HPLC法同時測定清火抗毒丸中三種成分的含量

郭慧青 趙穎 高振東 張旭東 顧艷麗 徐佳璐 謝宇鑫

【摘 要】 目的：創(chuàng)建HPLC 法同時測定清火抗毒丸中龍膽苦苷、梔子苷、黃芩苷的含量。方法：色譜柱選擇ODS-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相選擇甲醇-0.1%磷酸水溶液進行梯度洗脫，流速選擇1 mL·min-1，柱溫為30 ℃，波長選擇254 nm。結(jié)果：龍膽苦苷、梔子苷、黃芩苷分別在8.6～86 μg·mL-1（r=0.9999）、4.4～44 μg·mL-1（r=1）、5.5～55 μg·mL-1 （r=0.9998）范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。龍膽苦苷、梔子苷、黃芩苷的平均加樣回收率依次為101.24%（RSD=1.06%），98.64%（ RSD=1.04%），99.38%（ RSD=0.45%）。結(jié)論：該方法不僅簡單易行而且重復性好，其構(gòu)建的標準有助于清火抗毒丸的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 清火抗毒丸;龍膽苦苷;梔子苷;黃芩苷;含量測定

【中圖分類號】R284.2 ? 【文獻標志碼】 A ? ?【文章編號】1007-8517（2021）11-0033-04

Abstract：Objective To establish a HPLC method for simultaneous determination of gentiopicroside， geniposide and baicalin in Qinghuo Kangdu Pills. Methods The analytical column was ODS-C18 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）， methanol-0.1% H3PO4 was mobile phase;gradient; the flow rate was 1 mL·min-1， the column temperature was 30 ℃， and the detection wavelength was 254 nm. Results The linear range was 8.6-86 μg·mL-1（r=0.9999） for gentiopicroside， 4.4～44 μg·mL-1（r=1）for geniposide and 5.5～55 μg·mL-1（r=0.9998） for baicalin. The average recovery of gentiopicroside， geniposide and baicalin was 101.24%（RSD=1.06%），98.64%（ RSD=1.04%） and 99.38%（ RSD=0.45%） . Conclusion The method is simple， and repeatable， which can be used to determine the contents of three key constituents in Qinghuo Kangdu Pill at the same time， and it is a good method to control the quality of Qinghuo Kangdu Pill.

Keywords：Qinghuo Kangdu Pill; Gentiopicroside; Geniposide; Scutellaria Baicalensis; Content Determinat

清火抗毒丸是巴彥淖爾市眼科醫(yī)院中醫(yī)醫(yī)師常用且效果良好的內(nèi)服組方，由梔子、龍膽、黃芩、黃連和黃柏等十三味藥組成，具有抗菌、抗炎、解毒、清熱等功效，適用于角膜炎、細菌性或病毒性結(jié)膜炎、瞼板腺感染及化膿性淚腺炎等眼瞼及眼眶炎癥疾病的治療。方中龍膽能夠殺毒抑菌、瀉肝膽實火，可以治療肝火過盛引起的目赤目腫目痛。其主要成分為龍膽苦苷，龍膽苦苷主要通過抑制多種炎癥介質(zhì)的釋放起到抗炎鎮(zhèn)痛的作用[1]。梔子能用于清熱瀉火、涼血消腫解毒，可廣泛應(yīng)用于治療因血熱導致的急性鼻出血、眼腫痛。梔子苷是梔子的主要成分，梔子苷抗炎、鎮(zhèn)靜、降壓、解熱作用突出[2]。黃芩主要有效成分為黃芩苷，黃芩苷有明顯抗菌作用[3]，機制有二：一是能有效的抑制細菌新的生物膜合成，致其繁殖減慢;二是使細菌生物膜的滲透性增加利于抗菌藥物進入。黃芩苷、龍膽苦苷和梔子苷三種成分共同具有抗炎解毒作用，為本方治療眼部炎癥及感染的主要有效成分，含量測定選擇同時測定這三種成分，不僅操作簡單、結(jié)果準確可靠，最重要的是能為本藥藥效是否良好提供標準，保證藥品質(zhì)量。本實驗使用的高效液相色譜法具備操作自動簡便、檢測靈敏、分離效率高和分離速度快等優(yōu)點，在生藥、復方中藥等復雜體系的成分分離分析中發(fā)揮重要作用。復方中藥中多指標的同時測定能直接反映藥品的質(zhì)量的同時還能夠減少分析的成本，提升分析的準確度。該制劑目前已完成前期成型工藝，為提高藥品的質(zhì)量控制要求，本實驗從主要成分的含量測定方面進行研究，擬制定清火抗毒丸的質(zhì)量標準。

