ERK3的研究進展*

許 頡， 金 瑩， 付 堅

湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院臨床研究所，十堰 442000

1 ERK3激酶的特性

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路在細胞增殖、分化、基因表達、凋亡、代謝和運動中發(fā)揮重要作用。其基本信號傳遞通路遵循MAPK的三級酶促級聯(lián)反應，具體包括以Ras作為上游激活蛋白，Raf作為MAPKKK(MAPK kinase kinase)，MEK(MAP kinse-ERK kinase)作為MAPKK，ERK為MAPK，即Ras-Raf-MEK-ERK途徑。在哺乳動物中，基于其激酶結構域的同源性已經(jīng)鑒定出14個MAPK[1]，分為7個MAPK模塊。人們根據(jù)其亞基結構和調(diào)控特征，將MAPK分為經(jīng)典MAPK和非典型MAPK。經(jīng)典MAPK包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)、p38亞型(α，β，γ和δ)、c-Jun氨基末端激酶1/2/3(JNK1/2/3)和ERK5，其激活環(huán)中都有一個高度保守的Thr-xaa-Tyr(TXY)基序。上游激酶對這個保守TXY基序中Thr和Tyr殘基的雙重磷酸化導致經(jīng)典MAPK被激活并轉(zhuǎn)位到細胞核中[1-3]。ERK3/4，ERK7/8和NLK(Nemo-like kinase)，因不含有Thr-xaa-Tyr基序(ERK7/8除外)，不能被常規(guī)ERK激酶激活，因此屬于非典型MAPK。

與經(jīng)典MAPK分子相比，ERK3在其Ser-Glu-Gly(SEG)激活基序中只有一個磷酸受體位點Ser189，因此所有活化MAPK分子蘇氨酸/酪氨酸雙位點的MEK均不能活化ERK3；而ERK3-Ser189在靜息細胞中可以逐漸磷酸化，并不受普通細胞刺激的影響[4]；此外，ERK3的亞細胞分布不受ERK3-Ser189磷酸化的影響，也不受有絲分裂或常見應激刺激的影響[5]。

2 ERK3的翻譯后修飾

2.1 ERK3的核轉(zhuǎn)位機制

Bind等[6]最早發(fā)現(xiàn)ERK3全酶由核心酶和C端延伸序列組成。ERK3 C端富含絲氨酸和蘇氨酸殘基的延伸序列上有高爾基體/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位基序Lys-His-Leu-Asn(KHLN)，因此推測ERK3全酶定位于細胞質(zhì)內(nèi)。當ERK3活化進入細胞核時，其C端延伸序列發(fā)生裂解，丟失部分C端延伸序列的ERK3才得以發(fā)生核轉(zhuǎn)位進入細胞核。后來證實ERK3細長的C末端延伸，由大約400個氨基酸組成，這在ERK1/2、p38亞型和JNKs中并不存在。其前150個氨基酸殘基與ERK4 C末端延伸的一個區(qū)域有近50%的同源性，因此該結構域被稱為ERK3和ERK4結構域(C34)中的保守區(qū)；在C34結構域之外，還有一個C末端的尾巴，它包括ERK3的最后280個氨基酸，其保守區(qū)域可能具有潛在的重要功能[7]。在ERK3激酶活性和細胞功能調(diào)節(jié)中的確切作用在很大程度上仍是未知。有研究表明，C末端延伸的翻譯后修飾在細胞周期進程中調(diào)節(jié)ERK3的蛋白表達水平。此外，ERK3在激酶區(qū)的Ⅷ亞結構域以Ser-Pro-Arg(SPR)基序替代Ala-Pro-Glu(APE)，這個基序的作用與催化無關，而與C端折疊結構的穩(wěn)定性有關[8]。

