鎘脅迫處理對(duì)水培苦苣幼苗生理響應(yīng)及葉片超微結(jié)構(gòu)的影響

朱潤(rùn)華，賀忠群，王海霞，白 勝，陽(yáng)圣瑩，蔣浩宏

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院服務(wù)中心,四川 成都 610066;2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,四川 成都 611130)

【研究意義】近年來，日益嚴(yán)重的重金屬污染問題亟待解決，其中鎘(Cd)因其高污染和可遷移性，越來越受到關(guān)注,同時(shí)鎘對(duì)多數(shù)有機(jī)體有毒害作用，并會(huì)隨著食物鏈進(jìn)入人體，危害人類健康[1-2]。【前人研究進(jìn)展】金利堅(jiān)等[3]抽取的四川省21個(gè)市州993分樣品中，土壤鎘含量超標(biāo)樣品占56.90%。當(dāng)植物在受到高質(zhì)量濃度鎘脅迫后，會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)抑制，株高、鮮重下降、葉片萎黃等現(xiàn)象，同時(shí)細(xì)胞質(zhì)膜的組分、結(jié)構(gòu)及選擇透性也受到影響，導(dǎo)致植物細(xì)胞損傷并影響其生理代謝，嚴(yán)重時(shí)造成植物死亡[4-6]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】苦苣(CichoriumendiviaL.)是菊科一二年生草本植物，又名苦菊、苦菜，其資源分布較為廣泛[7-9]，是人們喜食的鮮食蔬菜。但目前缺乏關(guān)于苦苣鎘脅迫的生理過程研究，其對(duì)重金屬的耐受差異性也缺乏研究支持。水培技術(shù)是無土栽培技術(shù)中應(yīng)用較為廣泛的一種，采用水培方法生產(chǎn)苦苣，可以有效地了解和調(diào)控苦苣的生長(zhǎng)環(huán)境，也可以更好的了解各種元素對(duì)于苦苣生長(zhǎng)的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】苦苣在已知的生產(chǎn)栽培中表現(xiàn)出了較強(qiáng)的適應(yīng)性，研究鎘脅迫條件下苦苣的生長(zhǎng)及生理特性的變化，以及鎘脅迫下水培苦苣葉片的超顯微結(jié)構(gòu)變化，可為以后苦苣的推廣種植以及重金屬積累研究等方面提供參考建議。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)的植物材料為花葉苦苣(CichoriumendiviaL.)，由北京東升種業(yè)有限公司提供。

在原霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液基礎(chǔ)上進(jìn)行調(diào)整，其中A母液含四水硝酸鈣70.8 g/L、硝酸鉀80.8 g/L；B母液含磷酸氫二銨15.4 g/L、七水硫酸鎂49.2 g/L；C母液含EDTA鐵鈉鹽50 g/L、硼酸4.26 g/L、四水硫酸錳5.72 g/L、七水硫酸鋅0.44 g/L、五水硫酸銅0.16 g/L、四水鉬酸銨0.04 g/L。水培苦苣每3 d補(bǔ)充1次營(yíng)養(yǎng)液，每次0.5 L。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)2020年3月至4月在四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院服務(wù)中心農(nóng)業(yè)工程研究中心植物工廠內(nèi)進(jìn)行，采取半封閉管理。光源采用三基色熒光燈，光譜如圖1所示。每天光照12 h(7:00-19:00)室內(nèi)，溫度20 ℃。 苦苣種子在催芽箱中露白出芽后，定植于水培槽(規(guī)格為40 cm×30 cm×5 cm)中，每個(gè)水培槽中種植120株苦苣幼苗，如未成功定植及時(shí)補(bǔ)苗。

圖1 植物工廠人工光源光譜

所有幼苗出現(xiàn)5片真葉后進(jìn)行鎘脅迫。在水培槽中添加含有不同濃度氯化鎘的營(yíng)養(yǎng)液0.5 L。營(yíng)養(yǎng)液濃度分別設(shè)置為0 mg/L氯化鎘(CK)，0.5 mg/L氯化鎘(A1)，1 mg/L氯化鎘(A2)，5 mg/L氯化鎘(A3)，10 mg/L氯化鎘(A4)。A1為低濃度鎘處理，A4為鎘高濃度處理。每個(gè)處理3次重復(fù),共15個(gè)水培槽。到30 d時(shí)添加的營(yíng)養(yǎng)液不再含氯化鎘。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

在處理30 d時(shí)進(jìn)行生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定:株高、地上部分鮮重，水培苦苣幼苗致死率(%)=死亡株數(shù)/總株數(shù)×100%[10],均取平均值。

