海洋來源硫酸多糖體外抗氧化活性作用的初步研究

楊文盛，袁春紅，韓 華*

1同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092；2巖手大學(xué)農(nóng)學(xué)部食料生產(chǎn)環(huán)境學(xué)科，巖手 020-8550

活性氧(reactive oxygen species，ROS)系氧代謝的天然次級(jí)產(chǎn)物，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和體內(nèi)平衡中充當(dāng)重要的“氧化還原信使”。近年研究表明，ROS與許多病理生理現(xiàn)象密切相關(guān)，如腫瘤、炎癥、衰老、體循環(huán)失調(diào)等，而當(dāng)體內(nèi)氧化和抗氧化動(dòng)態(tài)平衡被打破，機(jī)體過負(fù)荷的ROS攻擊靶器官，觸發(fā)不飽和烷基自由基引發(fā)的鏈?zhǔn)阶杂苫磻?yīng)，所形成的過氧化物可造成細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，破壞核酸主鏈及蛋白質(zhì)多肽鍵，而致細(xì)胞凋亡[1,2]?？寡趸瘎┌磥碓从刑烊缓腿斯ず铣芍?。天然來源抗氧化劑如生育酚、類黃酮、硫酸多糖等，合成抗氧化劑如叔丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)、沒食子酸丙酯(PG)、丁基化羥基甲苯(BHT)、丁基化羥基茴香醚(BHA)等。人工合成的抗氧化劑對(duì)肝、腎具有一些較為嚴(yán)重毒副作用，在使用上存在安全隱患[3,4]，而天然抗氧化劑可避免這些副作用。由此，對(duì)自由基失衡相關(guān)疾病的防治而言，發(fā)現(xiàn)能有效阻斷氧自由基反應(yīng)且毒副作用較低的天然抗氧化劑具有重要意義。海洋生物因含有多種營(yíng)養(yǎng)成分和生理活性物質(zhì)而倍受人們的重視，其中有些成分是陸生植物所沒有的。在研究中人們發(fā)現(xiàn)，以海藻、海參等為代表的海洋生物廣泛存在著天然抗氧化活性物質(zhì)，其組織中有許多直接通過清除自由基或提高機(jī)體自身抗氧化防御體系的自由基清除劑和抗氧化劑[5,6]。為此，本文擬從三種海藻(紫菜、裙帶菜、羊棲菜)及一種海參(糙海參)生物活性物質(zhì)的提取開始，對(duì)它們進(jìn)行系統(tǒng)的分離與檢測(cè)，重點(diǎn)研究這幾種海洋來源硫酸多糖的抗氧化作用，從中篩選出具有抑制自由基及多酚氧化酶活性的抗氧化物質(zhì)，以期拓展藥用天然抗氧化劑的生物資源。

1 材料與方法

1.1 試劑及生物材料

鄰苯二酚、鄰苯三酚、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無水乙醇、正丁醇、三氯甲烷(CHCl3)、石油醚、冰醋酸(HAc)、Briji35、Tris、維生素C(VC)、維生素E(VE)、茶多酚(tea polyphenols，TP)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，碘化鉀(KI)、硫代硫酸鈉(Na2S2O3)、鹽酸、重鉻酸鉀、可溶性淀粉等購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，均為分析純。紫菜(Porphyra)、羊棲菜(Sargassumfusiforme)、裙帶菜(Undariapinnatifida)、糙海參(Holothuriascabra)、烏賊墨(sepia)等為市購(gòu)，用水漂洗，去除表面污物雜質(zhì)，晾干備用。豬肉市售，小火熬出豬油，待降溫后過濾，備用。

1.2 硫酸多糖粗提物的制備

三種海藻多糖的提取參照文獻(xiàn)[7,8]。裙帶菜(干重680 g)粉碎，無水乙醇常溫浸提三次，每次24 h，過濾，保留殘?jiān)?。取殘?jiān)s150 g，HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至3，在90 ℃熱水浴提取5 h，得水提液。30%乙醇溶液多次離心去除海藻酸，合并上清液，60%乙醇溶液攪拌，靜置、離心、沉淀，真空冷凍干燥得裙帶菜硫酸多糖(sulfated polysaccharide fromU.pinnatifida，UPSP)粗品。紫菜(干重900 g)粉碎后同上法浸提，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，合并后制成浸膏，Sevag法脫蛋白[8]，凍干后可得紫菜硫酸多糖(sulfated polysaccharide fromPorphyra，PSP)粗品。羊棲菜(干重1 000 g)粉碎過篩(40目)，80 ℃熱水浴提取兩次，每次3 h，合并提取液，濃縮離心，得上清后濃縮成浸膏，凍干后得水提羊棲菜硫酸多糖(sulfated polysaccharide fromS.fusiforme，SFSP)。海參多糖的提取參照Wang等[9]的方法。糙海參(干重6 500 g)粉碎，用70%乙醇冷浸提取三次，每次7天，回收乙醇得流浸膏。分散在水中，不同極性溶劑依次萃取，得石油醚相和正丁醇相，后者減壓濃縮，大孔樹脂柱脫鹽得粗提多糖，再經(jīng)Sephadex LH-20葡聚糖凝膠過濾純化，得糙海參硫酸多糖(sulfated polysaccharide fromH.scabra，HSSP)。