2.2 ERK3的磷酸化

對細胞各周期ERK3表達的分析表明，ERK3蛋白在有絲分裂細胞中積累，伴隨著ERK3自主磷酸化，但這種磷酸化是可逆的，從M期到G1期轉(zhuǎn)變過程ERK3又可發(fā)生去磷酸化。通過重組ERK3與有絲分裂細胞提取物的體外孵育，鑒定了位于ERK3 C末端尾部的4個殘基(Ser684、Ser688、Thr698和Ser705)的磷酸化，這4個位點其中之一或多個的磷酸化可使ERK3蛋白穩(wěn)定。ERK3主要的磷酸受體位點Ser189是Pak2在體外直接磷酸化的位點[9]，具有高度特異性。ERK3-Ser189磷酸化可通過自身磷酸化[6，10]發(fā)生在順式蛋白中，也可通過Ⅰ型p21激活的蛋白激酶(Paks)反式發(fā)生[11-12]，即Ⅰ類p21激活的激酶(Pak成員)介導SEG基序的強磷酸化，導致機體中ERK3和ERK4的酶激活以及MAPK激活的蛋白激酶5(MK5)/Pak下游激活。ERK3-Ser189的磷酸化被雙特異性磷酸酶2(DUSP2)降低[13]，這種作用是由ERK3羧基末端的保守公共對接結構域和DUSP2的非催化氨基末端的保守激酶相互作用基序介導的。DUSP2的表達抑制了ERK3及其下游底物MK5的激活。為了進一步研究ERK3激活位點與功能的關系，Elkhadragy等[14]針對ERK3-Ser189磷酸化位點進行了突變，使S189A不能磷酸化。S189A突變大大降低了ERK3促進肺癌細胞遷移和侵襲的能力，盡管催化失活的ERK3突變體仍然能夠增加遷移和侵襲，但與野生型ERK3相比程度較小。磷酸化后的ERK3的狀態(tài)，無論在血清饑餓的細胞中，還是在生長因子刺激下或者化學藥物處理的細胞中都不會發(fā)生改變。ERK3的激活環(huán)磷酸化刺激了它們的內(nèi)在催化活性，這是與MK5形成穩(wěn)定的活性復合物所必需的，其磷酸化程度可以通過與底物MK5的相互作用間接調(diào)節(jié)[15]，但ERK3的功能與其磷酸化程度并不密切相關。

2.3 ERK3的泛素化

在處于分化的細胞中，ERK3是一個很不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，半衰期僅為30 min左右，實驗表明ERK3蛋白是通過可變泛素化途徑降解的。多聚泛素結合在蛋白質(zhì)N端α-NH基團。第1個泛素通過其C端與ERK3游離的N端形成一個短肽，從而結合到ERK3上。其后的泛素分子相繼結合在第1個泛素上，形成一條多泛素鏈。結合有多泛素鏈的ERK3可被26S蛋白酶體識別而降解。ERK3被26S蛋白酶體降解的區(qū)域有2個：一個位于ERK3的前15個氨基酸序列中；另一個則位于ERK3的第53和第82個氨基酸殘基之間。由于降解區(qū)域主要位于ERK3的N端，因此如果在N端加上一段較長的序列，就可以大大延長ERK3的半衰期[1-3]。由于泛素結合發(fā)生在N末端，但受到C末端標簽的影響，這可能表明ERK3的氨基和羧基末端在結構上非常接近[16]。

2.4 ERK3的羥基化

另一個調(diào)節(jié)ERK3穩(wěn)定性的翻譯后修飾是脯氨酸羥化酶3(PHD3)的羥基化。利用質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，PHD3在體外能使ERK3在P25(proline 25)上羥基化，P25位點的羥基化通過保護ERK3不受蛋白酶體降解來穩(wěn)定ERK3。這在細胞實驗中也得到了證實：羥化酶抑制劑可促進ERK3的降解，突變體ERK3 P25A的表達水平低于野生型ERK3，并且其表達不被羥化酶抑制劑進一步抑制[17]。

