肺動脈高壓合并肺缺血再灌注損傷大鼠模型的建立與評價*

丁 運(yùn)， 凃鵬杰， 陳 龍， 潘小杰， 陳文樹△

福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院，福建省立醫(yī)院 1胸外科 2骨科，福州 350001

肺動脈高壓(pulmonary artery hypertension，PAH)是由多種因素引起的一種進(jìn)行性疾病，常繼發(fā)于循環(huán)系統(tǒng)及呼吸系統(tǒng)疾病[1]，許多接受胸心外科手術(shù)的患者合并有PAH；同時，肺缺血再灌注損傷(lung ischemia-reperfusion injury，LIRI)是胸心外科術(shù)后常見的病理生理過程，常見于肺移植、肺袖式切除、體外循環(huán)后等情況，是一種難以避免且嚴(yán)重影響患者預(yù)后的并發(fā)癥[2]。隨著人口老齡化，心肺疾病發(fā)生率逐年升高，PAH合并LIRI在臨床上越來越多見，是臨床上迫切需要解決的重點(diǎn)和難點(diǎn)問題。然而，目前對PAH合并LIRI的研究甚少，也缺乏有效的動物模型。建立有效的動物模型，有利于深入認(rèn)識和闡明PAH合并LIRI的病因和發(fā)病機(jī)制，從而指導(dǎo)對該類疾病更好的防控和治療。本研究成功建立了PAH合并LIRI的大鼠模型，此方法簡單實(shí)用，成功率高、易復(fù)制，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物的選擇及分組

本研究采用8周齡雄性SD大鼠共計40只，購自福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SCXK(閩)2016-0002。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按醫(yī)學(xué)倫理學(xué)規(guī)范操作。將大鼠隨機(jī)分為4組：對照組(control)，肺動脈高壓組(PAH)，肺缺血再灌注組(IR)，肺動脈高壓合并肺缺血再灌注組(PAH+IR)，每組10只。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

小動物呼吸機(jī)TKR-200C(江西省特力麻醉呼吸設(shè)備有限公司)，顯微外科手術(shù)器械(重慶市思睿實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，PowerLab生物信號采集分析系統(tǒng)及配套的壓力換能器和配套心排量導(dǎo)絲(澳大利亞ADInstruments公司)，野百合堿(美國Sigma公司)。

1.3 PAH模型制備

PAH組和PAH+IR組大鼠按50 mg/kg體重一次性腹腔注射野百合堿[3]制備PAH模型；對照組和IR組大鼠同期予腹腔注射等量生理鹽水。給藥4周后進(jìn)行LIRI模型制備。

1.4 LIRI模型制備

1.4.1 胸部手術(shù)前準(zhǔn)備及麻醉 術(shù)前12 h禁食，4 h禁水。按60 mg/kg體重腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉，麻醉后取仰臥位固定于操作臺。頸部及左胸部備皮后常規(guī)消毒皮膚，頸部氣管正前方縱行切開皮膚，分離氣管前組織以顯露氣管，于第2、3軟骨環(huán)處橫行切開氣管膜部，插入18G靜脈留置針1～2 cm并固定，接小動物呼吸機(jī)輔助呼吸，吸入95% O2和5% CO2混合氣體，選擇壓力控制通氣模式，壓力0.02～0.04 MPa，頻率60次/min，吸呼比值1∶2.5。

1.4.2 胸部手術(shù)操作 采用血管夾夾閉肺門法[4]：經(jīng)左側(cè)第5肋間前外側(cè)切口進(jìn)胸，按300 U/kg體重經(jīng)尾靜脈注射肝素鈉預(yù)防血栓形成，5 min后適當(dāng)調(diào)小呼吸機(jī)工作壓力，使左肺稍萎陷，向右上方撥開胸腺及心臟，游離出左肺門。IR和PAH+IR組大鼠使用無損傷血管夾夾閉左肺門，包括左主支氣管及左肺動靜脈(圖1)，見左肺無呼吸運(yùn)動、左肺門動脈結(jié)構(gòu)無搏動為有效阻斷，夾閉肺門1 h以模擬肺缺血。之后松開血管夾，恢復(fù)左肺通氣和血液灌注2 h以模擬肺再灌注。對照組和PAH組大鼠進(jìn)行麻醉、插管成功后，只進(jìn)行開胸操作及分離左肺門，不進(jìn)行夾閉左肺門操作，觀察3 h。