1 儀器與材料

1.1 儀器 真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）、SB25-12DTD超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司），高效液相色譜儀Dionex Ultimate 3000（賽默飛世爾科技有限公司），AR224CZ萬分之一電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司）。

1.2 材料 黃芩苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110726-201706）;龍膽苦苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110770-201716）;梔子苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110749-201718）。清火抗毒丸（巴彥淖爾市殘聯(lián)眼科醫(yī)院提供，批號20190103、20190105、20190107），經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學中藥學渠弼教授鑒定。甲醇為色譜純，水為超純水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：ODS-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：甲醇-0.1%磷酸水溶液;柱溫：30℃;流速：1 mL·min-1;波長：254 nm。以下專屬性、線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性、重復性、加樣回收實驗均使用此色譜條件。梯度洗脫程序見表1。

2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷、龍膽苦苷和梔子苷對照品適量溶于色譜甲醇，定容即得混標溶液，其每1 mL對照品溶液中包括黃芩苷、龍膽苦苷、梔子苷分別為55 μg、44 μg和86 μg。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱定0.2 g清火抗毒丸粉末于錐形瓶中，加甲醇25 mL，精密稱定錐形瓶，密塞，超聲處理（250 W，40 kHz）30 min，放冷，重新稱定其重量，甲醇補足缺失重量，搖勻并濾過，取續(xù)濾液，續(xù)濾液用0.45 μm的微孔濾膜濾過，即得供試品溶液[4]。

2.4 陰性對照溶液的制備 將本方各個藥材粉碎過篩，全方分別除去龍膽，梔子和黃芩按各自處方比混合，根據(jù)“2.3”項方法制備陰性對照溶液。

2.5 專屬性試驗 取“2.2”、“2.3”、“2.4”項下溶液各10μL進樣，相同保留時間下，供試品溶液在龍膽苦苷、梔子苷、黃芩苷相應(yīng)位置有色譜峰，陰性對照溶液相同位置未見干擾，表明該方法具有專屬性良好，結(jié)果如圖2所示。

2.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2”項下溶液0.5、1、2、4、5 mL置5 mL容量瓶中，甲醇定容并搖勻，測定線性關(guān)系。以峰面積（Y）為縱坐標，對照品濃度（ X，mg·mL-1） 為橫坐標，作圖，分別得出龍膽苦苷的線性方程：Y=143.02X+0.0742（r=0.9999），梔子苷線性方程：Y=157.72X-0.0081（r=1），黃芩苷線性方程：Y=235.99X+0.4012 （r=0.9998）。龍膽苦苷在8.6～86 μg·mL-1、梔子苷在4.4～44 μg·mL-1、黃芩苷在 5.5～55 μg·mL-1與峰面積的線性關(guān)系良好。

2.7 精密度試驗 取“2.2”項下溶液，進樣6次，每次10 μL，記錄峰面積。龍膽苦苷、梔子苷以及黃芩苷對照品的峰面積RSD依次為0.16%、0.08%和0.13%（n=6），結(jié)果顯示該儀器精密度良好[5]。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取同批次樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在0、2、4、6、8、10、12、24 h分別進樣，記錄各峰面積，龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷峰面積的RSD依次為0.66%，1.97%，0.47%（n=6）。表明樣品溶液放置24 h各成分含量穩(wěn)定。

2.9 重復性試驗 選同批次樣品（批號：20190103），按“2.3”項下方法制備6份供試品溶液，測定各峰面積，結(jié)果顯示龍膽苦苷、梔子苷以及黃芩苷峰面積的RSD 分別為1.0%、1.4%、1.5%（n=6），表明該方法重復性良好。

2.10 加樣回收試驗 取同批樣品6份（批號：20190103），精密稱定，每份約0.1 g，分別加入龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷對照品溶液1 mL（濃度依次為6.5、8、24.5 μg·mL-1），測定峰面積，各成分平均加樣回收率分別為101.24%、98.64%、99.38%，RSD分別為1.06%、1.04%、0.45%（n=6）。

2.11 樣品含量測定 取3個批次的樣品（批號：20190103、20190105、20190107），按照“2.3”項方法，制備供試品溶液平行樣3份，測定每批樣品中龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷的含量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 選擇測定波長 紫外-可見分光光度儀測定結(jié)果顯示：龍膽苦苷、梔子苷、黃芩苷的最大吸收波長分別是270 nm、242 nm、276 nm。改變波長進樣后，發(fā)現(xiàn)254 nm處同時測定含量時，各峰的分離度較好，基線較平，峰面積較大，所以選擇在254 nm下對三種成分進行含量測定[6-8]。

