高壓脈沖電場預處理普洱熟茶對SD大鼠體內活性氧(ROS)水平的影響

冷 彥，王 靜，吳文斗，沈曉靜，陳立佼，楊賀凱，吳 奇，王白娟*

(1.云南農業(yè)大學，云南 昆明 650201; 2.云南省有機茶產業(yè)智能工程研究中心, 云南 昆明 650201; 3.云南省高校智能有機茶園建設重點實驗室，云南 昆明 650201)

【研究意義】國家標準《地理標志產品 普洱茶》(GB/T 22111-2008)中，將普洱茶定義為“普洱茶是以地理標志保護范圍內的云南大葉種曬青茶為原料，并在地理標志性保護范圍內采用特定的加工工藝制成，具有獨特品質特征的茶葉”[1]。研究表明，普洱茶具有抗腫瘤[2]、抗氧化[3]、降脂[4-5]、降血糖[6]、抗疲勞[7]、提高免疫力[8]等多種保健功效，其中其抗氧化活性與多酚類化合物密切相關[9]。【前人研究進展】國內外普洱茶活性物質如茶多酚[10]、茶多糖、茶色素、茶皂素[11]等的化學特性與結構不斷被闡明，但普洱熟茶的體內抗氧化研究的報道相對較少?；钚匝?reactive oxygen species，ROS)是指生物體內與氧代謝有關的含氧自由基和不以自由基形式存在的具有高活性的中間產物，具有活潑和代謝迅速的特質[12]。ROS在生物體內參與信號轉導、基因表達調控、免疫反應等過程，是機體有效防御系統(tǒng)的重要組成部分，但過量的ROS亦可對生物膜以及蛋白質、脂類等生物大分子造成氧化損傷[13]。田華燕[14]，徐麗娟[15]，王天祿[16]等通過實驗研究發(fā)現(xiàn)茶褐素對DPPH自由基、ABTS+自由基和羥自由基均有顯著的清除效果，具有較好的抗氧化活性?！颈狙芯壳腥朦c】目前，活性氧作為信號分子的研究大多集中在其如何影響模式植物營養(yǎng)器官的生長發(fā)育，但對其在動物體內水平的調節(jié)機制尚未有報道。【擬解決的關鍵問題】高壓脈沖電場(high voltage pulsed electric field，HPEF)處理技術是對位于2個電極板之間的物料不間歇地施加高壓脈沖波進行處理的過程，研究表明，適當?shù)腍PEF條件可以提高普洱熟茶中茶多糖的提取速率和抗氧化活性[17]，提高茶多酚的抗氧化活性[18]。本研究以云南臨滄三級普洱熟茶為材料，以適宜的高壓脈沖電場及真空冷凍干燥技術處理后獲得普洱熟茶速溶茶粉，采用DCFH-DA(2,7-dichlorofuorescin diacetate)細胞內活性氧檢測探針檢測飼喂SD大鼠體內過氧化物水平變化，探究高壓脈沖電場預處理普洱熟茶對SD大鼠體內過氧化物水平的影響及維持體內代謝平衡的可行性，為普洱茶中天然抗氧化劑的開發(fā)和應用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

云南臨滄三級普洱熟茶(散茶)(云南福茶茶葉有限公司生產)；茶褐素，純度≥0.7 g·g-1(云南十草木生物科技有限公司生產)；ROS試劑盒(南京建成生物工程研究所生產)；SPF級雌性SD大鼠(昆明楚商科技有限公司提供)，8周齡，體質量(245±20)g。

DMC-200型高壓脈沖電源及處理箱(大連鼎通科技發(fā)展有限公司生產)；多功能熒光酶標儀(上海閃譜生物科技有限公司生產)；熒光顯微鏡(上海光學儀器廠生產)。

