正常雌雄大鼠椎間盤微細結(jié)構(gòu)差異的MRI研究

焦占營 李洋 方紀成 朱文珍 李麗 周治國

研究表明人群中49%至80%的成年人會受到腰背痛的困擾［1］。其中，椎間盤退行性病變（Degenerative Disc Disease，DDD）被認為是導(dǎo)致腰背痛的重要原因［2］。隨著對DDD 研究的深入，人們提出了多種新型治療方法，但在應(yīng)用于臨床之前，新的治療方法需要經(jīng)過動物模型的驗證。大鼠椎間盤退行模型具有廉價，易飼養(yǎng)等優(yōu)點，并且大鼠的椎間盤結(jié)構(gòu)和成分與人類相似程度很高，因而廣泛地應(yīng)用于DDD的研究之中［3］。使用大鼠DDD 動物模型進行研究時，應(yīng)該使用單一性別的大鼠還是混合使用雌雄性大鼠，沒有明確的答案及可遵循的依據(jù)。如何在體地、動態(tài)地顯示雌雄大鼠之間是否存在椎間盤差異，并進行持續(xù)性觀察，也是亟待解決的重要問題之一。

MRI作為一種無創(chuàng)的檢測方法，是檢測DDD的最好的在體方法。其中，T2 mapping 和T2*mapping技術(shù)能夠很好地反映椎間盤的微觀生化變化。T2 mapping 使用多回波自旋回波序列采集，能夠反映水和細胞外基質(zhì)的相互作用，在關(guān)節(jié)軟骨、椎間盤形態(tài)發(fā)生明顯變化之前就能夠檢測到水合作用的變化，對檢測早期軟骨疾病、椎間盤退變具有重要作用［4-5］。T2*mapping 使用的是多回波梯度回波序列，不僅能夠?qū)浌沁M行生物化學(xué)方面的評價，而且成像時間更短，可以提供高分辨率的三維圖像［5］。

本研究使用T2 mapping 和T2* mapping 技術(shù)對不同性別正常大鼠的椎間盤進行觀察和比較，從而探究正常雌雄大鼠的椎間盤是否存在差異，為大鼠作為DDD研究動物模型時的性別選擇提供依據(jù)，并探索這兩種技術(shù)應(yīng)用于DDD 的在體持續(xù)性觀察的可能性。

材料與方法

一、實驗動物

研究中使用了22只正常的Sprague-Dawley大鼠（重250～300克，10只雄性和12只雌性），年齡為3個月（骨性成熟），購自華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心（武漢，中國），均飼養(yǎng)在溫度為24 ℃，濕度為50%的環(huán)境中，光照時間為12 h的日光，另12 h為黑暗。本研究由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院倫理委員會批準（TJ-IRB20160923）。

二、掃描序列及參數(shù)

所有大鼠的尾椎（第6、7尾椎椎間盤C6/7、第7、8尾椎椎間盤C7/8）均采用3T MRI 掃描系統(tǒng)（GE Discovery MR 750，GE Healthcare，美國）進行掃描，線圈為3 cm 直徑的表面接收線圈（上海辰光，中國），分別進行T2加權(quán)矢狀位、T2 mapping和T2*mapping矢狀位掃描。參數(shù)如下：

（一）T2加權(quán)矢狀位

T2 加權(quán)矢狀位的設(shè)置如下：重復(fù)時間（TR）為2 000 ms，回波時間（TE）為36 ms 的快速自旋回波序列；矩陣256；視野（FOV）為8.0×1.0 cm；層厚為1 mm，層間距為1 mm。

（二）T2 mapping矢狀位

TR為1 500 ms，TE分別為7.8 ms、15.5 ms、23.3 ms、31.1 ms、38.8 ms、46.6 ms、54.3 ms、62.1 ms。矩陣256；FOV為8.0×1.0 cm；層厚為2 mm，層間距為2 mm。

（三）T2*mapping矢狀位

TR為150 ms，TE分別為2.7 ms、6.5 ms、10.3 ms、14.1 ms、18.0 ms、21.8 ms；矩陣256；FOV為8.0×1.0 cm；層厚為2 mm；層間距為2 mm。

三、圖像分析

大鼠尾椎的磁共振圖像數(shù)據(jù)由兩名放射科醫(yī)師（具有8年及10年脊柱MRI 成像分析和放射學(xué)診斷經(jīng)驗）分析。在T2 加權(quán)矢狀圖像上，使用Pfirrmann分級法（五級分級法）［6］對每個椎間盤（C6/7，C7/8）進行分級評價。

同時，在T2 加權(quán)矢狀位相上測量椎間盤高度（disc height index，DHI）。方法如下：測量兩個椎體相向面終板之間的側(cè)邊緣的1/4，1/2 和3/4 處的間距，取其平均值。

