山東省禽源致病性大腸桿菌流行病學(xué)監(jiān)測及耐藥模式分析

秦春芝，徐懷英，黃迪海，盛曉丹，郭 卉，劉 霞，秦卓明，

（1.山東省健牧生物藥業(yè)有限公司，山東濟(jì)南 250100；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，山東濟(jì)南 250100）

禽大腸桿菌病是由禽致病性大腸桿菌（avian pathogenicE.coli，APEC）引起的局部或全身性感染的疾病，可通過呼吸道、消化道及生殖道等多種途徑傳播，引起多種臨床病變，包括敗血癥、氣囊炎、腹膜炎、腫頭綜合征、全眼球炎、關(guān)節(jié)炎、輸卵管炎、肉芽腫、蜂窩織炎（炎癥過程）及臍炎/卵黃囊炎等。大腸桿菌病是目前在養(yǎng)禽業(yè)廣泛存在的感染性細(xì)菌病，居各種細(xì)菌性疾病之首，且極易與多種病毒，如新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV）、傳染性支氣管炎病毒（IBV）等發(fā)生并發(fā)或繼發(fā)感染[1-2]，導(dǎo)致家禽死淘率增加、生長緩慢、生產(chǎn)性能下降、飼料報(bào)酬率降低、胴體廢棄率升高，從而引起較大經(jīng)濟(jì)損失。

禽大腸桿菌病在我國普遍流行，混合或繼發(fā)感染嚴(yán)重，主要危害商品肉雞和肉鴨[3]。近年來，常發(fā)生APEC 與NDV、IBV、H9 亞型AIV 等病毒的混合感染，導(dǎo)致商品肉雞出現(xiàn)氣囊炎、支氣管栓塞、肝周炎、心包炎等病癥，死淘率高達(dá)30%，造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。不僅如此，種雞、蛋雞、鴨、鵝、鴿子、鵪鶉等也深受APEC 侵害[6]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國每年因APEC 而病亡的雞在4 000 萬只以上，經(jīng)濟(jì)損失數(shù)十億元。

由于抗菌藥物在臨床中的過度使用，導(dǎo)致大腸桿菌耐藥譜越來越廣，多重耐藥性加重，給該病防治帶來了較大挑戰(zhàn)。因此，了解APEC 的地區(qū)流行特點(diǎn)以及耐藥模式，對大腸桿菌病防治具有重要意義。本研究對2016—2020 年山東省12 個(gè)地市不同禽養(yǎng)殖場收集的105 份病料進(jìn)行APEC 分離鑒定，并對分離的93 株菌株進(jìn)行耐藥模式分析，以期為禽大腸桿菌病防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；伊紅美藍(lán)瓊脂，購自海博生物技術(shù)有限公司；革蘭氏染色液，購自北京索萊寶科技有限公司；標(biāo)準(zhǔn)藥敏片，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 質(zhì)控菌株

大腸桿菌ATCC 25922，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 APEC 分離鑒定

采集濰坊、濱州、棗莊等12 個(gè)地市一年四季送檢的105 批次具有典型心包炎和肝周炎病癥的雞（鴨）心、肝組織樣品，劃線接種于麥康凱瓊脂和伊紅美藍(lán)瓊脂鑒別培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)20 h，觀察菌落顏色、形態(tài)及革蘭氏染色后的菌體形態(tài)。

1.4 其他呼吸道病原檢測

根據(jù)GenBank 中已發(fā)表的NDV、AIV、IBV、傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）、雞毒支原體（MG）、滑液囊支原體（MS）等病原特異性保守區(qū)序列，合成相應(yīng)病原的檢測引物，對1.3 中相應(yīng)發(fā)病禽的氣管或氣囊組織進(jìn)行PCR 檢測。

1.5 藥敏試驗(yàn)

根據(jù)2019 年美國國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（CLSI）頒布的操作標(biāo)準(zhǔn)[7]，選取氨芐西林等21 種抗菌藥進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，依據(jù)抑菌圈直徑判定敏感株、中介株（中等耐藥株）和耐藥株（表1）。通過SPSS 15.0 軟件，對不同地市及不同禽種類分離的APEC 耐藥數(shù)據(jù)進(jìn)行配對樣本t 檢驗(yàn)。

表1 腸桿菌科細(xì)菌的藥物敏感試驗(yàn)抑菌圈直徑判定標(biāo)準(zhǔn)