3 ERK3的底物

MAPK通路是細胞內(nèi)普遍存在的信號模塊，細胞通過它將細胞外的化學和物理信號轉(zhuǎn)化為適應性的細胞內(nèi)反應。如前文所述，經(jīng)典MAPK遵從經(jīng)典的三級酶聯(lián)反應。一旦激活，MAPK將磷酸化存在于各種亞細胞器的多種底物。ERK1/ERK2是脯氨酸導向的激酶，它能靶向磷酸化底物的絲氨酸、蘇氨酸以及脯氨酸殘基。到目前為止，已經(jīng)鑒定出150多種ERK1/ERK2底物[18]。盡管ERK3的表達無處不在，但觸發(fā)ERK3磷酸化和激活的生理刺激以及它的真實底物還沒有得到充分的證實[7]，已經(jīng)被證實的ERK3的底物與ERK1/2的底物存在交叉。目前被公認的ERK3底物是MK5，它是一個54 kD的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在體外可被ERK2、JNK和p38 MAPK通過磷酸化Thr-182激活[19-20]。MK5廣泛表達于腦、心臟和血小板中[21-24]。MK5具有功能性的核定位信號和核輸出信號，允許蛋白質(zhì)在細胞核和細胞質(zhì)之間穿梭。Kostenko等[25]發(fā)現(xiàn)，細胞核中的MK5 N端區(qū)含有催化區(qū)，而C端區(qū)是ERK3和ERK4結合所必需的[25-26]。與MK2和MK3不同，MK5屬于非典型MAPK通路環(huán)節(jié)[27]。ERK3和ERK4是MK5的上游激活劑，可以誘導MK5在Thr-182處發(fā)生磷酸化[28-30]。Pak誘導的ERK3/4激活導致MK5 Thr-182位點磷酸化水平升高，激活MK5的激酶活性。Seternes等[5]發(fā)現(xiàn)，不論是在細胞內(nèi)或是細胞外，ERK3都能被MK5特異識別。

MK5與ERK3/4形成復合物，發(fā)生活化位點Thr-182的磷酸化；而復合體中的ERK3，其C末端延伸的不同位點也會自動發(fā)生磷酸化。推測ERK3/MK5復合體參與了樹突形態(tài)的調(diào)節(jié)和間隔蛋白功能的調(diào)節(jié)[31]。目前已知ERK3可與細胞周期調(diào)節(jié)因子Cdc14相互作用[32]，這在小鼠卵母細胞成熟的減數(shù)分裂過程中，對維持紡錘體穩(wěn)定和中期過渡具有很重要的意義[33]。ERK3還與類固醇受體共激活因子3(SRC-3)相互作用，ERK3似乎在S857位點磷酸化SRC-3，并調(diào)節(jié)它與Ets-和SP1型轉(zhuǎn)錄因子的相互作用[33-34]。最近，有研究提示酪氨酰DNA磷酸二酯酶2(TDP2)為ERK3的底物，有人認為ERK3在S60位點磷酸化TDP2，并在DNA損傷反應中刺激其磷酸二酯酶活性[35]。

4 ERK3的激酶功能

4.1 ERK3的促增殖作用

雖然有跡象表明ERK3在細胞增殖中起調(diào)控作用，但確切的機制還未被闡明。功能研究表明，在P9和PC12細胞分化為神經(jīng)元以及C2C12成肌細胞分化為肌管的過程中，ERK3的表達增加[36-37]，而這些細胞的分化與停止增殖有關。此外，穩(wěn)定的ERK3過表達可抑制成纖維細胞進入S期。在肝細胞癌的細胞模型中，miR499a似乎通過抑制ERK3的表達來促進肝癌增殖[38]。與ERK3作為增殖抑制物的作用相反，在TCR模擬反應中ERK3似乎是內(nèi)皮細胞和T細胞增殖的正調(diào)控因子[34，39]。此外，ERK3也是內(nèi)皮細胞形成必需的組分，對其增殖也有一定的作用[40]。