A：血管夾夾閉左肺門；B：左肺門結(jié)構(gòu)

1.5 PAH合并LIRI模型制備

按上述方法，PAH+IR組大鼠采用野百合堿注射法制作PAH模型4周后，采用血管夾夾閉肺門法制作PAH合并LIRI模型。

1.6 觀察指標(biāo)及標(biāo)本檢測

1.6.1 PAH的評估 ①血流動力學(xué)參數(shù)：恢復(fù)再灌注2 h后經(jīng)右心置管檢測平均肺動脈壓(mean pulmonary arterial pressure，mPAP)及右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure，RVSP)[5]，將18G靜脈留置針經(jīng)壓力換能器連接生物信號采集系統(tǒng)，肝素化的留置針經(jīng)右心室心尖進(jìn)入右心室，針尖進(jìn)入2.5 mm后退出針芯，繼續(xù)將留置針管向內(nèi)推2.5～5 mm至右心室和肺動脈，待波形穩(wěn)定后記錄mPAP和RVSP。檢測后處死大鼠，獲取標(biāo)本。②右心室肥厚指數(shù)(right ventricular hypertrophy index，RVHI)：大鼠處死后完整取出心臟，保留心室組織，沿室間溝分離右心室和左心室+室間隔，吸干表面液體后稱重，計算并記錄右心室重量/(左心室+室間隔)重量為RVHI。

1.6.2 LIRI的評估 ①大體觀察：大鼠處死后，完整取出左肺，肉眼觀察并記錄左肺外觀變化。②肺組織濕干重比值(wet-to-dry weight ratio，W/D)：取部分左肺組織吸凈表面液體后稱濕重，置于65 ℃烤箱72 h后稱量干重，計算W/D。③肺組織病理學(xué)檢查及肺損傷評分：取部分左肺組織制作切片，經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色后，使用光學(xué)顯微鏡觀察左肺損傷情況。參考肺損傷評分系統(tǒng)[6]，根據(jù)以下3項(xiàng)進(jìn)行肺損傷評分：(1)肺出血；(2)肺水腫；(3)炎性細(xì)胞浸潤(0分，無明顯損傷；1分，輕度；2分，中度；3分，重度)，3項(xiàng)分?jǐn)?shù)之和為該視野肺損傷評分，每個左肺制作切片3張，每張觀察3個高倍鏡(200×)視野，取平均值為對應(yīng)大鼠肺損傷評分。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況

PAH+IR組中1只大鼠注射野百合堿3周后死亡，其余大鼠進(jìn)入手術(shù)操作；PAH+IR組中1只大鼠夾閉肺門30 min后死亡，其余均順利完成操作。PAH+IR組總建模成功率80.0%(8/10)。

2.2 PAH的評估結(jié)果

① mPAP及RVSP：PAH和PAH+IR組大鼠的mPAP及RVSP均顯著高于對照組和IR組(均P<0.05)，同時，PAH+IR組大鼠的mPAP及RVSP明顯高于PAH組(均P<0.05)，見表1。②RVHI：PAH和PAH+IR組大鼠的RVHI均顯著高于對照組和IR組(均P<0.05)，但I(xiàn)R組與對照組之間以及PAH+IR組與PAH組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠平均肺動脈壓、右心室收縮壓、右心室肥厚指數(shù)比較