1.2 試驗方法

1.2.1 確定HPEF預處理條件 將HPEF處理時間設置為55 min，頻率分別為80、99、121、139、162 Hz，電壓在12～22 kV，通過正交方式組合成55組，各組參數(shù)條件詳見表1。按照國家標準《茶葉感官審評方法》(GB/T 23776-2018)中的審評方法進行HPEF處理茶樣的感官審評[19]。感官審評結果：第45組(HPEF：12 kV/162 Hz/55 min)的感官品質最好，收斂性最好。因此，選擇12 kV/162 Hz/55 min條件下HPEF處理的普洱熟茶作為動物試驗材料。

表1 HPEF電壓、頻率的設置

1.2.2 制備速溶茶粉 采用真空冷凍干燥技術制備茶粉，分別取普洱熟茶和經過HPEF預處理過的普洱熟茶1 kg，沸水浸提3次(各次茶水比為1∶20、1∶20、1∶100)，浸提時間分別為10、20、25 min，合并3次浸提液，放入真空冷凍干燥箱進行干燥，待冰晶完全消失后，將干燥后的茶粉刮下并放入自封袋中密封保存，茶粉的得率約為25%。

1.2.3 試驗設計 根據(jù)陳宗道等人研究推薦成人每日平均用茶量6 g，中國男女總平均體重60 kg，則成人每日用茶量為每千克體重0.1 g[20]。根據(jù)《保健食品功能評價》要求，本試驗采用SD大鼠按人體推薦量的5倍作為最低劑量，中、高劑量分別為人體推薦量的10倍和20倍，即高、中、低劑量組分別給予普洱熟茶2.0、1.0和0.5 g·kg-1。取大鼠160只，按體重隨機分為8組，每組20只。設置處理1，HPEF預處理高劑量組(2.0 g·kg-1·bw)；處理2，HPEF預處理中劑量組(1.0 g·kg-1·bw)；處理3，HPEF預處理低劑量組(0.5 g·kg-1·bw)；處理4，未預處理普洱熟茶高劑量組(2.0 g·kg-1·bw)；處理5，未預處理普洱熟茶中劑量組(1.0 g·kg-1·bw)；處理6，未預處理普洱熟茶低劑量組(0.5 g·kg-1·bw)；處理7(CK1)，空白對照組，飼喂清水；處理8(CK2)，陽性對照組，飼喂茶褐素(1.0 g·kg-1·bw)。采用灌胃給藥，空白組的大鼠給以相當量的飲用水，灌胃時間為每天17:00-19:00時。分別在4周和8周后，檢測大鼠肝、腎、心、腦組織內ROS水平。

1.2.4 指標測定 按ROS測試盒說明書操作，活殺老鼠，取肝、腎、心、腦，在預冷的PBS中清洗血跡和其他污染物，用眼科剪將組織塊剪碎，將組織放300目尼龍網(wǎng)上輕搓，邊搓邊用PBS沖洗，直至將組織搓完。收集細胞懸液，500 r/min離心10 min取上清液，并用PBS清洗1～2次，并重懸制備單細胞懸液，細胞計數(shù)。

Q=(M÷4)×104×N

式中：Q表示細胞數(shù)，個·mL-1；M表示顯微鏡視野中細胞總數(shù)，個·mL-1；N表示溶液稀釋倍數(shù)。

向Q≤106的單細胞懸液中加入DCFH-DA，濃度為10 μmol/L，37 ℃孵育細胞30 min，1000 r/min離心收集細胞沉淀物用于熒光檢測。熒光檢測激發(fā)波長設置為500 nm，發(fā)射波長設置為525 nm。結果用熒光強度/組織鮮重(f·mg-1)表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0和DPS 9.01軟件進行統(tǒng)計分析，利用Duncan新復極差法進行方差分析與多重比較，Excel 2016軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 ROS檢測結果

如表2所示，4周后各組織中處理1～6的ROS水平均低于處理7(CK1)，表明普洱熟茶能降低大鼠肝、腎、心、腦組織中的ROS水平，且同一條件下的3個不同處理ROS水平隨普洱熟茶劑量的增加而降低。各組織中ROS水平處理1均低于處理8(CK2)，表明HPEF高劑量處理能達到茶褐素對ROS的抑制效果。各組織中未預處理組的ROS水平均比處理8(CK2)高，表明未預處理的普洱熟茶達不到茶褐素對ROS的抑制效果。

