H-2)，0.52(3H，s，H-12)，0.98(3H，d，J= 6.6 Hz，H-14)，5.17(1H，dd，J= 15.3，8.2 Hz，H-15)，5.25(1H，dd，J= 15.3，7.4 Hz，H-16)，0.79(6H，t，J= 7.0 Hz，H-19/H-20)，0.88(3H，d，J= 6.8 Hz，H-21)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：171.1(s，C-1)，112.0(d，C-2)，171.1(s，C-3)，105.5(s，C-4)，35.2(t，C-5)，35.4(t，C-6)，48.7(s，C-7)，50.3(d，C-8)，21.3(t，C-9)，29.0(t，C-10)，55.1(d，C-11)，11.9(q，C-12)，40.0(d，C-13)，21.3(q，C-14)，135.4(d，C-15)，132.2(d，C-16)，42.5(d，C-17)，32.9(d，C-18)，19.9(q，C-19)，20.2(q，C-20)，17.8(q，C-21)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]報道基本一致，故鑒定化合物15為demethylincisterol A3。

化合物16白色固體；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：6.01(1H，s，H-2)，0.54(3H，s，H-12)，0.98(3H，d，J= 6.6 Hz，H-14)，5.17(1H，dd，J= 15.3，8.2 Hz，H-15)，5.25(1H，dd，J= 15.3，7.5 Hz，H-16)，0.79(6H，t，J= 7.2 Hz，H-19/H-20)，0.88(3H，d，J= 6.8 Hz，H-21)，2.99(3H，s，OCH3)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：170.4(s，C-1)，114.7(d，C-2)，169.1(s，C-3)，107.7(s，C-4)，34.6(t，C-5)，35.0(t，C-6)，48.7(s，C-7)，50.6(d，C-8)，21.1(t，C-9)，28.9(t，C-10)，55.1(d，C-11)，12.0(q，C-12)，40.0(d，C-13)，21.2(q，C-14)，135.4(d，C-15)，132.3(d，C-16)，42.5(d，C-17)，32.9(d，C-18)，19.9(q，C-19)，20.3(q，C-20)，17.8(q，C-21)，50.1(q，OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]報道基本一致，故鑒定化合物16為(17R)-17-methylincisterol。

2.3 細(xì)胞毒活性測試結(jié)果

將分離獲得的化合物1～16進(jìn)行了細(xì)胞毒活性測試。以抗生素類抗腫瘤藥表阿霉素(epirubicin)為陽性對照，以A549、BT-549、HeLa、HepG2、MCF-7和THP-1為供試細(xì)胞，活性結(jié)果見表1?；衔?～7、12、14～16對不同的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出一定活性。其中，蒽醌類化合物6對A549和BT-549表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，IC50值分別為9.8 ± 0.2和9.8 ± 1.3 μM。蒽醌類化合物7對HeLa表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，IC50值為9.9 ± 1.1 μM。甾醇類化合物14對THP-1表現(xiàn)出較強(qiáng)的活性，IC50值為9.0 ± 0.5 μM。

表1 化合物的細(xì)胞毒活性

3 討論與結(jié)論

藥用植物與其內(nèi)生真菌通過長期的協(xié)同進(jìn)化，形成了獨特的互惠共生關(guān)系。其中，宿主植物為真菌提供生長、保護(hù)場所和營養(yǎng)環(huán)境，而內(nèi)生真菌通過合成次級代謝產(chǎn)物促進(jìn)植物的生長及防御。由于這些次級代謝產(chǎn)物具有顯著的生物活性，極具新藥開發(fā)前景，因此藥用植物內(nèi)生真菌資源已被證實是一個亟待開發(fā)的寶庫。近30年來，已經(jīng)從數(shù)百種藥用植物，如寧前胡、川芎、夾竹桃等，分離純化了大量的內(nèi)生真菌，表明藥用植物中蘊(yùn)含著豐富的內(nèi)生真菌資源。太子參作為我國常用傳統(tǒng)中藥，其關(guān)于內(nèi)生真菌分離鑒定的研究較少，目前僅從中分離獲得了18株內(nèi)生真菌[9]。因此，太子參內(nèi)生真菌資源有待進(jìn)一步深入發(fā)掘。

藥用植物內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)多樣的活性次級代謝產(chǎn)物，其中相當(dāng)部分的次級代謝產(chǎn)物具有抗腫瘤藥理活性，表現(xiàn)出潛在的應(yīng)用價值。這些代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類型包括生物堿類、甾體類、萜類、黃酮類、蒽醌類等。蒽醌是天然醌類化合物中數(shù)量最多也是最重要的一類化合物，具有重要的生物活性，尤其抗腫瘤活性。其具有天然低毒、高效的特點，引起了研究人員廣泛的關(guān)注。為了研究太子參內(nèi)生真菌并從中獲得活性顯著的次級代謝產(chǎn)物，特別是發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性的化合物，本研究采用多種色譜技術(shù)從太子參內(nèi)生真菌A.terreusTZS-201607中分離純化得到16個化合物，分別為口山酮(化合物1～4)、蒽醌(化合物5～7)以及甾醇(化合物8～16)類化合物。本研究報道的化合物1～7、12、14～16為首次從內(nèi)生真菌A.terreus中分離獲得。在體外抗腫瘤活性測試中，化合物6、7和14對人腫瘤細(xì)胞株A549、BT-549、HeLa和THP-1表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性(IC50<10 μM)。本研究豐富了太子參內(nèi)生真菌資源多樣性，在一定程度上豐富了真菌A.terreus次級代謝產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)類型和生物活性。同時，本研究發(fā)現(xiàn)了抗腫瘤活性顯著的蒽醌類化合物，為后續(xù)藥物先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)和研究提供了化合物實體。