2.3 LIRI的評估結(jié)果

①大體觀察：IR組、PAH+IR組肺與其他組相比，外觀明顯呈暗紅色、充血明顯，表面及邊緣不平整，彈性差；PAH+IR組上述改變較IR組更明顯，見圖2。部分行IR操作的大鼠肺氣管腔見血性泡沫樣分泌物溢出。②光鏡下觀察：PAH和PAH+IR組標(biāo)本切片均可見血管內(nèi)皮層不同程度增生，肺小血管肌化、閉塞，提示肺血管重構(gòu)，見圖3。對照組和PAH組的肺組織間無明顯炎性細(xì)胞浸潤；IR組肺泡間質(zhì)及血管周圍水腫明顯，肺泡間質(zhì)及間隙內(nèi)均可見大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡間隔因水腫、肺泡內(nèi)出血而明顯增寬，PAH+IR組上述情況更加明顯，見圖3。根據(jù)以上表現(xiàn)對肺組織損傷評分結(jié)果見表2。③W/D：IR和PAH+IR組大鼠的W/D均顯著高于對照組和PAH組(均P<0.05)，但PAH組與對照組之間以及PAH+IR組與IR組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，見表2。

A：對照組；B：PAH組；C：IR組；D：PAH+IR組

A：對照組；B：PAH組；C：IR組；D：PAH+IR組

表2 各組大鼠左肺損傷程度評分、左肺濕干重比值比較

3 討論

隨著人口老齡化的加劇，心血管疾病及呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病率逐年增加，PAH合并LIRI的患者成為臨床醫(yī)生不容忽視的一部分群體。但目前缺少有效的防治措施，并且鮮有針對PAH合并LIRI的研究以及PAH合并LIRI的動物模型建立方法報道。因此，建立有效的PAH合并LIRI動物模型，對進(jìn)一步研究PAH合并LIRI有著重大意義。

目前PAH動物建模方法包括：野百合堿注射、慢性缺氧、肺栓塞、手術(shù)分流、遺傳修飾[7]。本研究選擇通過注射野百合堿構(gòu)建PAH模型有如下優(yōu)點(diǎn)：首先，野百合堿通過肝臟被轉(zhuǎn)化為野百合吡咯，野百合吡咯能夠選擇性地在肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)與DNA和蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，引起肺血管內(nèi)皮功能障礙，導(dǎo)致炎癥相關(guān)的PAH[8]。與其他方法相比，此方法能更好地模擬臨床PAH的病理生理過程[9]。其次，野百合堿注射法具有操作簡便、可重復(fù)、穩(wěn)定性好、便宜的優(yōu)點(diǎn)。此外，采用非手術(shù)方法建立PAH模型，避免通過兩次手術(shù)建立PAH合并LIRI模型，能有效保證大鼠存活率，同時能降低LIRI模型建模手術(shù)操作難度。LIRI動物建模方法包括：肺動脈封堵法和肺動脈或肺門阻斷法。肺動脈封堵法包括異物封堵法和氣囊封堵法；肺動脈或肺門阻斷法包括結(jié)扎線結(jié)扎法和無創(chuàng)血管夾夾閉法[4，10]。與肺動脈封堵法和單純肺動脈阻斷法相比，肺門阻斷法在阻斷肺動脈的同時阻斷肺靜脈及支氣管，使操作側(cè)的肺處于缺血且無通氣的狀態(tài)，可更好地模擬肺移植中供體肺的LIRI。相較于兔、狗等大動物，本研究采用的大鼠模型成本更低且更容易獲得，但由于大鼠體型小，實(shí)際開胸手術(shù)操作中可能造成其他組織損傷，因此我們使用顯微外科器械進(jìn)行操作，用血管夾直接夾閉左肺門，避免過度游離肺門、分離肺動脈造成血管損傷，在不造成肺門結(jié)構(gòu)損傷的同時完全阻斷進(jìn)入肺的血流和通氣，操作簡易且達(dá)到模型建立的標(biāo)準(zhǔn)。因此，本研究采用野百合堿注射法+血管夾夾閉肺門法構(gòu)建PAH合并LIRI的大鼠模型，并初步探索PAH和LIRI的相互影響。