表2 大鼠肝、腎、心、腦組織中ROS水平(4周后)

肝臟組織ROS水平處理1、處理2極顯著低于處理7(CK1)，分別降低了23.48%、19.62%；處理3、處理4顯著低于處理7(CK1)，分別降低了15.21%、13.26%；處理2極顯著低于處理5，處理3顯著低于處理6，表明肝臟組織中HPEF預處理組效果優(yōu)于未預處理組。腎臟組織ROS水平處理1—處理4均極顯著低于處理7(CK1)，分別降低了59.81%、57.74%、53.36%、40.92%，處理5比處理7(CK1)顯著降低了27.06%；處理2顯著低于處理5，處理3極顯著低于處理6，表明腎臟組織中HPEF預處理組效果優(yōu)于未預處理組。相比于處理7(CK1)，心臟組織ROS水平處理1極顯著降低了29.38%，處理2顯著降低了25.71%，表明心臟組織中HPEF高、中劑量組能較好地降低ROS水平。腦組織ROS水平處理1～5均極顯著低于處理7(CK1)，分別降低了64.07%、58.84%、53.48%、35.26%、29.21%；處理1極顯著低于處理4，處理2極顯著低于處理5，處理3極顯著低于處理6，表明腦組織中HPEF預處理組效果明顯優(yōu)于未預處理組(P<0.01)。

如表3所示，8周后各組織中處理1～6的ROS水平均低于處理7(CK1)，表明普洱熟茶能降低大鼠肝、腎、心、腦組織中的ROS水平，且同一條件下的3個不同處理的ROS水平隨劑量的增加而降低。8周后，腎臟和腦組織的HPEF預處理組優(yōu)于同劑量的未預處理組。腎臟、心臟和腦組織中處理1和處理2 ROS水平均低于處理8(CK2)，表明在腎臟、心臟和腦組織中HPEF高、中劑量處理能達到茶褐素對ROS水平的抑制效果；未預處理組ROS水平均比處理8(CK2)高，表明未預處理普洱熟茶達不到茶褐素對ROS的抑制效果。

表3 大鼠肝、腎、心、腦組織中ROS水平(8周后)

肝臟組織ROS水平處理1、處理2極顯著低于處理7(CK1)，分別降低了24.51%、20.67%；處理3、處理4顯著低于處理7(CK1)，分別降低了16.90%、15.09%，表明在肝臟組織中HPEF預處理組和未預處理組的高劑量處理可以較好的降低ROS水平。腎臟組織ROS水平處理1～5均極顯著低于處理7(CK1)，分別降低了63.20%、60.41%、55.91%、44.14%、30.91%；處理2極顯著低于處理5，處理3極顯著低于處理6，表明腎臟組織中HPEF預處理組效果優(yōu)于未預處理組。心臟組織ROS水平處理1、處理2顯著低于處理7(CK1)，分別降低了37.91%、31.97%，表明心臟組織中HPEF預處理組高、中劑量處理可以較好的降低ROS水平(P<0.05)。腦組織ROS水平處理1～6均極顯著低于處理7(CK1)，分別降低了68.24%、64.17%、57.67%、45.97%、36.21%、20.58%；處理1極顯著低于處理4，處理2極顯著低于處理5，處理3極顯著低于處理6，表明腦組織中HPEF預處理組效果明顯優(yōu)于未預處理組(P<0.01)。

2.2 ROS水平隨時間變化差異

如圖1所示，各組織中處理7(CK1)的ROS水平隨著處理時間的增加而逐漸增加，處理1～處理6和處理8(CK2)隨著處理時間的增加則均有不同程度的降低。各組織中，只有腦組織中處理7(CK1)的ROS水平8周的顯著高于4周的，高5.49%，其余組織中4周和8周的ROS水平均無顯著差異，表明只有腦組織中處理7(CK1)ROS水平隨時間變化差異顯著(P<0.05)。