4.2 ERK3與疾病的聯(lián)系

4.2.1 ERK3與心臟疾病 有研究表明，ERK3與致心律失常性右室心肌病(ARVC)和p70S6K信號有關[41]。ERK3在培養(yǎng)心肌細胞中的表達受到miR-374a-5p的調(diào)控。在缺血再灌注損傷(IRI)過程中，MAPK信號通路在肝臟、腎臟、腦和心臟被激活，體外證據(jù)表明，MAPK信號通路的調(diào)節(jié)可以減少缺氧性損傷[42]。作為MAPK信號通路的一員，ERK3過表達可促進缺氧/復氧(H/R)誘導的細胞凋亡[43]。Huang等[44]研究發(fā)現(xiàn)，在缺血再灌注后的H9C2細胞和小鼠缺血再灌注模型中，心肌細胞miR-374a-5p的表達水平降低；將肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)水平作為評價心肌細胞損傷和膜完整性的敏感指標，上調(diào)miR-374a-5p后模型小鼠血清和培養(yǎng)心肌細胞上清液中CK和LDH釋放的減少。此項研究發(fā)現(xiàn)miR-374a-5p的表達可能是由IRI介導的，并且可能起到保護心臟IRI的作用。ERK3是miR-374a-5p的靶向基因，miR-374a-5p可以直接與其3′-UTR結合來抑制ERK3的表達，當ERK3同時過表達時，miR-133a-5p的保護作用消失。

4.2.2 ERK3參與免疫和炎癥 胸腺中T細胞的產(chǎn)生由復雜的生物學機制介導。胸腺的干細胞，首先分化為未成熟的CD4-CD8-雙陰性(DN)胸腺細胞。這些細胞必須重排T細胞受體β(TCR-β)位點并表達前TCR(β選擇)，才能分化為CD4+CD8+雙陽性(DP)胸腺細胞。在胸腺細胞分化過程中，成熟的外周T細胞被T細胞受體(TCR)信號激活ERK1/2之后，可以誘導ERK3的表達，并且ERK3是由DP胸腺細胞進行正選擇而表達的。在ERK3缺陷小鼠模型中，T細胞的陽性篩選率減少，DP胸腺細胞數(shù)量減半，且對體外TCR刺激的反應明顯降低。Erk3+/+和Erk3-/-小鼠OT-Ⅰ和OT-OT-Ⅱ胸腺細胞體外培養(yǎng)24 h后存活率并沒有出現(xiàn)差異[45]。說明ERK3在T細胞陽性篩選中起到重要的作用，但并不會影響成熟DP胸腺細胞的存活。ERK3是否有促進炎癥的作用尚待研究。

4.2.3 ERK3對腫瘤形成的影響 ERK3在非小細胞肺癌、肝膽管癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞中高表達，且與細胞豐度呈正比。在肝臟腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)ERK3是肝癌細胞表達最高的MAPK組分，此外調(diào)控ERK3基因的非編碼RNA LncMAPK6和ERK3在肝癌干細胞中都有強烈的表達。LncMAPK6和ERK3參與了肝癌干細胞的維持調(diào)節(jié)。LncMAPK6與ERK3啟動子相互作用，將RNA聚合酶Ⅱ招募到ERK3啟動子上啟動轉(zhuǎn)錄，LncMAPK6-ERK3通路也是肝臟增殖和肝腫瘤起始細胞(TIC)清除的靶點[46]。Sun等[47]的研究表明，ERK3底物MK5可能具有抗腫瘤和促腫瘤雙重作用。該小組描述了MK5基因敲除小鼠更容易患7，12-二甲基苯并噻吩(DMBA)誘發(fā)的皮膚癌，推測MK5通過介導癌基因誘導的衰老來抑制皮膚癌的起始階段。MK5在致癌RAS增殖信號中作為負調(diào)控因子，其抑制細胞增殖的能力依賴于完整的激酶活性和核定位，因為無論是喪失激酶活性的突變體還是位于細胞質(zhì)中的突變體都不能阻止致癌RAS誘導的細胞增殖[48]。此外，MK5還能抑制RAS誘導的JNK活性。JNK通路與增殖有關，可以作為p53腫瘤抑制因子的負調(diào)節(jié)因子[48-49]。這些觀察表明，MK5通過雙重途徑阻止致癌RAS誘導的細胞增殖。MK5干擾JNK途徑的具體分子機制尚不清楚，在癌癥中與功能的聯(lián)系也尚未明確。此外，MYC蛋白可通過與MK5啟動子結合并增強MK5的表達而進入負反饋循環(huán)。由于MYC是細胞周期的中心調(diào)節(jié)因子，而異常的MYC表達在腫瘤發(fā)生中起著關鍵作用。Kress及其同事[50]研究了MYC高表達腫瘤細胞中的MK5表達狀態(tài)。其結果表明，MK5在正常結腸黏膜中的表達高于結直腸癌，而在正常結腸上皮中表達較弱，在結直腸癌組織中表達較強。