鎘脅迫3 d時(shí)測(cè)定地上部分鎘含量[11]；葉片丙二醛(MDA)測(cè)定參考熊慶娥[12]的方法；游離脯氨酸測(cè)定采用酸性茚三酮比色法；SOD活性測(cè)定參考李合生[13]的方法；POD性測(cè)定參考王學(xué)奎[14]的方法；葉綠素含量測(cè)定參考LICHTENT-HALER等[15]的方法。

1.4 葉片超微結(jié)構(gòu)的觀察

處理3 d時(shí)，將地上部分嫩葉送四川大學(xué)電鏡室用透射電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)變化。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用Excel對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用SPSS 軟件(新復(fù)極差法)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘脅迫處理對(duì)水培苦苣鎘積累的影響

由表1可知，鎘脅迫3 d時(shí)，A4處理苦苣鎘含量超過國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)[16]，CK處理的鎘含量小于或等于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)限定量，故未標(biāo)注具體數(shù)值。

表1 鎘脅迫3 d時(shí)苦苣幼苗的總鎘含量

2.2 鎘脅迫對(duì)水培苦苣幼苗生長(zhǎng)的影響

2.2.1 鎘脅迫對(duì)苦苣幼苗致死率、地上部分鮮重和株高的影響 鎘處理使苦苣幼苗的死亡率顯著提高(表2)隨著營(yíng)養(yǎng)液中鎘濃度增高，處理30 d時(shí)苦苣幼苗死亡率也隨之升高。與對(duì)照相比，A1和A4處理的苦苣幼苗死亡率分別提高了166.80%和933.20%。

表2 鎘脅迫對(duì)苦苣幼苗死亡率、鮮重和株高的影響

鎘脅迫30 d時(shí)，處理組與CK組相比，苦苣幼苗地上部分鮮重和株高顯著降低。隨著營(yíng)養(yǎng)液中鎘濃度的增加，苦苣幼苗地上部分的鮮重和株高均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。與CK相比，A4處理苦苣幼苗地上部分平均鮮重下降35.55%，株高下降22.19%。

2.3 鎘脅迫對(duì)水培苦苣幼苗葉綠素及類胡蘿卜素的影響

隨著鎘濃度升高，苦苣幼苗葉片內(nèi)的葉綠素a、

葉綠素b、總?cè)~綠素含量均表現(xiàn)為先升高后下降的變化趨勢(shì)(表3)。A3處理苦苣幼苗葉片總?cè)~綠素含量最大，與CK相比，A3處理葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量分別提高26.15%、26.27%和26.18%。A4處理與A3處理相比，葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量分別下降5.24%、4.55%和4.97%。類胡蘿卜素含量隨著營(yíng)養(yǎng)液中鎘濃度增大表現(xiàn)出逐漸升高的變化趨勢(shì)，A4處理苦苣幼苗葉片類胡蘿卜素含量含量達(dá)到最大值，相比CK處理提高23.36%。所有處理水培苦苣幼苗的類胡蘿卜素的含量均遠(yuǎn)高于總?cè)~綠素含量。

表3 鎘脅迫對(duì)苦苣幼苗葉片總?cè)~綠素、葉綠素a、葉綠素b含量及類胡蘿卜素的影響

2.4 鎘脅迫對(duì)苦苣幼苗游離脯氨酸含量和丙二醛的影響

隨著鎘濃度升高，苦苣幼苗葉片游離脯氨酸含量總體表現(xiàn)為先升高后降低的變化趨勢(shì)(表4)。與CK相比，A1處理的脯氨酸含量顯著提高，升高25.45%，A4處理比A1處理苦苣幼苗體內(nèi)游離脯氨酸含量下降19.42%，但還是略高于CK處理。隨著鎘濃度升高，苦苣幼苗葉片丙二醛(MDA)含量總體表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)。與CK相比，A1處理的丙二醛含量顯著增加，相比CK提升14.00%，而含量最低為A4處理，較A1處理苦苣幼苗體內(nèi)游離脯氨酸含量下降11.25%。

表4 鎘脅迫對(duì)苦苣幼苗葉片游離脯氨酸和丙二醛含量的影響

2.5 鎘脅迫對(duì)葉片超氧化歧化酶(SOD)活性和過氧化物酶POD的影響

隨著鎘濃度升高，鎘處理使苦苣幼苗葉片內(nèi)的SOD活性呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)(表5)，A1、A2、A3、A4處理中SOD活性相比于CK處理顯著下降，下降幅度分別為53.08%、57.25%、78.66%和88.61%。A1和A2處理與CK相比，SOD活性表現(xiàn)為降低，但兩組處理間沒有顯著性差異。處理A3和A4的SOD活性下降幅度與營(yíng)養(yǎng)液氯化鎘濃度表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)性。苦苣幼苗葉片內(nèi)的POD活性也呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，處理A1相比CK處理下降3.10%，A2處理POD活性最低，比CK降低11%，POD活性最高為A4處理，較CK升高27%。