1.6 多重耐藥模式分析

依據(jù)2012 年歐洲疾病預(yù)防和控制中心（ECDC）對多重耐藥（MDR）的定義和腸桿菌科MDR 判定標(biāo)準(zhǔn)[8]，從臨床常用的6 大類獸用抗菌藥物中選擇代表性藥物，包括阿莫西林（β-內(nèi)酰胺類）、多黏菌素（多肽類）、環(huán)丙沙星（喹諾酮類）、多西環(huán)素（四環(huán)素類）、卡那霉素（氨基糖苷類）和氟苯尼考（氯霉素類），根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果分析APEC 的多重耐藥模式。

2 結(jié)果

2.1 APEC 分離鑒定

分離菌株在麥康凱瓊脂平板上培養(yǎng)20 h 后，可見圓形、表面光滑濕潤、直徑為1～2 mm 的粉紅色菌落；該菌落在伊紅美藍(lán)平板上呈紫黑色，并帶有綠色金屬光澤；將培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性桿菌，大小為2～3 μm×0.4～0.7 μm（圖1），符合大腸桿菌生物學(xué)特性。

圖1 APEC 在鑒別培養(yǎng)基上的生長特性

經(jīng)培養(yǎng)特性和細(xì)菌形態(tài)分析，從采集的105份組織病料中共分離到93 株APEC，分離率為88.57%。氣溫多變寒冷的冬春季節(jié)分離率較高，共分離到56 株（60.22%）；溫差變化較小的秋季次之，分離到22 株（23.66%）；夏季最低，分離到15 株（16.13%）。APEC 主要分離自舍內(nèi)濕度大、墊料污染嚴(yán)重的鴨場。中小型養(yǎng)殖場分布較多的濰坊市分離到的菌株最多，共有34 株，其次是淄博、棗莊及濟(jì)南等地（表2）。

表2 APEC 分離株來源 單位：株

2.2 混合感染檢測

在進(jìn)行APEC 分離的同時(shí)，對相應(yīng)發(fā)病禽氣管和氣囊滲出物，進(jìn)行H9 亞型AIV、NDV、ILTV、IBV、MG、MS 等的PCR 檢測。結(jié)果（圖2）顯示：單純APEC 感染19 例（20.43%），APEC與H9 亞型AIV 等其他呼吸道病原的二重感染63例（67.74%），多重感染11 例（11.83%）。

圖2 APEC 與其他呼吸道病原混合感染情況

2.3 耐藥性檢測

21 種常用抗菌藥物對分離株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果（表3）顯示：分離菌株對阿莫西林（β-內(nèi)酰胺類）、氨芐西林（β-內(nèi)酰胺類）和多西環(huán)素（四環(huán)素類）耐藥率較高，分別為100%、98.21%和94.57%；其次是氟苯尼考、頭孢拉定和恩諾沙星，耐藥率分別為82.35%、84.52%和88.63%；而對丁胺卡那和阿奇霉素較敏感，耐藥率分別為20.43%和13.33%；對其他抗菌藥的耐藥率介于35.38%%～79.57%。不同地市及不同禽種類分離的APEC 耐藥率無顯著性差異（P＞0.05）。

表3 93 株APEC 分離株對不同抗菌藥物的耐藥性檢測結(jié)果

耐藥統(tǒng)計(jì)結(jié)果（圖3）顯示：93 株菌中，0 耐藥的菌株數(shù)量為0，對1～2 種藥物耐藥的5 株，其余88 株（94.62%）對3 種及以上藥物耐藥；耐16種藥物的菌株數(shù)量最多，有11 株，有2 株菌對所有的21 種藥物均耐藥。

圖3 APEC 不同耐藥程度菌株分布

2.4 耐藥模式分析

對代表性藥物的多重耐藥性分析結(jié)果（表4）顯示：93 株APEC 中，共有16 種耐藥類型，其中3 重及以上耐藥菌株共有85 株，占91.40%。APEC 對四環(huán)素類、β-內(nèi)酰胺類藥物、酰胺醇類、喹諾酮類、氨基糖苷類和大環(huán)內(nèi)酯類藥物的平均耐藥率分別為94.57%、89.88%、82.35%、71.61%、63.98%和13.33%，即表現(xiàn)為對抑制胞壁黏肽合成酶的β-內(nèi)酰胺類、作用于核糖體50S 阻撓蛋白質(zhì)合成的酰胺醇類和光譜抑菌的四環(huán)素類藥物產(chǎn)生了較強(qiáng)的耐藥性。

表4 93 株APEC 分離株耐藥類型 單位：株

對 比2016 年22 株 和2020 年23 株APEC 的對不同類別抗菌藥物的耐藥性，可以看出2016 年呈現(xiàn)2～6 重耐藥模式，有11 種耐藥類型，多重耐藥率為81.82%，到2020 年耐藥嚴(yán)重程度升級，表現(xiàn)為3 種耐藥類型的4～6 重耐藥，多重耐藥率為100%（圖4）。