1.3 硫酸多糖含量的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[10]使用苯酚-硫酸法測(cè)定硫酸多糖的含量，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品的硫酸多糖含量(見表1)。

表1 四種海洋來源硫酸多糖的粗提結(jié)果

1.4 抗氧化活性檢測(cè)

1.4.1 過氧化值(POV)法測(cè)定抗氧化活性

稱取80 g豬油，與0.2 g的各待測(cè)物混合，制成濃度為0.25%的油脂溶液，置于60±2 ℃的烘箱中。在各時(shí)間點(diǎn)分別取出適量轉(zhuǎn)移至碘量瓶中，以CHCl3-HAc/飽和KI體系放置暗處反應(yīng)3 min，Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液(N，mol/L)滴定，至淡黃色時(shí)，加入淀粉指示劑(1%)后繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失為終點(diǎn)，記錄下消耗Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(V)。使用公式計(jì)算過氧化率：POV = (V×N× 0.126 9/m) × 100%；其中：m為樣品的質(zhì)量(g)，0.126 9為1 mL Na2S2O3(1 mol/L)相當(dāng)于碘的質(zhì)量(g)數(shù)值[11]。VC和VE為陽性對(duì)照，不加干預(yù)物的豬油為空白對(duì)照(control，Con)。

1.4.2 DPPH法測(cè)定抗氧化活性

分別準(zhǔn)確稱取各受試樣品于容量瓶中溶解并定容至刻度線，配置溶液用于抗氧化活性的測(cè)定。分別量取樣品溶液及DPPH溶液各2 mL于比色皿中，靜置反應(yīng)，于517 nm處測(cè)定吸光度(Ai)。設(shè)立對(duì)照并測(cè)定：溶劑與DPPH溶液體系(陰性對(duì)照，Ac)，受試樣品與溶劑體系(空白對(duì)照，Aj)[12,13]。計(jì)算清除率：I = [1 - (Ai-Aj)/Ac] × 100%。VC和VE為陽性對(duì)照。

1.4.3 多酚氧化酶(PPO)法測(cè)定抗氧化活性

取烏賊墨以1∶5的比例加入磷酸鈉緩沖液(0.05 mol/L，pH7.2)，在4 ℃攪拌提取1 h，冷凍離心，上清液為粗提PPO，利用鄰苯二酚/磷酸緩沖液體系(30 ℃)評(píng)價(jià)PPO酶活性，并于420 nm測(cè)定加入樣品后PPO酶活性的變化[14,15]。PPO抑制率為：I = (1 -ΔA1/ΔA2) × 100%；其中：ΔA1為樣品吸光度變化值、ΔA2為酶吸光度變化值。VC和TP為陽性對(duì)照。

1.4.4 超氧陰離子自由基體系測(cè)定抗氧化活性

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)以mean ± SD表示，每個(gè)實(shí)驗(yàn)處理組均為三個(gè)重復(fù)。使用GraphPad Prism(ver.8.0，GraphPad Software Inc.，San Diego，CA，USA)計(jì)算相應(yīng)的IC50值，SPSS Program(ver.25.0，SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用One way ANOVA with Dunnett’s test進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。設(shè)α= 0.05，P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

2 結(jié)果

2.1 UPSP的抗氧化活性

提取得UPSP粗品8.189 2 g，硫酸多糖含量90.12%。由此，對(duì)UPSP進(jìn)行POV測(cè)定。結(jié)果表明，UPSP可抑制豬油的過氧化，具有顯著的抗氧化效果(見圖1、2，P<0.05)。同時(shí)，DPPH法的結(jié)果顯示，UPSP有非常明顯的自由基清除作用(IC50為2.72 mg/mL)，見表2；當(dāng)UPSP濃度增加至20 mg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH·清除率接近100%(見圖3)。超氧陰離子自由基的測(cè)試結(jié)果證實(shí)了UPSP對(duì)自由基的抑制活性(見圖4)。為了進(jìn)一步探討UPSP的抗氧化作用，以PPO法進(jìn)一步表征。隨著濃度的上升，UPSP對(duì)PPO的抑制率逐漸提高，當(dāng)濃度達(dá)到0.1 mg/mL時(shí)達(dá)到31.20%，表明UPSP具有抑制PPO的抗氧化活性，但作用有限(見圖5)?？傮w來看，UPSP仍可為一種優(yōu)良的抗氧化劑。

圖1 四種海洋硫酸多糖不同孵育天數(shù)對(duì)豬油過氧化值的影響Fig.1 Effects of four marine sulfated polysaccharides on POV in different incubation days注：各受試物的濃度為0.25 g/kg。Note:Csample = 0.25 g/kg.

