具核梭桿菌誘導(dǎo)CD8+T淋巴細胞表面抑制性受體KIR2DL1高表達在食管鱗癌中的臨床意義*

王小朋， 劉怡文， 原 翔， 邢瑤平， 王曉軍， 周福有，，4△

1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院胸外科，新鄉(xiāng) 453003 2河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南科技大學(xué)腫瘤醫(yī)院，河南省腫瘤表觀遺傳重點實驗室，洛陽 471003 3河南科技大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，洛陽 471003 4安陽市腫瘤醫(yī)院胸外科，安陽 455000

食管癌的發(fā)病率及死亡率極高，全世界每年新發(fā)的食管癌患者數(shù)量約50萬例[1]，其中一半以上發(fā)生在我國。鱗狀細胞癌是食管癌中最常見的組織學(xué)類型，約占食管癌總數(shù)的95%以上。

研究表明，多種病原微生物均可通過長期定植于機體，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2]。

具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum，F(xiàn)n)為口腔條件致病菌，其數(shù)量改變可引起微生態(tài)失衡。研究顯示，食管癌前病變組織中Fn含量豐富，且Fn感染的食管鱗癌患者生存期顯著縮短，雖具體致病機制尚不明確，但Fn與食管鱗癌的惡性進展密切相關(guān)[3]。著名的殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(killer cell immunoglobulin receptor，KIR)屬于免疫球蛋白超家族的一員[4]，其中KIR2DL1是CD8+T細胞表面重要的抑制性分子，其介導(dǎo)的免疫抑制是腫瘤免疫逃逸的重要機制之一，更是腫瘤免疫治療的主要障礙[5]。CD8+T細胞表面KIR2DL1的表達在維持機體自身免疫耐受和調(diào)控免疫應(yīng)答水平上發(fā)揮重要作用[6]，且與腫瘤的惡性進展呈正相關(guān)。臨床資料顯示，多種病原微生物均能誘導(dǎo)CD8+T細胞高表達抑制性受體[7]，使腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視，因此推測Fn可能通過誘導(dǎo)CD8+T細胞高表達KIR2DL1，使腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸，促進食管鱗癌的惡性進展。

本研究采用RNAscope及免疫組織化學(xué)方法分別檢測食管鱗癌患者癌組織及相應(yīng)癌旁組織中Fn感染及CD8+T細胞表面KIR2DL1的表達情況，并分析Fn對CD8+T細胞表面KIR2DL1的誘導(dǎo)效應(yīng)，及其與臨床病理特征及5年生存率的相關(guān)性，為食管鱗癌治療提供新思路和治療手段。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2014年1月到2014年12月安陽腫瘤醫(yī)院100例手術(shù)切除的癌組織及相應(yīng)癌旁組織(距癌組織邊緣≥5 cm的食管黏膜)石蠟包埋標(biāo)本為觀察對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)后病理診斷明確為食管鱗癌，且未合并其它腫瘤；②患者術(shù)前無呼吸系統(tǒng)等其他疾病，且未接受放化療和免疫治療；③治療性食管鱗癌切除術(shù)后；④病例資料信息全面；⑤隨訪時間為60個月(5年)；⑥術(shù)后常規(guī)化療；⑦以食管鱗癌導(dǎo)致的死亡為終點事件。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)后病理診斷非食管鱗癌，或合并有其它腫瘤；②術(shù)前有呼吸系統(tǒng)等其他疾病，或接受過放化療和免疫治療；③病例資料信息不完整；④非食管鱗癌導(dǎo)致的死亡患者。本研究經(jīng)安陽市腫瘤醫(yī)院及醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，并于術(shù)前獲得患者書面知情同意入組參與研究。

1.2 主要試劑與儀器

Fn特異性探針(16S rRNA特異探針)與RNAscope試劑盒(美國ACD公司)；光學(xué)顯微鏡(日本尼康公司，E100+ISH500)；SP-9000免疫組織化學(xué)試劑盒(中國中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；CD8與KIR2DL1兔多克隆抗體(美國Abcam公司)；檸檬酸抗原修復(fù)液、磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer saline，PBS)、二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine，DAB)顯色劑(中國索萊寶生物技術(shù)有限公司)。

1.3 RNAscope檢測癌組織及相應(yīng)癌旁組織中Fn感染情況

取每例患者常規(guī)石蠟包埋的癌組織及相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本塊，以2 μm進行連續(xù)切片；60℃溶蠟，二甲苯脫蠟，制備靶標(biāo)修復(fù)試劑，RNAscope雙氧水處理，畫疏水圈，RNAscope蛋白酶Plus處理，進行RNAscope顯色檢測(含F(xiàn)n特異性探針雜交)，實驗流程見參考文獻[8]。