3.2 流動相的選擇 用甲醇-0.1%磷酸水溶液和乙腈-0.1%磷酸水溶液作為兩種待選流動相，當選用乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動相進行梯度洗脫時，出峰時間較早，而且龍膽苦苷峰和梔子苷峰不能實現(xiàn)良好分離，并且基線不平穩(wěn);當采用甲醇-0.1%磷酸水溶液系統(tǒng)進行梯度洗脫時，此條件下各峰分離很好，而且均符合藥典的要求，因此選擇甲醇-0.1%磷酸水溶液作為流動相。

3.3 提取溶劑和方法 首先對50%甲醇、70%甲醇和甲醇三種提取溶劑進行考察，使用甲醇作提取溶劑時，提取出的供試品溶液中三種成分的綜合提取率最佳;采用不同時長超聲（15、30、60 min）處理時，發(fā)現(xiàn)超聲處理30 min和60 min的供試品溶液中三種成分的提取率無明顯差異，其中超聲15 min時的提取率較低，因此選擇超聲30 min提取，操作簡便且能量消耗少。

本實驗通過綜合考量測定波長、色譜條件、提取工藝等可能影響含量檢定的各類因素，篩選出適合同時測定三種成分的HPLC法，結(jié)果準確可靠，此法可作為清火抗毒丸的質(zhì)量控制指標。

4 小結(jié)與展望

隨著現(xiàn)代檢測分析方法如高效液相色譜的不斷發(fā)展，復方中藥的研究也逐漸深入，分離、測定中藥有效成分，闡明中藥作用機理等工作正有序開展，并取得了可觀成果。復方中藥發(fā)揮藥效時通常是多種有效成分共同協(xié)作，可能是一味藥增強另一味藥的治療作用，或者是一味藥消除其他味藥的副作用，單獨測定一種主要有效成分通常不能很好控制復方藥的質(zhì)量。因此在復方中藥的質(zhì)量控制中多指標成分的分離與測定具有特別重要的意義。在同一方劑中，復方中藥的體內(nèi)藥物動力學特征以及復方藥效受藥材中指標成分影響，而配伍藥材的比例與其各自含量又顯著影響指標成分的高低[9]。因此復方中藥配伍以后，各指標成分的比例、含量不僅僅能夠反映藥物制劑的工藝水平，更重要的是能夠表征和確保復方中藥（及其制劑）的藥物療效。清火抗毒丸是民間應(yīng)用廣泛的復方中藥，其治療如上所述眼科疾病療效確切，但因其處方復雜，有效成分尚待分離確定，導致本藥生產(chǎn)過程中的質(zhì)控環(huán)節(jié)難以規(guī)范。本實驗建立HPLC法同時測定清火抗毒丸龍膽苦苷、梔子苷、黃芩苷的含量， 通過方法學驗證，本實驗所建立的方法不僅簡單，而且可靠，此法用于清火抗毒丸的質(zhì)量控制將給制備和檢測工作帶來極大便利。清火抗毒丸仍有許多輔助發(fā)揮藥效的有效成分未被分離發(fā)掘，建立適當分析方法來測定其他重要組分，并詳細研究其作用靶點、機制通路都將是后續(xù)研究的方向。

參考文獻

[1]陳長勛， 劉占文， 孫崢嶸， 等. 龍膽苦苷抗炎藥理作用研究[J]. 中草藥， 2003， 34（9）：814-816.

[2]王亭. 中藥梔子有效成分及藥理作用的研究進展[J].中國藥師， 2015， 18（10）：1782-1784.

[3]黃志軍. 黃芩苷藥理作用研究進展[J]. 天津藥學， 2012， 24（3）：61-64.

[4]郝福， 蔣曄， 李艷榮， 等. HPLC法測定龍膽瀉肝丸中龍膽苦苷、黃芩苷和梔子苷[J]. 中草藥， 2006， 37（12）：1808-1809.

[5]張艷.HPLC法同時測定瀉肝安神丸中龍膽苦苷、梔子苷、黃芩苷的含量[J].中國藥師，2017，20（6）：1125-1127.

[6]胡春麗，楊麗，王冬梅，等.HPLC法同時測定當歸龍薈片中龍膽苦苷和梔子苷的含量[J].沈陽藥科大學學報，2008（3）：204-207.

[7]ZHU W J，F(xiàn)ENG B，HAO C Y.Simultaneuos determination of three main component in Longdan Xiegan pills by HPLC-DAD[J]. Journal of Jilin Medical University（吉林醫(yī)藥學院學報）， 2016， 37（1）：4-6.

[8]FEI Y Q， NIE J.Quality Standard for Qingre Jiedu Tablets[J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，2013，19（9）：92-95.

（收稿日期：2020-11-03 編輯：程鵬飛）