表5 鎘脅迫對(duì)苦苣幼苗葉片超氧化歧化酶(SOD)活性和過氧化物酶(POD)活性含量的影響

2.6 鎘脅迫對(duì)水培苦苣幼苗葉片超微結(jié)構(gòu)的影響

2.6.1 鎘脅迫對(duì)苦苣幼苗葉綠體形態(tài)及分布的影響 CK處理苦苣幼苗的葉綠體與細(xì)胞膜貼合均勻緊密(圖2)，葉綠體形態(tài)狹長(zhǎng)扁平，內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)完整，有利于最大程度接受光能；隨著鎘處理濃度增加，葉片內(nèi)的葉綠體與細(xì)胞膜之間緊貼程度下降，逐漸脫離細(xì)胞膜或與細(xì)胞膜貼合出現(xiàn)空隙，在細(xì)胞質(zhì)中扎堆分布，葉綠體形態(tài)發(fā)生不同程度的腫脹，且隨著總鎘含量增加，葉綠體腫脹變形程度也逐漸增加。

a：葉綠體；b：基粒片層；c：淀粉粒；d：嗜鋨顆粒

2.6.2 鎘脅迫對(duì)苦苣幼苗葉綠體內(nèi)淀粉粒的影響 CK處理苦苣幼苗葉片的葉綠體內(nèi)淀粉粒體積較小且含量較少，多數(shù)葉綠體內(nèi)觀察不到淀粉粒；隨著營(yíng)養(yǎng)液中氯化鎘濃度的增加，從A1處理開始，苦苣幼苗葉片的葉綠體內(nèi)淀粉粒數(shù)量增加，但體積依舊較?。辉贏2和A3處理中，苦苣幼苗葉片的葉綠體內(nèi)的淀粉粒迅速增大，在葉綠體中占據(jù)較大體積；與CK處理與A1處理相比，A4處理苦苣幼苗葉片幾乎所有葉綠體均含有淀粉粒，葉片葉綠體中淀粉粒大量增加且體積較大。

2.6.3 鎘脅迫對(duì)苦苣幼苗葉綠體內(nèi)嗜鋨顆粒的影響 CK、A1、A2處理下，苦苣幼苗葉綠體內(nèi)的嗜鋨顆粒體積都相對(duì)較小，數(shù)量也較少；A3處理中苦苣幼苗葉綠體內(nèi)的嗜鋨顆粒數(shù)量相對(duì)較少，但與其他處理相比體積明顯增大；A4處理中，嗜鋨顆粒體積較小，數(shù)量較適中。

2.6.4 鎘脅迫對(duì)苦苣幼苗基粒的影響 在CK、A1處理中生長(zhǎng)的苦苣幼苗，葉綠體內(nèi)部基粒和基質(zhì)類囊體排列較為有序，片層結(jié)構(gòu)規(guī)則，沒有出現(xiàn)明顯變形，片層之間也未出現(xiàn)明顯間隙。隨著苦苣幼苗體內(nèi)總鎘含量的增加，苦苣幼苗葉綠體基粒片層之間出現(xiàn)了明顯的間隙，基粒垛疊結(jié)構(gòu)變得模糊，片層發(fā)生斷裂，部分類囊體膜糊不清，類囊體之間出現(xiàn)扭曲或者膨脹，在A4處理中最為明顯。

3 討 論

葉綠素是光合作用中最重要的色素，在接受、傳遞、轉(zhuǎn)化光能上發(fā)揮著不可替代的作用，其含量的高低與光合作用密切相關(guān)[17]。本研究結(jié)果顯示，鎘脅迫下葉綠素含量整體表現(xiàn)為先升高后降低的變化趨勢(shì)，可能是因?yàn)榈蜐舛孺k刺激葉綠素合成，進(jìn)而維持光合作用，而隨著苦苣幼苗體內(nèi)總鎘含量的增加，脅迫程度超過葉綠素合成速度的極限，同時(shí)產(chǎn)生了大量的活性氧自由基，對(duì)葉綠素被膜產(chǎn)生過氧化作用，導(dǎo)致葉綠素降解。