4.2.4 ERK3影響腫瘤的侵襲 ERK3增加肺癌細胞在體內(nèi)外的遷移和侵襲[51]。其潛在的分子機制涉及ERK3對類固醇受體共激活因子3(SRC3)Ser857位點的磷酸化[51]。SRC3在幾種類型的癌癥中過表達，包括乳腺癌、肺癌和前列腺癌等[52]，因為它促進了細胞的增殖和轉(zhuǎn)化，癌細胞的遷移和侵襲，以及小鼠的腫瘤形成和轉(zhuǎn)移[53-54]，被認為是真正的癌基因。在培養(yǎng)細胞中，SRC3通過共同激活PEA3-和AP-1調(diào)節(jié)的MMP表達[55-58]來促進癌細胞侵襲。ERK3通過磷酸化SRC3增強基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2和MMP10基因的轉(zhuǎn)錄[59]。MMP2和MMP10是SRC3/PEA3靶基因[59]。胰島素樣生長因子2 mRNA結合蛋白(IGF2BP，又稱IMP)屬于高度保守的蛋白質(zhì)家族，調(diào)節(jié)mRNAs的穩(wěn)定性、定位和翻譯，從而參與細胞極性形成和遷移[60-61]。IMP在各種人類癌癥中過度表達，它們與片狀脂質(zhì)體和內(nèi)陷足的形成有關，有助于轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，敲除ERK3和SRC3后幾乎消除了異種移植小鼠模型中肺癌細胞侵襲和形成腫瘤的能力。ERK3磷酸化SRC3-Ser857增加了SRC3與轉(zhuǎn)錄因子PEA3的相互作用，隨后導致基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的上調(diào)，降解細胞外基質(zhì)而對細胞侵襲發(fā)揮至關重要的作用[62]。

ERK3在多數(shù)瘤細胞中具有促進腫瘤侵襲的作用，主要通過以下3個方面：①通過磷酸化SCR3和上調(diào)SCR3介導的MMPs基因表達，改變腫瘤細胞的粘附性及形狀，使腫瘤細胞接觸面積變小，肌動蛋白細胞骨架重排加快腫瘤細胞的侵襲速度。②通過MK5刺激血管生成來支持腫瘤的生長和進展。MK5介導血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)反應，促使內(nèi)皮細胞遷移。VEGF主要與血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)結合，通過p38 MAPK亞型α和β的級聯(lián)反應觸發(fā)MK5 Thr-182位點磷酸化[63]。已經(jīng)證實p38 MAPK通路激活VEGF可誘導HSP27的磷酸化，并刺激內(nèi)皮細胞的肌動蛋白重組和遷移[64]。③ERK3在上皮結構的建立和維持中起到至關重要作用，在人類上皮性乳腺癌細胞中，抑制ERK3的表達會導致上皮細胞增厚，并伴有異常的粘附和緊密連接。轉(zhuǎn)錄因子AP-2α(TFAP2A)是上皮基因表達的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，參與ERK3依賴性基因表達的改變。ERK3是完全激活TFAP2A依賴的轉(zhuǎn)錄所必需的，而上皮結構的損傷是癌癥進展和轉(zhuǎn)移的標志。當敲除人乳腺上皮癌細胞系MCF7中ERK3基因時，上皮細胞的結構會發(fā)生改變，其連接功能也會受到破壞[40]。