圖4 2016 年與2020 年APEC 多重耐藥類型對比

3 討論

3.1 耐藥形勢更加嚴(yán)峻

本研究分離鑒定的93 株APEC 來源于山東省12 個(gè)地市的20 多個(gè)規(guī)?；B(yǎng)禽場。分離株對氟苯尼考、氨芐西林及頭孢噻肟等多種常用獸用藥物耐藥率高，耐藥程度較2015 年前[9-10]更加嚴(yán)重，僅對較少使用的多黏菌素耐藥率略低；對尚未在畜禽上應(yīng)用的第三代頭孢他啶和頭孢哌酮也產(chǎn)生了一定的耐藥，耐藥率分別為64.37%和54.84%；而對丁胺卡那霉素和阿奇霉素較敏感，耐藥率分別為20.43%和13.33%。近5 年分離的APEC 中，3 重及以上耐藥的菌株有85 株，占91.40%，其中2016 年分離的22 株APEC 呈現(xiàn)為2～6 種耐藥，有11 種耐藥類型，多重耐藥率為81.82%；而2020 年分離的23 個(gè)菌株耐藥類型有3 種，表現(xiàn)為4～6 重耐藥，多重耐藥率達(dá)到100%。這與國內(nèi)同期耐藥基因的檢測結(jié)果一致[11]，表明山東省APEC 多重耐藥現(xiàn)象有加重趨勢。

3.2 耐藥性加重的原因

大腸桿菌耐藥性的產(chǎn)生有其天然適應(yīng)性。1940 年Abraham 和Chain 從大腸桿菌中分離鑒定出了一種能水解青霉素的酶，說明在未使用抗生素之前，部分大腸桿菌就存在著對青霉素類藥物的耐藥性，這是其在不利環(huán)境中的適應(yīng)性生存能力。但目前耐藥性加重的趨勢與抗菌藥物的廣泛應(yīng)用、不合理使用密切相關(guān)。某些養(yǎng)殖場（尤其是商品肉雞場）為防止大腸桿菌病及其他細(xì)菌性疾病的發(fā)生，長期低劑量預(yù)防性用藥，未使用敏感性藥物或隨意加大劑量治療，這是加速耐藥性產(chǎn)生的重要原因。細(xì)菌可通過主動(dòng)改變自身的代謝途徑或藥物靶位點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)，使其不被抗菌藥物殺滅[12-14]。質(zhì)粒上攜帶的多種耐藥基因，可從耐藥菌株轉(zhuǎn)移到同種或其他不同種的敏感菌株質(zhì)粒或染色體上，因此耐藥基因在不同菌種的耐藥性傳遞中起著主要作用[15-16]。研究表明，在減少抗菌藥使用后6 個(gè)月后，APEC的耐藥性或耐藥基因仍然存在[17]。

3.3 綜合防控

首先要加快新抗菌藥物及復(fù)合型抗菌藥物研發(fā)，包括中藥、噬菌體等新型抗菌劑。克拉維酸也稱棒酸，一種不可逆性競爭型β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，對金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性桿菌的β-內(nèi)酰胺酶均有抑制作用，可顯著提高青霉素類和頭孢類抗生素的抗菌活性。本試驗(yàn)表明，阿莫西林的耐藥率為100%，而阿莫西林/克拉維酸（棒酸）復(fù)方藥物可將禽源大腸桿菌的平均耐藥率降至17.86%，證實(shí)阿莫西林與棒酸具有協(xié)同增效作用。

其次，禁止抗菌藥物濫用。2016 年8 月國家衛(wèi)生計(jì)生委、科技部、農(nóng)業(yè)部等14 部門制定出臺了《遏制細(xì)菌耐藥國家行動(dòng)計(jì)劃（2016—2020年）》，2018 年4 月農(nóng)業(yè)農(nóng)村部下達(dá)了《獸用抗菌藥使用減量化行動(dòng)試點(diǎn)工作方案（2018—2021 年）》，要求在家禽養(yǎng)殖飼料中，不添加任何抗生素、激素以及其他外源性藥物，在家禽養(yǎng)殖中將抗菌藥的使用嚴(yán)格限制在疾病治療范圍內(nèi)。

最后，要多措并舉，合理使用藥物。一要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，消除誘發(fā)因素，強(qiáng)化衛(wèi)生消毒管理；二要在高發(fā)地區(qū)，種禽開產(chǎn)前使用優(yōu)勢流行株的大腸桿菌滅活疫苗免疫，這樣可有效降低產(chǎn)蛋期內(nèi)的大腸桿菌病發(fā)病率，同時(shí)給雛雞提供母源抗體保護(hù)；三要依據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，選擇敏感藥物進(jìn)行合理治療。