不同小寫字母表示同一處理4周和8周差異顯著(P < 0.05)，不同大寫字母表示同一處理4周和8周差異極顯著(P<0.01)，4周時差異性標注在上，8周時差異性標注在下

3 討 論

高壓脈沖電場是非熱處理領域研究的熱點之一，適當?shù)腍PEF條件可以顯著降低普洱茶中的細菌總數(shù)[21]、提高普洱茶茶水浸出物含量[22]、降低總灰分含量[23]、降低咖啡堿含量[24]、提高氨基酸含量[25]、提高香氣主要成分含量[26-27]，提高普洱熟茶的體外抗氧化活性[28]。ROS是生物系統(tǒng)中產生的化學活性分子，是基本代謝過程的自然產物，然而，過量ROS的存在可導致脂質過氧化、DNA損傷，甚至誘導細胞死亡[29]。組織中ROS水平已被用作疾病標志物，而控制ROS水平可能是ROS誘導損傷的一種有希望的治療策略[30]。王迪[31]研究了普洱茶水提取液對大鼠肝臟組織中ROS水平的影響，發(fā)現(xiàn)普洱茶水提取液可以降低肝臟組織中ROS水平，且呈劑量依賴降低型。陳曉揚等[32]探討了茶多酚對腦組織中ROS的影響，發(fā)現(xiàn)茶多酚可以降低腦組織中ROS的水平。

本試驗采用檢測大鼠體內ROS的方法評價不同HPEF條件處理的普洱熟茶的抗氧化功效，與王亞男等[33]檢測方法類似。大鼠肝、腎、心、腦組織內ROS水平檢測結果表明，HPEF預處理組和未預處理組的ROS水平均較空白組低，且劑量越高ROS水平越低，表明普洱熟茶具有降低SD大鼠體內ROS的作用，這可能與普洱茶中含有的多酚類化合物有關，多酚類化合物可清除體內過量自由基，避免生物大分子損傷，可捕獲氧化鏈式反應中產生的活性氧，減少鏈式反應的長度，插入或減慢緩慢過氧化地進行，這與王蕊等[34]的研究結果類似。HPEF預處理后的普洱熟茶降低ROS水平的功效均優(yōu)于未預處理的普洱熟茶，這可能是由于HPEF能夠引起細胞破損，使普洱熟茶中有效成分增加，這與梁榮[35]的研究結果類似。處理條件相同的茶樣組都以灌胃時間久的ROS水平更低，可能是因為普洱熟茶中的多酚類化合物經氧化發(fā)酵衍生為較大分子，該大分子具有一定活性的聚合物所致。4周后的肝臟、腎臟組織和8周后的腎臟組織中，HPEF預處理高劑量組和未預處理高劑量組無顯著差異，可能是因為HPEF預處理高劑量組達到了肝臟和腎臟的耐受力，其抗氧化能力達到了最高，當超過這個耐受力值有可能產生促氧化作用[36]，肝臟和腎臟組織的具體耐受力值有待進一步探究。8周后的肝臟組織HPEF預處理組和未預處理組無顯著差異，可能是隨著處理時間的增加，普洱熟茶中的多酚類物質減少[37]。4和8周后的心臟組織，僅有HPEF高、中劑量組明顯低于空白組，其余組別無顯著差異，且HPEF預處理組和未預處理組無顯著差異，這可能是對于心臟組織而言試驗組的劑量較低，后續(xù)可以增加心臟組織的劑量濃度，進一步探究不同劑量對SD大鼠心臟組織ROS水平的影響。

4 結 論

試驗中，HPEF預處理組、未預處理組與空白對照組相比ROS水平均下降，并在一定條件下差異性達到顯著或極顯著水平。因此，HPEF預處理組和未預處理組均能增強大鼠體內的抗氧化能力，且HPEF預處理后的普洱熟茶在降低ROS水平的功效優(yōu)于未預處理的普洱熟茶，劑量越高ROS水平越低。