等邊淺蛤線粒體全基因組測序和系統(tǒng)發(fā)育研究

夏立萍，徐 鳴，郭寶英，葉瑩瑩

(國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，浙江舟山 316022)

線粒體基因組(mitochondrial genome)是一種序列長度相對較短，基因信息豐富且易于分離的DNA 分子。具有母系遺傳、進(jìn)化速率快、包含大量同源基因等特點，且廣泛存在于真核生物細(xì)胞中，因而成為基因組測序的優(yōu)先目標(biāo)被廣泛應(yīng)用于系統(tǒng)發(fā)育研究中[1]。絕大多數(shù)動物線粒體基因組是共價閉合的雙鏈DNA分子，分子量較小，一般介于14～19 kb 之間，基于G+T%堿基含量來區(qū)分DNA 雙鏈重輕鏈。無脊椎動物線粒體基因組通常包括13 個蛋白質(zhì)編碼基因，22 個tRNA 基因和2 個rRNA 基因以及控制基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的控制區(qū)[2-3]。少數(shù)種類在基因組成上存在變化：如太平洋牡蠣Crassostrea gigas 線粒體基因組中存在3 個rRNA 基因(2 個12S rRNA 基因)；繡球海葵Metridium senile 的線粒體基因組中只有2 個tRNA 基因[4]；雙殼綱貝類一些物種線粒體基因組缺失了ATP8 基因，如文蛤Meretrix meretrix，短文蛤M.petechialis 等[5]。

等邊淺蛤Macridiscus multifarious(Kong,Matuskuma &Lutaenko,2012)隸屬于軟體動物門Mollusca，雙殼綱Bivalvia，簾蛤目Veneroida，簾蛤科Veneridae，淺蛤?qū)費acridiscus。等邊淺蛤分布于日本、朝鮮、越南、印度尼西亞和印度等地，在我國北起遼寧，南至海南均有分布，常棲息在潮間帶中潮區(qū)、低潮區(qū)至淺海的砂質(zhì)海底，尤以低潮區(qū)最為常見[6]。殼長在1～5 cm 之間，殼高在8 mm～4 cm 之間[7]。因其味道鮮美及豐富的營養(yǎng)而成為中國海岸線養(yǎng)殖中重要的雙殼類動物之一。目前淺蛤?qū)僦杏? 個物種，分別是等邊淺蛤、黑淺蛤M.melanaegis (R?mer,1860)、半布目淺蛤M.donacinus (Koch,1843)。淺蛤?qū)傥锓N的分類地位在歷史上經(jīng)歷了多次變革，包括學(xué)名也有較大的爭議。Macridiscus 最初在1902 年由DALL 提出，并將其歸為花蛤?qū)貵omphina 的亞屬，直至MIKKELSEN,et al[8]基于形態(tài)學(xué)與線粒體16S rRNA 基因、線粒體COI 基因、28S rRNA 核基因、以及H3 核基因4 種DNA 分子標(biāo)記進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育研究，首次將這一類群提升為淺蛤?qū)佟?012 年KONG Lingfeng,et al[9]基于形態(tài)學(xué)及線粒體Cytb 基因及核基因ITS 區(qū)2 種分子標(biāo)記發(fā)現(xiàn)了除黑淺蛤與半布目淺蛤之外的隱種等邊淺蛤。雖然等邊淺蛤是一種常見的物種，但相關(guān)的遺傳學(xué)研究較少，線粒體基因組研究尚屬空白。過往研究只有對該物種形態(tài)，群體組成，繁殖周期，生態(tài)習(xí)性以及染色體核型等方面的研究[10-14]，研究補全了等邊淺蛤線粒體全基因組和基于線粒體全基因組的系統(tǒng)發(fā)育樹，為等邊淺蛤的種別分析和保護研究提供了研究參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和DNA 提取

本研究于2014 年1 月在舟山市南沙沙灘(122.2°E，30.3°N)進(jìn)行等邊淺蛤樣品的采集，取等邊淺蛤閉殼肌組織保存于無水乙醇中，在-20 ℃冰箱保存。鹽析法提取DNA[15]，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質(zhì)量及完整性。

1.2 線粒體基因組測序

委托上海元莘生物有限公司使用二代測序方法[16]基于Illumina 高通量測序平臺，對等邊淺蛤DNA 樣品進(jìn)行高通量測序。樣品基因組DNA 檢測合格后，用超聲波將DNA 打斷，然后對打斷后DNA 進(jìn)行純化構(gòu)建測序文庫，步驟依次為：-DNA 末端修復(fù)，-3’端加A，連接測序頭，瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段，連接測序頭瓊脂糖凝膠電泳法回收目的片段，對目的片段進(jìn)行PCR 擴增，最終建成測序文庫。測序前對建好的文庫進(jìn)行質(zhì)檢，合格后采用Illumina HiSeqTM平臺測序。

