云南省部分豬場(chǎng)病料豬圓環(huán)病毒3 型PCR 檢測(cè)及克隆測(cè)序

陶 杰，張敬寒，彭俊文，劉艷麗，李枝蘭，呂念詞，張以芳，鄒豐才，柴 俊

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650201；2.墨江縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南墨江 654800；3.墨江縣畜牧工作站，云南墨江 654800）

豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus，PCV）由德國(guó)科學(xué)家Tischer 于20 世紀(jì)70 年代首次從豬腎臟傳代細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時(shí)業(yè)界對(duì)該病原認(rèn)識(shí)較淺，因而對(duì)其并未重視[1]。目前已發(fā)現(xiàn)的PCV 有PCV1、PCV2、PCV3 和PCV4 型。PCV1 沒有致病性[2]，但PCV2 具有嚴(yán)重致病性，可以引起多種臨床癥狀，如斷乳仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、仔豬先天性震顫、豬皮炎和腎病綜合征、增生性和壞死性肺炎等[3]。2016 年P(guān)alinski 等[4]借助宏基因測(cè)序技術(shù)，從發(fā)病母豬及流產(chǎn)胎兒體內(nèi)首次鑒定出PCV3。2017 年我國(guó)首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)PCV3。目前PCV3 在我國(guó)廣東、山東、河北、遼寧、江西、重慶、福建、湖南等多個(gè)省市均有流行[5]。2019 年4 月，周繼勇團(tuán)隊(duì)從患有豬呼吸道疾病、腹瀉、豬皮炎與腎病綜合征的豬群中發(fā)現(xiàn)了一種新型PCV，并將其命名為PCV4[6]。

PCV3 為單股環(huán)狀DNA 病毒，無(wú)囊膜，大小約2 000 bp，直徑約17～20 nm，是至今發(fā)現(xiàn)的所有病毒中能進(jìn)行自主復(fù)制的最小哺乳動(dòng)物病毒[7]。PCV3 含有3 個(gè)主要開放閱讀框（ORF），即ORF1、ORF2 和ORF3。其中：ORF1 編碼Rep蛋白，主要參與病毒復(fù)制[8]；ORF2 編碼的Cap蛋白，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答[9]；而ORF3 編碼蛋白的功能還沒有具體研究。本研究對(duì)云南省不同地區(qū)豬場(chǎng)的病料進(jìn)行PCV3 PCR 檢測(cè)，并截取其ORF2 核苷酸序列，分析其與參考毒株間的同源性，以揭示云南省PCV3 的遺傳變異情況，從而為該病診斷和防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料樣品 24 份病料采自于云南省建水、宣威、瑞麗以及石屏等地區(qū)不同豬場(chǎng)疑似PCV 感染的病豬及其所產(chǎn)木乃伊胎的脾臟、肺臟和淋巴結(jié)。

1.1.2 主要試劑 TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0、DL 2 000 DNA Marker，購(gòu)自寶日生物工程有限公司；EasyPure Quick Gel Extraction Kit、2×EasyTaqSuperMix、感受態(tài)細(xì)胞DH5α、PMD19-T 載體，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒，購(gòu)自北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司（GenStar）。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank 中公開發(fā)表的PCV3 基因序列，利用Oligo7 軟件設(shè)計(jì)1 對(duì)引物（PCV3-F：CCCACATGCGAGGGCGTTTACC；PCV3-R：CGAGGCCGCTTCATCATCCACT）擴(kuò)增ORF2 基因，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為895 bp。引物由昆明擎科生物科技有限公司合成。

1.2.2 病毒DNA 提取 按照TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0 說(shuō)明書，對(duì)樣品上清進(jìn)行DNA 提取。

1.2.3 PCR 檢測(cè) 利用PCV3 檢測(cè)引物PCV3-F、PCV3-R，對(duì)上述提取的樣品DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系25.0 μL：2×EasyTaqSuperMix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上、下游引物及DNA 各1.0 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，擴(kuò)增34 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果并拍照。使用EasyPure Quick Gel Extraction Kit 回收目的片段。

1.2.4 克隆與純化基因鑒定 采用TA 克隆，按照寶日生物工程（大連）有限公司TaKaRa pMDTM19-T Vector Cloning Kit 和TaKaRaE.coilDH5α Competent Cells 說(shuō)明書進(jìn)行。使用購(gòu)自GenStar 公司的質(zhì)粒提取試劑盒，按照說(shuō)明書從培養(yǎng)好的菌液中提取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR 鑒定，對(duì)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.5 測(cè)序及序列分析 將菌液送至昆明碩擎生物進(jìn)行測(cè)序。利用DNAstar 軟件，對(duì)其中1 份陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物（命名為YNJS-2020）測(cè)序結(jié)果與GenBank 中16 株P(guān)CV3 參考毒株（表1）進(jìn)行ORF2 核苷酸序列同源性分析，并通過(guò)MEGA7.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