參考以往文獻(xiàn)，在PAH模型的評估中，通常采用mPAP、RVSP、RVHI及組織病理改變等指標(biāo)進(jìn)行評估[3，7]，其中mPAP是評估PAH的直接指標(biāo)；而在LIRI模型的評估中，通常采用肺組織大體外觀、肺損傷評分及W/D等指標(biāo)進(jìn)行評估[4，10]，其中肺損傷評分是參考動物肺損傷評價標(biāo)準(zhǔn)[6]對肺組織鏡下改變進(jìn)行評分，是評估肺損傷的直接指標(biāo)，W/D可有效反映肺水腫情況，也是評估肺損傷程度的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)PAH+IR組大鼠的mPAP、RVSP、RVHI均顯著高于對照組，表明PAH+IR組大鼠的PAH建立成功；同時PAH+IR組病理切片可見肺血管重構(gòu)表現(xiàn)，進(jìn)一步證實(shí)PAH建立成功。PAH+IR組大鼠的肺標(biāo)本外觀較對照組充血、水腫明顯，肺組織損傷評分及W/D均顯著高于對照組，提示PAH+IR組大鼠的LIRI建立成功。綜上評估結(jié)果，我們成功建立了PAH合并LIRI的大鼠模型。

本研究中PAH+IR組大鼠的mPAP及RVSP高于PAH組，提示LIRI使肺動脈壓進(jìn)一步升高。這可能是由于缺血缺氧引起肺小動脈平滑肌痙攣[11]，使肺血管阻力上升；同時肺缺血再灌注后在高倍鏡下可以觀察到肺泡內(nèi)出血明顯，肺缺血再灌注使肺泡-毛細(xì)血管內(nèi)膜損傷，導(dǎo)致微血管通透性改變和肺內(nèi)微血栓形成[12]，造成局部肺栓塞，在血流動力學(xué)等因素影響下使肺血管阻力上升、肺動脈壓升高。然而本研究中PAH+IR組的RVHI與PAH組無明顯差異，這可能是由于心室重塑是一種慢性適應(yīng)性反應(yīng)，右心室在PAH造成的長期過度后負(fù)荷的作用下，心肌細(xì)胞通過肌節(jié)以并聯(lián)性增生的方式增粗，導(dǎo)致右心室壁增厚、RVHI升高[13]，而本實(shí)驗(yàn)中的LIRI為急性反應(yīng)，所以PAH+IR組與PAH組的RVHI無明顯差異，這需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證。

研究中，PAH+IR組比IR組的肺損傷評分明顯升高，結(jié)合左肺大體外觀，提示PAH加重LIRI的損傷。PAH以肺血管收縮和肺血管重構(gòu)為特征[14]，肺小動脈長期的收縮狀態(tài)引起肺血管壁平滑肌和成纖維細(xì)胞的肥大和增生，導(dǎo)致肺小動脈管腔狹窄，血管阻力增加[15]；同時膠原和彈性纖維在肺血管壁中沉積，血管彈性減弱，舒縮功能下降，同樣增加肺小血管阻力[16]，使再灌注時的血流恢復(fù)速度減慢，進(jìn)而影響再灌注的效果，導(dǎo)致肺組織的損傷加重；此外PAH的特征還包括內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙以及原位血栓形成[17]，這使得肺缺血時肺內(nèi)血栓形成加劇，同樣影響復(fù)灌，加重肺損傷。以上PAH和LIRI相互影響的機(jī)制尚未明確，有待更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探索。

本研究成功建立了PAH合并LIRI的大鼠模型。采用野百合堿注射法+血管夾夾閉肺門法構(gòu)建PAH合并LIRI模型，更好地模了擬臨床PAH發(fā)病的病理生理機(jī)制和肺移植中供肺的缺血缺氧狀態(tài)，且操作簡單，建模成功率高。本研究也發(fā)現(xiàn)PAH和LIRI之間存在相互作用，其機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。本模型的建立為全面系統(tǒng)地認(rèn)識和闡明PAH合并LIRI的病理生理機(jī)制以及兩者之間的相互作用提供了重要基礎(chǔ)。