液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蜂蜜中甲硝唑和地美硝唑的含量

□ 張黎梅 許 秦 鄭世妍 汪云飛 昆明市食品藥品檢驗(yàn)所

蜂蜜是一種高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的食品，深受人們的喜愛，因此蜂蜜中有害物質(zhì)的殘留給人體健康帶來(lái)的危害也引起了人們廣泛的關(guān)注。蜂蜜中殘留的甲硝唑和地美硝唑等硝基咪唑類藥物嚴(yán)重危害著人們的健康。硝基咪唑類藥物具有抗原蟲和抗厭氧菌活性，主要用于預(yù)防和治療畜禽組織滴蟲病和豬密螺旋體性痢疾、阿米巴原蟲以及厭氧菌感染等疾病[1]。長(zhǎng)期攝入硝基咪唑類藥物具有致突變性和潛在的致癌性，如果在動(dòng)物中使用會(huì)對(duì)動(dòng)物源性食品安全構(gòu)成威脅。被歐盟，美國(guó)、加拿大等多個(gè)國(guó)家列為違禁藥物[2]，食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) GB 31650-2019[3]規(guī)定，地美硝唑和甲硝唑允許作治療用，但不得在食品中檢出獸藥。

我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23410-2009[4]提出了液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測(cè)定蜂蜜中硝基咪唑類藥物及其代謝物殘留量的測(cè)定，但在研究中發(fā)現(xiàn)使用該方法測(cè)定，甲硝唑和地美硝唑的回收率不高，本文在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上進(jìn)一步選擇優(yōu)化前處理等步驟，建立了同時(shí)檢測(cè)蜂蜜中甲硝唑和地美硝唑的含量方法。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

LCMS-8045型高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司）、超純水儀（sartorius公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）、CP224C型分析天平（奧豪斯儀器（上海）有限公司）

1.1.2 試劑

乙酸乙酯、甲醇、乙酸銨均為色譜純（賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司）；甲硝唑（0.25 g，德國(guó)Dr公司）；地美硝唑（0.25 g，德國(guó)Dr公司）

1.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及方法

1.2.1 甲硝唑、地美硝唑標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制

準(zhǔn)確稱取0.011 42 g甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)品、0.010 18 g地美硝唑標(biāo)準(zhǔn)品分別置于100 mL容量瓶中，用甲醇定容得 到114.2 μg/mL、101.8 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶 液0.01 mL、0.05 mL、0.1 mL、 0.2 mL、0.5 mL和1.0 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇-水定容至刻度。

1.2.2 樣品提取

準(zhǔn)確稱取混合均勻的樣品10.00 g（精確到0.01 g）試樣，放置于50 mL具塞離心管中，加入10 mL飽和氯化鈉水溶液，渦旋混勻。后加入15 mL 乙酸乙酯渦旋5 min，超聲提取 10 min。再以3 500 r/min離心 5 min，取上層乙酸乙酯到50 mL雞心瓶中，再加入10 mL乙酸乙酯，重復(fù)上述提取步驟，合并提取液，40 ℃水浴旋至近干，加入5 mL甲醇溶解殘?jiān)?，然后過(guò)經(jīng)甲醇預(yù)淋洗的SPE柱凈化，加入10 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，40 ℃水浴旋至近干，甲醇-水溶解定容至1 mL，待測(cè)。

1.2.3 儀器條件

液相色譜條件：液相色譜-質(zhì)譜儀(串聯(lián)四級(jí)桿)：配有電噴霧離子源；色譜柱：C18柱，100 mm×3.0 mm， 粒徑1.7 μm；流動(dòng)相：A相為 10 mmol/L的乙酸銨溶液，B相為甲醇溶液；梯度洗脫，流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧離子源（Electrospray ionization，ESI源）；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；掃描方式：采用正離子模式掃描。質(zhì)譜條件如表1所示。

表1 甲硝唑和地美硝唑質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)圖譜

通過(guò)不同的比例梯度程序來(lái)考察兩組分的出峰、峰形、色譜分離情況，最終選擇1.2.3的色譜條件，分離效果見圖1。

圖1 甲硝唑和地美硝唑多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖

2.2 線性關(guān)系

對(duì)濃度范圍為1～100 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)序列工作液按選定的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)做線性回歸方程。由表2可知，甲硝唑和地美硝唑在1～100 ng/mL范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r2均在0.999以上。

表2 甲硝唑和地美硝唑的回歸方程和相關(guān)系數(shù)

2.3 回收率、精密度和檢測(cè)限

稱取蜂蜜樣品10.00 g（精確至 0.01 g），加入甲硝唑（114.2 μg/mL）、地美硝唑（101.8μg/mL）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液20 μL、30 μL、80 μL。按 照 上文所述提取方法處理樣品，上機(jī)檢測(cè)，根據(jù)測(cè)定濃度與加入量之間的差異來(lái)計(jì)算其回收率，回收率在78.57%～116.02%。甲硝唑和地美硝唑的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值分別為：3.406%、4.081%，檢測(cè)限分別為 0.27 μg/kg和0.38 μg/kg。詳見表3

表3 甲硝唑和地美硝唑的回收率、精密度和檢測(cè)限

2.4 樣品的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)通對(duì)市場(chǎng)購(gòu)買的4種蜂蜜（大姚野壩子蜂蜜，冠生園蜂蜜，老山蜂蜜，洋槐蜂蜜）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，均未檢出甲硝唑和地美硝唑。

3 結(jié)果分析

3.1 提取液的選擇

因硝基咪唑類藥物具有酸、堿兩性，在弱堿性條件下以分子狀態(tài)游離，所以，一般常用于硝基咪唑類藥物的提取劑主要有二氯甲烷、乙腈、甲醇和乙酸乙酯。由于二氯甲烷毒性較大，為盡可能的保證實(shí)驗(yàn)安全，選擇使用乙酸乙酯為本實(shí)驗(yàn)的提取劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出乙酸乙酯提取各樣品分離效果較為理想且回收率也較高。

3.2 前處理方法的優(yōu)化

蜂蜜種類繁多，粘度差異較大，對(duì)于無(wú)結(jié)晶的樣品，攪拌均勻取樣，對(duì)于有結(jié)晶的固態(tài)樣品，應(yīng)在低于 60 ℃水浴中加熱，不斷攪拌，樣品均勻后再取樣。以保證樣品均勻性，減小平行測(cè)定結(jié)果的誤差。

4 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定甲硝唑和地美硝唑的方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：甲硝唑與地美硝唑在1～100 ng/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均為r2=0.999?；厥章蕿?8.57%～116.02%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.406%～4.081%，檢出限（S/N=3）為0.27 μg/kg、0.38 μg/kg，結(jié)果較為理想。本實(shí)驗(yàn)前處理較為簡(jiǎn)單，回收率，精密度，檢出限較好，能夠快速，準(zhǔn)確地測(cè)定蜂蜜中的甲硝唑與地美硝唑含量。