1.4 免疫組化法檢測癌組織及相應(yīng)癌旁組織中CD8+T細胞表面KIR2DL1表達情況

取同批患者常規(guī)石蠟包埋的癌組織及相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本塊，以2 μm進行連續(xù)切片；60℃溶蠟(1.5 h)后立即放入二甲苯脫蠟(3次×10 min)，依次梯度乙醇水化(100%、95%、90%、85%乙醇各5 min)后流水沖洗1 min；94～98℃下檸檬酸鹽緩沖液抗原修復(fù)15 min，充分暴露抗原，PBS沖洗(3次×3 min)；過氧化物酶阻斷劑封閉10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS沖洗(3次×3 min)；滴加正常山羊血清避光封閉30 min，減少非特異性結(jié)合和背景染色；取2張連續(xù)切片，分別加入CD8和KIR2DL1特異性一抗(PBS稀釋比1∶200)各50 μL，4℃一抗孵育過夜；次日復(fù)溫1 h，PBS沖洗(3次×3 min)；滴加山羊抗鼠/兔聚合物室溫下孵育30 min；PBS沖洗(3次×3 min)；鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶室溫下封閉；PBS沖洗(3次×3 min)；DAB顯色，顯微鏡下觀察顯色適當(dāng)，立即蒸餾水終止顯色；蘇木精復(fù)染；梯度乙醇脫水(85%、90%、95%、100%乙醇各1 min)；二甲苯透明(3次×3 min)；風(fēng)干后中性樹膠封片。

1.5 結(jié)果判讀

RNAscope結(jié)果判定：Fn(16S rRNA)信號表達于腫瘤細胞中，呈紅色顆粒狀(圖1)。在400倍視野下計數(shù)20個腫瘤細胞內(nèi)顆粒數(shù)。100例標(biāo)本中計數(shù)的顆粒數(shù)的平均值作為判定陽性細胞的閾值，大于該值為陽性細胞。計算每個標(biāo)本中的陽性率，以陽性率的平均值作為判定陽性標(biāo)本的閾值，大于此閥值的為陽性標(biāo)本。在本次實驗中，F(xiàn)n在每個細胞中單獨的紅色顆粒≥8個或有成簇的信號為陽性細胞，每張切片中陽性細胞所占比例≥30%為陽性標(biāo)本，評分細則參考文獻[8]。

免疫組化結(jié)果判定：使用光學(xué)顯微鏡隨機挑選5個400倍視野，觀察2張連續(xù)切片中同一位置CD8與KIR2DL1表達情況。以2位資深病理科醫(yī)生共同判定的陽性切片為陽性對照，PBS緩沖液代替一抗的陰性切片為陰性對照。陽性表達判定標(biāo)準(zhǔn)：以2張連續(xù)切片同一位置淋巴細胞胞膜(CD8與KIR2DL1)同時出現(xiàn)淺黃色、棕黃色或棕褐色顆粒為CD8+T細胞表面KIR2DL1表達陽性。取5個高倍鏡(×400)視野評分的均值為最終免疫組織化學(xué)評分，0分定義為陰性，1～12分定義為陽性，評分細則見參考文獻[9]。

分組：Fn誘導(dǎo)CD8+T細胞表面KIR2DL1陽性組為3張連續(xù)切片中Fn、CD8和KIR2DL1同時判定為陽性的組織樣本，以Fn+CD8+KIR2DL1陽性組表示；不滿足同時陽性的歸為陰性組，以Fn+CD8+KIR2DL1陰性組表示。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，①計數(shù)資料一致性檢驗采用Cohen’s Kappa系數(shù)分析，相關(guān)性分析采用χ2檢驗；②生存曲線繪制采用Kaplan-Meier法；③生存時間之間差異分析采用Log-rank檢驗；④以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。100例食管鱗癌患者的術(shù)后隨訪時間為5年(60個月)，生存時間為入院時間至最后一次隨訪日期或死亡，刪失數(shù)據(jù)為隨訪至60個月仍存活的患者，未刪失數(shù)據(jù)為由食管鱗癌導(dǎo)致的死亡患者。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌患者臨床病理特征