類胡蘿卜素是主要位于光合與非光合植物質(zhì)體中的脂溶性抗氧化劑[18]，可以清除植物體內(nèi)的自由基，防止膜脂質(zhì)過氧化，穩(wěn)定膜脂質(zhì)雙分子層[19]。類胡蘿卜素也是構(gòu)成植物葉、花和果實(shí)顏色的重要成分之一[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著苦苣幼苗體內(nèi)總鎘含量的增加，類胡蘿卜素含量趨勢(shì)表現(xiàn)為逐漸增加。在植物體內(nèi)，類胡蘿卜素能夠防止光氧化產(chǎn)生的破壞作用并協(xié)助葉綠素吸收光能，但正常情況下葉片中葉綠素含量均高于類胡蘿卜素含量，本試驗(yàn)中類胡蘿卜素含量卻遠(yuǎn)高于葉綠素，可能由以下三個(gè)原因?qū)е拢阂皇怯捎诳嘬挠酌缤ㄟ^增加類胡蘿卜素含量加強(qiáng)清除活性氧的能力；二是由于類胡蘿卜素組成復(fù)雜，對(duì)鎘的敏感程度小于葉綠素，與朱喜鋒等[21]的研究結(jié)果一致，Cd2+通過損害光合作用器官、結(jié)合生物大分子的活性位點(diǎn)(如Cd2+取代葉綠素分子中心的Mg2+從而破壞葉綠素結(jié)構(gòu))影響光合作用；三是由于植物工廠人工光源的光照強(qiáng)度過高，類胡蘿卜素基于調(diào)節(jié)吸收過剩光能的作用，植物自身適應(yīng)性調(diào)節(jié)，進(jìn)而積累了較多的類胡蘿卜素。

植物的質(zhì)膜透性變化和滲透調(diào)節(jié)相關(guān)研究在植物逆境反應(yīng)研究中較為普遍。本研究表明，鎘脅迫對(duì)苦苣幼苗滲透作用相關(guān)調(diào)節(jié)物質(zhì)和質(zhì)膜透性變化的影響是基本一致的。游離脯氨酸作為重要滲透保護(hù)劑，在各個(gè)生理逆境中均表現(xiàn)了游離脯氨酸的積累[22]。其主要作用在于保持細(xì)胞內(nèi)外水分平衡、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外滲透勢(shì)，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)相關(guān)代謝功能的正常進(jìn)行具有重要意義[23]。丙二醛(MDA)是植物遭受逆境脅迫程度高低的重要指標(biāo)[24]，其含量的變化可以反映出質(zhì)膜透性變化所導(dǎo)致的電解質(zhì)外滲，了解細(xì)胞膜脂的過氧化程度。在低濃度鎘脅迫時(shí)，苦苣幼苗自身的滲透調(diào)節(jié)和質(zhì)膜透性就開始產(chǎn)生變化，游離脯氨酸含量與丙二醛含量整體均表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢(shì)。隨著鎘濃度增加，脅迫程度超過苦苣幼苗自身調(diào)節(jié)作用的極限，相關(guān)滲透調(diào)解物質(zhì)含量下降，進(jìn)而對(duì)植物細(xì)胞造成傷害。

重金屬離子對(duì)植物地上部分的影響也存在于呼吸作用中，楊樹華等[25]研究表明，水稻種子萌發(fā)時(shí)的呼吸強(qiáng)度隨鉛離子濃度增加而降低，呈顯著負(fù)相關(guān)性。低濃度鎘刺激植物呼吸酶以產(chǎn)生能量是呼吸增加的原因，隨鎘濃度增加酶活性受抑制呼吸作用下降[26]。當(dāng)植物遭遇逆境脅迫時(shí)，體內(nèi)自由基(ROS)、活性氧積累量提升，抗氧化酶活性在自身調(diào)節(jié)作用下也會(huì)相應(yīng)提高。但本試驗(yàn)中，隨著營(yíng)養(yǎng)液中添加氯化鎘溶液濃度的增加，苦苣幼苗內(nèi)SOD酶活性表現(xiàn)為逐漸降低。在A1處理下，低濃度鎘造成的脅迫程度較輕，而SOD酶活性相較于空白組依舊下降了53%，可能是由于鎘直接作用在SOD酶合成的代謝通路上，進(jìn)而降低了苦苣幼苗體內(nèi)SOD酶的活性。SOD酶可以將自由基、活性氧轉(zhuǎn)化為無害的水與氧氣，進(jìn)而間接降低重金屬離子對(duì)植株的傷害，本試驗(yàn)中水培苦苣幼苗在吸收鎘后，無法正常清除自由基、活性氧等超氧陰離子，進(jìn)而也間接解釋了30 d時(shí)高濃度鎘溶液處理導(dǎo)致苦苣幼苗的高致死率和在處理3 d時(shí)幼苗體內(nèi)總鎘含量累積較快的原因。