1.3 序列拼接與分析

利用MITObim (https：//github.com/chrishah/MITObim)拼接軟件對測序讀段序列進(jìn)行多次迭代拼接，得到最優(yōu)的組裝結(jié)果?；赿enovo 拼接的線粒體基因組序列，利用MITOS 工具(http：//mitos2.bioinf.unileipzig.de/index.py)進(jìn)行基因組注釋。tRNA scan-SE 軟件(http：//lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE/)進(jìn)行定位tRNA。利用在線軟件CHLOROBOX (https：//chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html)繪制線粒體基因組環(huán)狀圖。使用軟件BioEdit 統(tǒng)計序列長度、堿基組成、GC 含量并計算AT 偏移度。

從GenBank 中下載簾蛤科15 個物種的線粒體基因組序列，縊蟶作為外群，選擇包括等邊淺蛤在內(nèi)的17 個物種的全部蛋白質(zhì)編碼基因[17-22]，使用MEGA7.0 將序列進(jìn)行多重比對，并利用鄰接法構(gòu)建neighborjoining (NJ)系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 線粒體基因組結(jié)構(gòu)與組成

等邊淺蛤線粒體基因組全長20 248 bp，GenBank 登錄號為MH932410，由13 個蛋白編碼基因，22 個tRNA 基因和2 個rRNA 基因組成，全部在重鏈編碼。13 個蛋白質(zhì)編碼基因包括：基因ATP8、NAD4、COX1、Cytb、ATP6、NAD3、NAD5、NAD6、COX3、NAD1、NAD2、NAD4L 和COX2。其中D-loop 控制區(qū)位于COX1 基因和Cytb 基因之間，長度為1 944 bp。在13 個蛋白質(zhì)編碼基因中，ATP8、COX1、NAD6 和NAD2的起始密碼子是ATT，NAD4、NAD5 和NAD1 起始密碼子是ATA，Cytb、ATP6、NAD3、COX3、NAD4L 和COX2 起始密碼子是ATG。對于終止密碼子，NAD3、NAD5、COX3 和NAD4L 為TAG，其余8 個蛋白質(zhì)編碼基因都是以TAA 終止(圖1、表1)。

表1 等邊淺蛤線粒體基因組結(jié)構(gòu)特點Tab.1 Characteristics of the mitogenomes of M.multifarius

圖1 等邊淺蛤線粒體基因組環(huán)狀圖Fig.1 The mitochondrial genome mapping of M.multifarius

2.2 核苷酸組成

由表2 可以看出，簾蛤科貝類基因組A+T(63.26%～70.48%)含量均高于G+C(26.91%～36.74%)含量，核苷酸具有明顯的AT 偏向性。等邊淺蛤線粒體全基因組堿基含量由高到低依次是T(39.33%)>A(28.55%)>G(21.72%)>C(10.4%)，A+T 含量居中為67.88%，A+T skew 堿基組成和G+C skew 堿基組成分別為-0.159 和0.352。

表2 簾蛤科物種線粒體基因組堿基組成Tab.2 Composition and skewness in the mitochondrial genomes of Veneridae species

2.3 蛋白質(zhì)編碼基因

等邊淺蛤線粒體基因組具有13 個蛋白質(zhì)編碼基因，其堿基組成見表3。13 條蛋白質(zhì)編碼基因的A+T含量均高于50%，可見其在蛋白編碼基因組中也具有AT 偏好性。

表3 等邊淺蛤蛋白編碼基因堿基組成Tab.3 Nucleotide composition of protein-coding genes in M.multifarius