圖2 截至第6日豬油過氧化值的凈增長(zhǎng)Fig.2 Net increase of POV up to day 6 注：各受試物的濃度為0.25 g/kg；與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。Note:Csample = 0.25 g/kg;Compared with Con,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

表2 四種海洋來源硫酸多糖對(duì)自由基及多酚氧化酶的抑制作用

續(xù)表2(Continued Tab.2)

圖3 四種海洋硫酸多糖對(duì)穩(wěn)定自由基的清除作用Fig.3 Scavenging effects of four marine sulfated polysaccharides on DPPH·

圖4 四種海洋硫酸多糖對(duì)超氧陰離子自由基的影響Fig.4 Effects of four kinds of marine sulfated polysaccharides on superoxide anion radicals

圖5 四種海洋硫酸多糖對(duì)多酚氧化酶的抑制作用Fig.5 Inhibition of four marine sulfated polysaccharides on PPO

2.2 PSP及SFSP的抗氧化活性

提取得PSP粗品14.532 1 g，SFSP粗品81.001 4 g，多糖含量分別為86.74%及89.24%。將這些粗提硫酸多糖進(jìn)行抗氧化活性的測(cè)定。POV結(jié)果顯示，PSP在前3日對(duì)豬油的過氧化抑制不理想，第3日之后開始明顯抑制豬油的過氧化，第6日時(shí)抑制作用更為顯著(見圖1，P<0.05)，表明紫菜提取的多糖類物質(zhì)對(duì)豬油有優(yōu)良的抗氧化效果。為此，通過DPPH法分析PSP是否有清除自由基的作用。結(jié)果顯示，PSP對(duì)DPPH·的IC50為8.97 mg/mL，當(dāng)PSP濃度在0～10 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·清除率隨濃度明顯提高；但大于10 mg/mL時(shí)，DPPH·清除率的增長(zhǎng)開始放緩(見圖3)。另外，PPO及超氧陰離子自由基的結(jié)果也表明了PSP與濃度正相關(guān)的抗氧化效果(見圖4、5)。而SFSP也同樣發(fā)現(xiàn)具有降低豬油過氧化率，抑制自由基及抑制多酚氧化酶活性的作用，其中，對(duì)超氧陰離子自由基的IC50為0.17 mg/mL，優(yōu)于UPSP與PSP。

2.3 HSSP的抗氧化活性

大孔樹脫鹽的粗提物經(jīng)葡聚糖凝膠過濾純化，得正丁醇相HSSP粗品75.802 1 g，硫酸多糖含量88.73%。該多糖可顯著抑制豬油的過氧化(見圖2，P<0.05)，并明顯抑制多酚氧化酶的活性(見圖5)，也具有一定抗氧化活性(IC50= 0.20 mg/mL)。超氧陰離子自由基的測(cè)試結(jié)果顯示，HSSP對(duì)鄰苯三酚的抑制率隨濃度的增大而增大，且在濃度為0.01 g/mL時(shí)接近100%，與VC類似，這說明此體系下HSSP對(duì)鄰苯三酚的自氧化有很強(qiáng)的抑制作用(見圖4)，抗氧化性較好(IC50= 0.05 mg/mL)。HSSP也具有清除DPPH·的抗氧化活性，但作用不及其他三種硫酸多糖(見圖3)?？偟内厔?shì)表明，HSSP也具有良好的抗氧化活性。

3 討論

多糖是一種由十個(gè)以上單糖通過糖苷鍵鏈接的高分子聚合物，有廣泛的藥理活性。大量研究表明，這種高效低毒的自由基清除劑保護(hù)機(jī)體免受氧損傷，具有清除體內(nèi)超氧陰離子、穩(wěn)定自由基及其他ROS的抗氧化作用，從而參與機(jī)體抗血栓、降血脂、降血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎、抗衰老等多種重要的生理病理進(jìn)程[5,16]。在我們的研究結(jié)果中，UPSP與PSP表現(xiàn)出一定的抗氧化作用，而結(jié)合SFSP和HSSP的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)這幾種海洋來源的硫酸多糖在清除自由基方面確有明顯效果，提示這些硫酸多糖可能具有抗炎、抗衰老等方面[15]的活性。近年來天然來源多糖的抗氧化作用有一定的報(bào)道，其中陸生植物及中藥來源的仍占一定比例，而海洋來源多糖主要多見藻類來源，海參來源的報(bào)道較為少見[5,17,18]。本研究結(jié)果表明，這些海藻、海參來源的硫酸多糖可通過清除穩(wěn)定自由基及超氧陰離子，并抑制多酚氧化酶活性，從而發(fā)揮抗氧化的作用。后續(xù)擬針對(duì)這些硫酸多糖的組成和結(jié)構(gòu)，及其跟ROS和多酚氧化酶抑制活性之間的關(guān)系進(jìn)行研究，進(jìn)一步從體內(nèi)水平探究它們提高機(jī)體抗氧化能力的作用機(jī)制?？傊?，本研究通過這四種體系的檢測(cè)，得到了良好的抗氧化活性數(shù)據(jù)，表明這幾種海洋來源的硫酸多糖具有開發(fā)為藥用和保健功能的天然高效抗氧化劑的潛力，從而應(yīng)用于食品、藥品及食品添加劑等方面。