SOD等抗氧化關(guān)鍵酶在清除調(diào)節(jié)植株體內(nèi)的活性氧，抵御、減輕活性氧造成的傷害上起重要作用。SOD能夠?qū)⒊蹶庪x子歧化為過氧化氫(H2O2)，緩解超氧陰離子對(duì)植株的毒害作用[27]，POD能夠清除不同細(xì)胞位置的H2O2，使之轉(zhuǎn)化為H2O[28]。POD酶活性的變化沒有SOD劇烈,且表現(xiàn)為先下降后上升的趨勢(shì)，在A2處理到達(dá)最低值，說明苦苣幼苗在受到鎘脅迫時(shí)，有些抗氧化酶活性受到抑制，但整個(gè)酶保護(hù)系統(tǒng)還是起到了一定緩解自由基危害的作用，使其他酶活性升高，一定程度上緩解了鎘脅迫下活性氧自由基對(duì)膜質(zhì)的損傷，并對(duì)植株的正常生長(zhǎng)造成了一定的影響。該結(jié)果可能是因?yàn)殒k雖然影響了氧化酶的合成途徑，但是隨著鎘濃度的增加，對(duì)酚類物質(zhì)的代謝起到了部分刺激作用，才使得POD酶的活性隨之增高。

對(duì)苦苣幼苗葉片的超顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn), A1處理中,葉綠體沿細(xì)胞膜均勻分布且可以緊貼細(xì)胞膜。內(nèi)部結(jié)構(gòu)較為完整,基粒片層結(jié)構(gòu)規(guī)則有序，基質(zhì)類囊體結(jié)構(gòu)清晰,有利于光能的接收、利用、轉(zhuǎn)化。隨著鎘脅迫程度的增加,葉綠體分布不再均勻沿著細(xì)胞膜,在細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)部分扎堆聚集的現(xiàn)象。葉綠體外背膜不再光滑清晰,基粒膨脹且排布開始混亂，基粒片層間出現(xiàn)明顯間隙,部分類囊體變得膜糊不清,造成的原因可能是鎘直接破壞葉綠體的膜結(jié)構(gòu)或者細(xì)胞質(zhì)膜，進(jìn)而造成葉綠體變形失活；鎘脅迫阻礙了淀粉的水解和向外運(yùn)輸，使得葉綠體內(nèi)出現(xiàn)較大體積淀粉粒，與孔維萍等[29]研究結(jié)果相似；鎘阻礙了葉綠體光合電子傳遞,使光化學(xué)活性降低；亦或者是由于無法及時(shí)清除活性氧自由基，進(jìn)而造成葉綠體結(jié)構(gòu)和功能的破壞。隨著苦苣幼苗體內(nèi)鎘積累量的增加，葉綠體與細(xì)胞膜之間的空隙也在增加，說明在較高濃度鎘脅迫下，重金屬離子會(huì)越來越多的沉積在細(xì)胞膜表面，而植株通過自身調(diào)節(jié)，使葉綠體脫離細(xì)胞膜，進(jìn)而緩解鎘脅迫對(duì)細(xì)胞功能帶來的損傷。另外，苦苣幼苗對(duì)嗜鋨顆粒不敏感，隨著鎘脅迫程度的增加，嗜鋨顆粒數(shù)量的累計(jì)與體積大小并沒有相關(guān)性變化。

4 結(jié) 論

鎘積累對(duì)苦苣幼苗植株生長(zhǎng)及葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)均造成了較大影響。在鎘脅迫下，苦苣幼苗通過自身調(diào)節(jié)葉綠素和類胡蘿卜素的含量，改變質(zhì)膜透性和滲透調(diào)節(jié)作用，提高了植株對(duì)鎘脅迫的適應(yīng)性。所以苦苣對(duì)鎘具有一定的耐性，但過量的鎘會(huì)破壞苦苣的部分酶(超氧化歧化酶、過氧化物酶)活性，引起自身調(diào)節(jié)功能紊亂和代謝異常。此外，隨著鎘脅迫程度的增加，苦苣幼苗葉綠體結(jié)構(gòu)變化較大、功能遭到破壞，進(jìn)而影響植株整體的生長(zhǎng)。因此，本研究結(jié)果對(duì)以后更加研究深入地研究重金屬脅迫對(duì)苦苣幼苗形態(tài)結(jié)構(gòu)、逆境應(yīng)答的影響具有重要意義。