4.2.5 ERK3的抑瘤作用 Chen等[65]在黑色素瘤中觀察到BRAF(B-Raf proto-oncogene)，一種致癌的Ser/Thr激酶，通過增加ERK3信使RNA水平和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性來上調(diào)ERK3表達水平。盡管上調(diào)ERK3基因轉(zhuǎn)錄需要BRAF的激酶活性，但BRAF以一種非激酶依賴的方式穩(wěn)定了ERK3蛋白，證明ERK3可以抑制黑色素瘤細胞的遷移、增殖和集落形成；同時，高水平的ERK3與黑色素瘤患者存活率增加相關。這些結果表明ERK3是黑素瘤細胞生長和侵襲性的有效抑制因子。MK5介導FOXO3a的Ser-215位點磷酸化，進而上調(diào)miR34b/c水平，miR-34b/c與c-myc mRNA結合導致c-myc蛋白水平降低[66]。myc蛋白通過與MK5啟動子結合又可增強MK5的表達，進而進入負反饋循環(huán)。MK5還能抑制RAS誘導的JNK活性。JNK通路與增殖有關，可以作為p53腫瘤抑制因子的負調(diào)節(jié)因子，研究表明MK5通過雙重途徑阻止致癌RAS誘導的細胞增殖。Kostenko等[67]推測MK5還可通過介導癌基因誘導的衰老來抑制皮膚癌的起始階段。這些令人興奮的發(fā)現(xiàn)均表明MK5具有腫瘤抑制功能。

不論是ERK3直接作用還是ERK3-MK5通路，似乎對某些腫瘤都發(fā)揮著抑制作用?？赡苁且驗镋RK3-MK5可作用于Ras/Raf通路的下游或參與c-myc表達的調(diào)節(jié)。Ras、Raf和c-myc基因是癌癥中最常見的突變基因，目前尚缺乏有效的Ras和c-myc抑制劑。ERK3和MK5將成為研制Ras、Raf或c-myc活性受到干擾的腫瘤治療藥物的突破點。

4.3 ERK3其他功能

近期，Takahashi等[40]在脊椎動物中發(fā)現(xiàn)，敲除胚胎表皮上皮細胞中ERK3基因破壞了上皮細胞中粘附和緊密連接蛋白的分布，以及緊密連接屏障功能，導致表皮破裂。此外，在人類上皮性乳腺癌細胞中，抑制ERK3的表達會導致上皮細胞增厚，并伴有異常的粘附和緊密連接。此外，ERK3/MK5通路的一個下游靶點，即轉(zhuǎn)錄因子FOXO1，它可以促進主要脂解酶甘油三酯脂酶(ATGL)的表達[68]。這是首次發(fā)現(xiàn)ERK3/MK5通路在能量代謝中發(fā)揮調(diào)控功能。

5 小結與展望

在腫瘤疾病模型中ERK3可被LncRNA調(diào)控，且ERK3在腫瘤的發(fā)生和侵襲中處于核心地位。因此，ERK3可能成為腫瘤相關性疾病治療的新靶點。然而現(xiàn)有研究還未闡明ERK3抑制或促進腫瘤遷移及增殖的分子機制。目前也沒有一種特異性的靶向藥物針對ERK3通路對腫瘤的發(fā)生及發(fā)展進行干預。雖然已有研究表明聯(lián)合運用二甲雙胍和三氧化二砷化療能夠促進肝內(nèi)膽管癌細胞ERK3表達，抑制腫瘤細胞增生，促進其凋亡，但此研究并未證明此效應是否由ERK3直接作用或間接作用所引起[69]。此外ERK3在細胞和組織中廣泛表達，特異性提高或降低其表達水平所引起的生物學效應有待進一步研究證實。相信在今后隨著人們對ERK3更深入的研究，ERK3通路在體內(nèi)的作用機制將會被更清楚地闡釋，從而在疾病的預防和治療過程中發(fā)揮更大的作用。