利用工作站（Advantage Workstation，版本4.6，GE Healthcare，美國）處理T2 mapping、T2*mapping數(shù)據(jù)。以T2 mapping 數(shù)據(jù)處理為例，將感興趣區(qū)域（region-of-interest，ROI）圓圈放置在椎間盤髓核中，測量T2 mapping 矢狀相中ROI 的T2 值。為了選擇髓核的正確解剖位置，與T2 加權(quán)矢狀相進行匹配，將橢圓形ROI 的中心均勻地放置在椎間盤髓核上。T2*mapping 的參數(shù)T2*值在T2*mapping 矢狀相中也以相同的方式測量。

四、病理組織學(xué)分析

將所有大鼠安樂死，并截取C6～C8椎體及其C6/7，C7/8椎間盤進行病理組織學(xué)檢查。解剖脊椎時，避免損傷椎間盤，固定在10%中性緩沖福爾馬林中，并使用Cal-Ex 脫鈣溶液HCL（Fisher Scientific，美國）脫鈣。然后將樣品在流動自來水下漂洗并轉(zhuǎn)移至75%乙醇。隨后，將它們包埋在石蠟中。將椎間盤中段進行連續(xù)矢狀位切割成5 μm厚度的切片，并進行蘇木伊紅（HE）染色和阿利新藍染色［7］。在顯微鏡下分析病理組織學(xué)圖像。

五、統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 25.0軟件（IBM公司，美國）對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料表示為均數(shù)±標準差（±s）。使用獨立樣本t檢驗對不同性別大鼠間Ⅰ級椎間盤的T2值、Ⅱ級椎間盤的T2值、Ⅰ級椎間盤的T2*值和Ⅱ級椎間盤的T2*值進行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

根據(jù)Pfirrmann分級法將大鼠椎間盤進行分級，雌性大鼠24個椎間盤中14個（58%）屬于Ⅰ級，10個（42%）屬于Ⅱ級。雄性大鼠20 個椎間盤中14 個（70%）屬于Ⅰ級，6個（30%）屬于Ⅱ級。

HE 染色結(jié)果表明，相較于雌性大鼠，雄性大鼠的椎間盤更加的細長，而雌性大鼠較為粗短。雌性大鼠椎間盤中的纖維含量比雄性大鼠要多（圖1 a、c）。阿利新藍染色結(jié)果表明，雌性大鼠的纖維較雄性大鼠粗大，均勻，髓核細胞分布稍顯聚集（圖1 b、d）。

圖1 正常雌雄大鼠椎間盤的HE 染色和阿利新藍染色結(jié)果 a：雌性大鼠的HE染色結(jié)果；b：雌性大鼠的阿利新藍染色結(jié)果；c：雄性大鼠的HE染色結(jié)果；d：雄性大鼠的阿利新藍染色結(jié)果

通過MRI掃描和后期處理獲得雌雄大鼠尾椎的T2WI矢狀位圖像（圖2 a、b）、T2 mapping矢狀位偽彩圖（圖2 c、d）和T2*mapping矢狀位偽彩圖（圖2 e、f），為了測量椎間盤髓核的T2 值和T2*值，選擇正中矢狀位，將橢圓形ROI的中心放置在椎間盤髓核上，并盡量包全椎間盤。

圖2 正常雌雄大鼠椎間盤的MRI圖像和髓核ROI的測量 a、b：雌性大鼠和雄性大鼠椎間盤的T2加權(quán)矢狀位圖像；c、d：雌性大鼠和雄性大鼠椎間盤的T2 mapping矢狀位的偽彩圖；e、f：雌性大鼠和雄性大鼠椎間盤的T2* mapping矢狀位的偽彩圖（ROI選取椎間盤中心層面的完整結(jié)構(gòu)）

從T2 mapping 偽彩圖上測量大鼠椎間盤的T2值，在Ⅰ級和Ⅱ級椎間盤中，雌性大鼠的T2 值均明顯小于雄性大鼠（P均＜0.05，表1）。從T2*mapping偽彩圖上測量大鼠椎間盤的T2*值，T2*值結(jié)果和T2值結(jié)果相似，在Ⅰ級和Ⅱ級椎間盤中，雌性大鼠的T2*值均明顯小于雄性大鼠（P均＜0.05，表1）。

討 論

和其它器官相比，椎間盤更容易發(fā)生退變［8］。即使在正常的大鼠中，也存在著較大比例的Ⅱ級椎間盤。在雌性大鼠的椎間盤中，有42%屬于Ⅱ級。而在雄性大鼠中，Ⅱ級椎間盤占了30%。而且，不同級別的椎間盤在MRI 檢測中也具有不同的表現(xiàn)，和Ⅰ級椎間盤相比，Ⅱ級椎間盤T2加權(quán)圖像中結(jié)構(gòu)不均一，同時可能具有水平帶［6］，并且Ⅱ級椎間盤具有更低的表觀彌散系數(shù)（Apparent Diffusion Coefficient，ADC）值、更高的部分各向異性值和平均峰度系數(shù)（Mean Kurtosis，MK）值［9］。本研究中還發(fā)現(xiàn)，在雌雄大鼠中，Ⅱ級椎間盤的T2值明顯小于Ⅰ級椎間盤。所以在進行大鼠的DDD動物實驗時，應(yīng)當(dāng)先對所有實驗大鼠進行MRI 掃描，剔除已經(jīng)出現(xiàn)Ⅱ級椎間盤的大鼠。