本研究共納入食管鱗癌患者100例，其臨床病理特征如下：男66例，女34例；年齡<60歲44例，≥60歲56例；吸煙50例，不吸煙50例；飲酒52例，不飲酒48例；低分化21例，中高分化79例；侵及外膜71例，未侵及外膜29例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例；臨床分期為Ⅰ/Ⅱ期57例，Ⅲ/Ⅳ期43例；輕度化療敏感58例，中重度化療敏感42例。

2.2 Fn感染與CD8+T細胞表面KIR2DL1表達的檢測結(jié)果

食管鱗癌組織中可見癌細胞胞質(zhì)出現(xiàn)紅色顆粒，為Fn感染陽性(圖1A)；連續(xù)切片中可見同一位置淋巴細胞胞膜同時出現(xiàn)棕黃色顆粒，為CD8+T細胞表面KIR2DL1表達陽性(圖1B、1C)。且食管鱗癌組織中Fn感染與CD8+T細胞表面KIR2DL1表達具有顯著一致性(P<0.05，表1)。食管鱗癌患者癌組織Fn感染陽性率顯著高于相應(yīng)癌旁組織(32%vs.4%,P<0.05)，食管鱗癌患者癌組織CD8+T細胞表面KIR2DL1表達陽性率顯著高于相應(yīng)癌旁組織(31%vs.3%,P<0.05)，見圖1。

A、D、G：RNAscope檢測Fn表達(16S rRNA)；B、E、H：免疫組化檢測CD8表達；C、F、I：免疫組化檢測KIR2DL1表達圖1 食管鱗癌組織及相應(yīng)癌旁組織中Fn感染與CD8+T細胞表面KIR2DL1表達檢測結(jié)果(DAB顯色，×400)Fig.1 Detection of Fn infection and KIR2DL1 expression on CD8+T cell surface in esophageal squamous cell carcinoma and adjacent tissues(DAB staining，×400)

表1 Cohen’s Kappa系數(shù)分析食管鱗癌組織中Fn感染與CD8+T細胞表面KIR2DL1表達的一致性[例(%)]Table 1 Cohen’s Kappa coefficient analysis of the consistency between Fn infection and expression of CD8+T lymphocyte surface inhibitory receptor KIR2DL1 in esophageal squamous cell carcinoma[n(%)]

2.3 Fn誘導(dǎo)CD8+T細胞表面KIR2DL1高表達與食管鱗癌患者臨床病理特征的相關(guān)性

結(jié)果見表2。Fn+CD8+KIR2DL1陽性與食管鱗癌患者性別、吸煙、飲酒、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及化療敏感性均相關(guān)(均P<0.05)，與患者年齡無關(guān)。

表2 Fn+CD8+KIR2DL1陽性組與食管鱗癌患者臨床病理特征的相關(guān)性[例(%)]Table 2 Correlation between positive expression of CD8+T lymphocyte surface inhibitory receptor KIR2DL1 induced by Fn and clinicopathological features of patients with esophageal squamous cell carcinoma[n(%)]

續(xù)表2

2.4 Fn誘導(dǎo)CD8+T細胞表面KIR2DL1高表達與食管鱗癌患者5年生存預(yù)后的相關(guān)性

結(jié)果見表3、圖2與圖3。100例食管鱗癌患者術(shù)后5年總生存率及中位生存時間分別為34.80%、(37.00±4.50)個月，其中Fn+CD8+KIR2DL1陽性組5年生存率及中位生存時間為23.33%、(20.00±6.16)個月，顯著低于陰性組38.57%、(42.00±5.23)個月，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

表3 Fn+CD8+KIR2DL1陽性組與陰性組食管鱗癌患者生存時間(月)的均數(shù)和中位數(shù)Table 3 The mean and median survival time(months)of esophageal squamous cell carcinoma patients in Fn+CD8+KIR2DL1 positive and negative groups

圖2 食管鱗癌患者術(shù)后5年Kaplan-Meier生存曲線Fig.2 Kaplan-Meier survival curve of patients with esophageal squamous cell carcinoma 5 years after operation

圖3 Fn+CD8+KIR2DL1陽性組與陰性組食管鱗癌患者術(shù)后5年Kaplan-Meier生存曲線Fig.3 5-year Kaplan-Meier survival curve of esophageal squamous cell carcinoma patients in Fn+CD8+KIR2DL1 positive and negative groups