2.4 等邊淺蛤線粒體基因組進(jìn)化分析

由于文蛤和短文蛤缺少ATP8 基因，我們將等邊淺蛤與其他16 種貝類的線粒體基因組的12 個(ATP8除外)進(jìn)行多重序列比對和分析，構(gòu)建NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹，以研究淺蛤?qū)俚姆诸惖匚患斑M(jìn)化關(guān)系。等邊淺蛤與其他15 種貝類均屬簾蛤科Veneridae，等邊淺蛤?qū)儆跍\蛤?qū)費acridiscus，菲律賓蛤仔Ruditapes philippinarum 屬于蛤仔屬Ruditapes；織錦巴非蛤Paphia textile、波紋巴非蛤P.undulate、真曲巴非蛤P.euglypta、和藹巴非蛤P.amabilis 屬于巴非蛤?qū)貾aratapes；文蛤Meretrix meretrix、短文蛤M.petechialis、斧文蛤M.lamarckii、麗文蛤M.lusoria、皺肋文蛤M.lyrata 屬于文蛤?qū)費eretrix；日本鏡蛤Dosinia japonica、射帶鏡蛤D.troscheli、高鏡蛤D.altior 屬于鏡蛤?qū)貲osinia；青蛤Cyclina sinensis 屬于青蛤?qū)貱yclina；紫石房蛤Saxidomus purpuratus 屬于石房蛤?qū)賁axidomus；縊蟶Sinonovacula constricta 則屬于竹蟶科Solenoidea，縊蟶屬Sinonovacula 作為外群。物種登錄號及序列長度等詳細(xì)信息見表2。

由圖2 可見，等邊淺蛤與菲律賓蛤仔聚為1 個小支，與巴非蛤?qū)俚? 個物種織錦巴非蛤、波紋巴非蛤、真曲巴非蛤和藹巴非蛤聚為1 個支，它們又與鏡蛤?qū)? 個物種日本鏡蛤、射帶鏡蛤、高鏡蛤聚為一大支；而文蛤?qū)? 個物種文蛤、短文蛤、斧文蛤、麗文蛤、皺肋文蛤與紫石房蛤、青蛤聚為另一大支；縊蟶在兩大分支外獨立作為一支。等邊淺蛤與菲律賓蛤仔親緣關(guān)系最近。

圖2 基于線粒體基因組12 個蛋白質(zhì)編碼基因構(gòu)建的NJ 系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 The neighbor-joining phylogenetic tree based on mitochondrial genome of 12 protein-coding genes

3 討論

3.1 等邊淺蛤線粒體基因組具有AT 偏好性

等邊淺蛤與其他15 種簾蛤科貝類的AT 含量均高于50%。其中等邊淺蛤A+T 含量為67.88%，12 種蛋白質(zhì)編碼基因的A+T 含量也全部高于50%，具有明顯的AT 偏好性。AT 偏移值和GC 偏移值分別為-0.159 和0.352。已有的簾蛤科貝類報道中，同樣發(fā)現(xiàn)具有較高的AT 含量[23]。且查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)不只是簾蛤科生物，在所有動植物，甚至細(xì)菌、真菌都具有AT 堿基偏好性特性[24-32]。這或許與生物的進(jìn)化有關(guān)，但關(guān)于AT 堿基偏好性的產(chǎn)生機制暫無明確的研究結(jié)果，還有待繼續(xù)研究。

3.2 簾蛤科系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示(圖2)，作為外群的縊蟶在進(jìn)化樹上單獨作為一支，其余部分主要由兩大分支構(gòu)成，巴非蛤?qū)? 個物種、等邊淺蛤、菲律賓蛤仔及鏡蛤?qū)? 個物種聚為一大支，青蛤、紫石房蛤及文蛤?qū)? 個物種聚為另一大支，BPs 值均接近100%。其中等邊淺蛤與菲律賓蛤仔分在同一細(xì)支，親緣關(guān)系最近，兩物種的CDS 區(qū)全部在重鏈編碼，這可能是等邊淺蛤與菲律賓蛤仔親緣關(guān)系更近的原因之一。在簾蛤科16 個物種中，文蛤及短文蛤缺少ATP8 基因，其余14 個物種包括等邊淺蛤具有全部的13 個編碼蛋白基因。該結(jié)果與程漢良等[33]利用線粒體16S rRNA 基因序列研究簾蛤科貝類分子系統(tǒng)發(fā)育以及韓冷[34]利用核糖體18S rDNA、ITS 以及28S rDNA 基因序列研究了5 種簾蛤科貝類的親緣關(guān)系均基本一致，結(jié)果均顯示蛤仔屬與鏡蛤?qū)儆H緣關(guān)系最近，其次是青蛤?qū)?，文蛤?qū)倥c石房蛤?qū)儆H緣關(guān)系最近聚為另外一支。但以上這2 個研究并未涉及到淺蛤?qū)俚臉悠贰１狙芯垦a充了等邊淺蛤線粒體基因組信息，為解決簾蛤科傳統(tǒng)分類的一些難點問題提供新的思路和理論依據(jù)，同時在簾蛤科貝類系統(tǒng)重建中具有重要意義。