Marinelli 等［10］曾經(jīng)對人類尸體的椎間盤進行MRI檢查，探究了T2信號強度和椎間盤中水含量的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)T2信號強度可以反映出椎間盤中水含量的變化，T2 值隨著椎間盤中水含量的增加而升高。T2*值能較好地反映出椎間盤中膠原蛋白的完整性，椎間盤的完整性受到破壞時T2*值便會降低［11］。龔靜山等［11］和Welsch 等［12］將T2 mapping 和T2*mapping 用于研究腰痛病人的椎間盤退變情況，證明了在不同Pfirrmann分級的椎間盤中T2值和T2*值存在明顯的差異，T2 值和T2*值可以很好地反映出椎間盤的退變程度。在Ⅰ級和Ⅱ級椎間盤中，雌性大鼠的T2 值都明顯小于雄性大鼠（表1），表明雌性大鼠椎間盤中的水含量低于雄性大鼠。在Ⅰ級和Ⅱ級椎間盤中，雌性大鼠的T2*值低于雄性大鼠，說明雌性大鼠椎間盤中膠原蛋白的完整性低于雄性大鼠（表1）。而在之前的研究中我們也發(fā)現(xiàn)，在大鼠的Ⅰ級椎間盤中，雌性大鼠的MK值、軸向峰度系數(shù)值和徑向峰度系數(shù)值都明顯小于雄性大鼠，并且雌性大鼠具有更高的ADC值［9］。這些結(jié)果表明不同性別正常大鼠的椎間盤具有明顯不同的MRI表現(xiàn)。

表1 不同Pfirrmann分級的雌雄性大鼠的T2值和T2*值（±s，ms）

表1 不同Pfirrmann分級的雌雄性大鼠的T2值和T2*值（±s，ms）

Pfirrmann分級雌性大鼠雄性大鼠t值P值Ⅰ級T2值35.24±6.22 43.56±5.33 3.800＜0.001 T2*值15.57±2.55 23.58±5.02 5.329＜0.001Ⅱ級T2值30.32±4.72 37.19±3.41 3.095 0.008 T2*值15.23±2.02 22.94±2.83 6.377＜0.001

組織學(xué)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)雄性大鼠的椎間盤更長并且更窄，而雌性大鼠較為粗短（圖1 a、c）。雌性大鼠椎間盤比雄性大鼠的椎間盤含有更多的纖維。并且雌性大鼠椎間盤的膠原蛋白分布較雄性椎間盤而言是不均勻的，髓核細胞是成團的，而雄性椎間盤的基質(zhì)及髓核細胞是散在分布的（圖1 b、d）。椎間盤中纖維含量的增加往往伴隨著水含量和膠原完整性的降低，進而減低T2值和T2*值［11］，而雌性大鼠椎間盤中膠原蛋白分布不均勻和髓核細胞成團也會使得T2值及T2*值降低，這與MRI檢測結(jié)果中雌性大鼠椎間盤的T2值和T2*值明顯小于雄性大鼠相一致。和雌性大鼠相比，雄性大鼠椎間盤的高度明顯更大［9］。這些結(jié)果表明，雌雄大鼠的椎間盤在形態(tài)和成分上存在明顯差異。

本研究的不足之處主要是樣本數(shù)量較少。人類椎間盤隨著蛻變程度的升高，T2*值會明顯降低［13］，而本研究中，和Ⅰ級椎間盤相比，大鼠的Ⅱ級椎間盤的T2*值只有降低的趨勢，但兩者之間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，可能就是由于樣本數(shù)量較少導(dǎo)致的。

綜上，正常成年大鼠的椎間盤中也會發(fā)生退變，實驗之前應(yīng)將這部分大鼠檢測出來并排除掉，或者將這一重要因素考慮進去。再者，不同性別正常大鼠的椎間盤的T2 值和T2*值存在顯著差異，組織染色結(jié)果也表明雌雄大鼠的椎間盤在形態(tài)和成分上存在不同，兩者證實不同性別的正常成年大鼠的椎間盤具有明顯的微細結(jié)構(gòu)的差異，在大鼠椎間盤退變模型相關(guān)的研究中應(yīng)盡量選擇相同性別的大鼠。此外，T2 mapping 及T2*mapping 是兩種靈敏、快速檢測DDD的方法，可以用于檢測大鼠椎間盤微細結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化，從而對大鼠椎間盤退變模型相關(guān)的研究提供持續(xù)的在體信息。