表1 參考毒株信息

2 結(jié)果

2.1 PCR 擴(kuò)增

對(duì)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果在895 bp 左右位置可見清晰的特異性條帶，與預(yù)期相符（圖1）。

圖1 PCR 擴(kuò)增鑒定結(jié)果

2.2 核苷酸同源性分析

使用DNAstar 中的Megalign 軟件，對(duì)YNJS-2020 測(cè)序結(jié)果與GenBank 中的16 株參考毒株進(jìn)行ORF2 核苷酸序列同源性分析。結(jié)果（圖2）顯示：第一，YNJS-2020 與16 株參考毒株同源性為97.4%～98.9%，其中與西班牙737-8-Spain-2017毒株同源性最高，為98.9%；與安徽14-201611 毒株同源性最低，為97.4%。第二，YNJS-2020 與韓國(guó)PCK3-1702 毒株、山東2-201703 毒株、山東1-201703 毒株、泰國(guó)PB01-17 毒株的同源性相同，均為97.8%；與上海0708-2016 毒株、湖北618-2016 毒株、河南13-2016 毒株以及巴西BR-RS-6毒株、美國(guó)MO2015 毒株的同源性都為98.0%。第三，YNJS-2020 與其他毒株（IT-CO2017、GXHJ1-2017、CHN-CC2016，CHNCC2016 和HZ4-2015）的同源性都在98.0%以上。

圖2 YNJS-2020 毒株與國(guó)內(nèi)外參考毒株同源性分析結(jié)果

2.3 ORF2 核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

用MEGA 7.0 軟件對(duì)YNJS-2020 與GenBank中16 株參考毒株的ORF2 核苷酸序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。分析結(jié)果（圖3）顯示：第一，YNJS-2020 與意大利IT-CO2017、廣西GXHJ1-2017、江西CHNCC2016、上海0708-2016、廣東HZ4-2015、吉林CHN-CC2016 等毒株的同源性相近，形成了一個(gè)親緣關(guān)系較近的分支；第二，YNJS-2020 與西班牙737-8-Spain-2017 毒株的同源性最高，表明這兩個(gè)毒株之間的親緣關(guān)系最近；第三，YNJS-2020 與韓國(guó)PCK3-1702 毒株、山東2-201703 毒株、山東1-201703 毒株、泰國(guó)PB01-17 毒株位于兩個(gè)不同的分支，表明YNJS-2020 與這幾個(gè)毒株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而與安徽14-201611 毒株的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖3 ORF2 核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果

3 討論

PCV 是公認(rèn)的危害豬群最嚴(yán)重的病原之一。自2016 年美國(guó)鑒定出第一株P(guān)CV3 以后，我國(guó)各地相繼發(fā)現(xiàn)了PCV3 的存在。本研究采集了云南省不同地區(qū)豬場(chǎng)的病料。被采集病料的病豬分別出現(xiàn)皮下水腫、皮膚不規(guī)則隆起，母豬表現(xiàn)體溫升高，產(chǎn)木乃伊胎。針對(duì)有此臨床癥狀的24 份病料進(jìn)行PCV3 病原檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性檢出率達(dá)到20.8%，說(shuō)明云南省豬群中存在PCV3 流行。據(jù)報(bào)道[10]，2017 年華中農(nóng)業(yè)大學(xué)曾對(duì)重慶、湖南等11 個(gè)省市收集的222 份樣品進(jìn)行PCV3 病原檢測(cè)，檢出陽(yáng)性77 份，陽(yáng)性率為34.7%。而本研究24 份病料樣品的陽(yáng)性檢出率為20.8%，說(shuō)明云南省的PCV3 流行程度可能低于這11 個(gè)省份。

本研究對(duì)YNJS-2020 與國(guó)內(nèi)外分離毒株進(jìn)行ORF2 基因序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與西班牙737-8-Spain-2017 毒株同源性最高，表明這兩個(gè)毒株之間的親緣關(guān)系最近，因此懷疑該毒株的來(lái)源可能與國(guó)外引種有關(guān)，但要確定其具體來(lái)源較困難。YNJS-2020 與部分參考毒株位于不同分支，表明其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其中與安徽14-201611 毒株親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，這應(yīng)引起云南省今后在PCV3 疫苗株篩選研究中的注意。

4 結(jié)論

本研究確定云南省豬群中存在PCV3 感染，且流行毒株與GenBank 里選取的國(guó)內(nèi)外參考毒株同源性較高，尤其與國(guó)外毒株同源性最高，提示其來(lái)源可能與國(guó)外引種有關(guān)，但也存在一定差異。建議云南省加強(qiáng)PCV3 監(jiān)測(cè)及其流行控制，同時(shí)在今后疫苗株篩選研究中注意毒株間的同源性。