3 討論

食管鱗癌預(yù)后極差[10]，雖然傳統(tǒng)的手術(shù)、放化療以及靶向治療、免疫治療等手段在腫瘤綜合治療中不斷更新完善，但中晚期患者5年生存率仍低于20%[11]。食管鱗癌的病因至今尚不完全明確，其危險因素主要包括：吸煙、飲酒、飲食、慢性感染、免疫功能紊亂及遺傳易感性等[12]。食管鱗癌早期診斷困難，因此，尋找精準(zhǔn)的早期指標(biāo)、有效的預(yù)防措施及靶向治療方法顯得尤為重要。長期以來，腫瘤研究中有關(guān)病原微生物的慢性感染探討得不多，實際上，多種病原微生物均可通過重塑宿主免疫微環(huán)境，在腫瘤細胞中長期定植，導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸，促進其惡性進展[13]。盡管病原微生物感染對腫瘤的作用機制尚不完全明確，但清除病原微生物有助于控制腫瘤的惡性進展[14]。而Fn作為毒力最強的口腔致病菌之一，其內(nèi)毒素能抑制機體免疫應(yīng)答，從而長期定植于機體，促進口腔鱗癌、食管鱗癌以及結(jié)腸癌等多種腫瘤的惡性進展[15]。

病原微生物對腫瘤免疫微環(huán)境的重塑機制至今尚未完全明確，但多數(shù)可通過誘導(dǎo)免疫細胞表面高表達抑制性受體，使機體抗腫瘤免疫失能，從而長期定植并協(xié)助腫瘤細胞免疫逃逸[16]。幽門螺桿菌感染陽性的胃癌患者胃黏膜中CD8+T細胞和NK細胞表面抑制性受體顯著增高，使機體處于免疫抑制狀態(tài)，促進癌細胞惡性增殖[17]；乙肝病毒感染陽性的肝癌患者與Fn感染陽性的結(jié)腸癌患者CD8+T細胞表面均高表達抑制性受體，從而協(xié)助癌細胞逃避免疫監(jiān)視[18-19]。Fn為口腔條件致病菌，由于口腔頜面部靜脈瓣膜缺如，F(xiàn)n可隨血液循環(huán)輕易播散至全身，參與多種疾病進程[15]，且與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[20]。前期關(guān)于Fn感染與腫瘤的相關(guān)研究大都集中在癌細胞自身，有關(guān)腫瘤微環(huán)境的作用則探討不多。實際上，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)[21]。腫瘤微環(huán)境不僅為腫瘤的惡性行為提供豐富的物質(zhì)基礎(chǔ)，且能調(diào)控免疫細胞，使其無法發(fā)揮正常功能，導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸，促進其惡性進展[22]。

本研究發(fā)現(xiàn)食管鱗癌組織中Fn感染與CD8+T細胞表面KIR2DL1表達顯著高于相應(yīng)癌旁組織，且癌組織中二者表達具有顯著一致性，提示癌組織的微環(huán)境更適于Fn定植，而Fn可能通過誘導(dǎo)CD8+T細胞表面KIR2DL1高表達，抑制免疫反應(yīng)，使腫瘤細胞免疫逃逸。本研究分析了Fn誘導(dǎo)CD8+T細胞表面KIR2DL1高表達與食管鱗癌患者臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果顯示在食管鱗癌中，F(xiàn)n+CD8+KIR2DL1陽性組與患者性別、吸煙與飲酒顯著相關(guān)，提示陽性組多為吸煙飲酒的男性患者，可能長期吸煙、飲酒導(dǎo)致口腔環(huán)境惡劣，F(xiàn)n更容易感染并定植，從而誘導(dǎo)CD8+T細胞表面KIR2DL1高表達；且陽性組患者在低分化食管鱗癌的比例較中高分化組高，提示惡性程度更高的腫瘤及其微環(huán)境更利于Fn生存，并誘導(dǎo)CD8+T細胞表面高表達KIR2DL1；同時陽性組與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及化療敏感度顯著相關(guān)，提示Fn對CD8+T細胞表面KIR2DL1的誘導(dǎo)效應(yīng)可能促進了腫瘤的惡性進展；本研究還發(fā)現(xiàn)陽性組患者5年生存率及中位生存時間均明顯低于陰性組，提示Fn對CD8+T細胞表面KIR2DL1的誘導(dǎo)效應(yīng)可能會縮短食管鱗癌患者生存期。

綜上所述，在食管鱗癌組織中Fn可能通過誘導(dǎo)CD8+T細胞表面KIR2DL1高表達，為自身持續(xù)感染提供有利微環(huán)境，從而促進腫瘤進展。有效清除Fn并抑制CD8+T細胞表面KIR2DL1表達可能會延長食管鱗癌患者的生存期，在食管鱗癌的臨床治療方面具有十分重要的意義和廣泛的應(yīng)用前景。