茉莉花JsMYB108和JsMYB305基因的克隆及其對TPS基因的激活作用

張?jiān)? 袁媛 何弦 王宇婷 呂美玲 伍炳華 陳清西

摘? 要：基于茉莉花葉轉(zhuǎn)錄組（GenBank登錄號為GHOY00000000）篩選了2個(gè)在花瓣中及夜間優(yōu)勢表達(dá)，且與其他物種中香氣調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子同源度高的MYB基因進(jìn)行克隆并分析了它們在花朵開放中的表達(dá)模式。2個(gè)MYB基因編碼序列長度分別為864 bp和588 bp，編碼287 aa和195 aa個(gè)氨基酸殘基。分別與擬南芥AtMYB108及AtMYB24親緣關(guān)系相近，與油橄欖（Olea europaea var. sylvestris）MYB108-like protein和MYB305-like protein相似度最高，分別命名為JsMYB108和JsMYB305。JsMYB108和JsMYB305在夜間表達(dá)量顯著高于白天，與4個(gè)茉莉花萜類合成酶基因JsTPS表達(dá)特征一致。為探究JsMYB108和JsMYB305是否參與萜類香氣調(diào)控，將其構(gòu)建至植物表達(dá)載體pK7FWG2.0（35 S啟動子，GFP報(bào)告基因）中，利用茉莉花莖段愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系檢測其對愈傷組織中4個(gè)JsTPS基因表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)化了JsMYB108和JsMYB305的愈傷組織內(nèi)能檢測到GFP熒光和2個(gè)MYB基因轉(zhuǎn)錄本;JsMYB108可顯著提高JsTPS2表達(dá)水平，JsMYB305可顯著提高4個(gè)JsTPS基因的表達(dá)，暗示JsMYB108和JsMYB305可能不同程度地參與了萜類合成的調(diào)控。該研究結(jié)果為今后茉莉花香氣調(diào)控的深入研究提供參考。

關(guān)鍵詞：茉莉花;MYB轉(zhuǎn)錄因子;TPS基因;愈傷組織;遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號：S685.16????? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Cloning of JsMYB108 and JsMYB305 and Analysis of Their Activation on TPS Gene in Jasminum sambac

ZHANG Yue， YUAN Yuan*， HE Xian， WANG Yuting， LYU Meiling， WU Binghua， CHEN Qingxi

College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract： Two MYB genes which were of high homology with fragrance regulating transcription factors in other species and predominant expressed in flower at night and were screened and cloned from the jasmine flower & leaf transcriptomes （Genebank GHOY00000000）， and the expression pattern during flower opening were detected. Results showed that the coding sequence was 864 bp and 588 bp in length， respectively， and encoded 287 and 195 amino acid residues respectively. They were of homology to Arabidopsis thaliana AtMYB108 and AtMYB24， and had the highest similarity to MYB108-like protein and MYB305-like protein in Olea Europaea var. sylvestris， and was named JsMYB108 and JsMYB305， respectively. The expression level of JsMYB108 and JsMYB305 was significantly higher at night than at day， which was consistent with the four JsTPSs expression characteristics. To investigate whether JsMYB108 and JsMYB305 were involved in the regulation of terpene synthesis， they were constructed into the plant expression vector pK7FWG2.0 （35 S promoter with GFP reporter） and transformed to jasmine callus to detect the effect on the expressions of four JsTPS genes. The results showed that GFP fluorescence and transcripts of JsMYB108 and JsMYB305 could be detected in the transformed callus. Furthermore， JsMYB108 could significantly enhance the expression of JsTPS2， while JsMYB305 could significantly increase the expression level of four JsTPS genes， suggesting that JsMYB108 and JsMYB305 might be involved in the regulation of terpene synthesis. The results of the study would lay a foundation for further studies on the regulation of jasmine fragrance.

Keywords： Jasminum sambac; MYB transcript factor; TPS gene; callus; genetic transformation

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.06.005

茉莉花[Jasminum sambac （L.） Aiton]為木犀科（Oleaceae）素馨屬（Jasminum）常綠灌木，廣泛應(yīng)用于茉莉花茶窨制、香料香精、化妝品、藥品、食品和園林應(yīng)用等方面，是著名的芳香植物和香料作物[1]。我國茉莉鮮花基本上用于花茶生產(chǎn)，優(yōu)質(zhì)茉莉花茶每千克原料需配1.28 kg茉莉花[2]，且不同級別的茉莉花茶對其香氣要求特別嚴(yán)格[3]。對于茉莉花茶窨茶工藝的探索以及花茶品質(zhì)的研究均表明茉莉花的香氣在花茶的經(jīng)濟(jì)和文化中起著重要作用[4-6]。

茉莉花揮發(fā)性香氣主要為單萜、倍半萜、苯環(huán)類/苯丙烷類，以及其他微量物質(zhì)如揮發(fā)性脂肪衍生物，其中芳樟醇、α-法呢烯和乙酸芐酯在J. sambac及3個(gè)近緣種茉莉的揮發(fā)性香氣中占了80%以上[7]。作為一種夜花植物（nocturnal flowering plant），茉莉香氣在子夜前達(dá)到高峰[7]，對萜類合成途徑以及乙酸芐酯合成途徑一些酶在花瓣中的活性測定及其中一些酶編碼基因的表達(dá)分析也證實(shí)了這一點(diǎn)[8]，因此茉莉香氣釋放過程是受到嚴(yán)格調(diào)控的，但相應(yīng)的調(diào)控因子類別及其調(diào)控機(jī)理尚不清楚。

對于揮發(fā)性物質(zhì)萜類、苯環(huán)類/苯丙類和脂肪酸類等有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控機(jī)理還十分有限[9]。目前，相較另外2類揮發(fā)性物質(zhì)，苯環(huán)類/苯丙類調(diào)控的MYB調(diào)控研究較為深入，如矮牽牛（Petunia hybrida）PhODO1、PhEOBI、PhEOBII、PhMYB4等[10-14]、草莓（Fragaria × ananassa）FaEOBII[15]、百合（Lilium spp.）LhODO1[16]、擬南芥AtMYB3、AtMYBL2和AtMYB6[17]等。相比之下，萜類合成途徑中報(bào)道的轉(zhuǎn)錄因子很少，目前僅在姜花（Hedychium coronarium）[18]、紫丁香（Syringa oblata）[19]和金龍膽（Conyza blini H. lev）[20]中有初步探索，分子層面的系統(tǒng)研究尚未開展。

關(guān)于香氣調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的研究在茉莉中尚無報(bào)道。我們曾對雙瓣茉莉開放48 h過程中香氣釋放和花、葉轉(zhuǎn)錄組（GeneBank登錄號為GHOY00000000）進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析[21]，初步篩選出在花朵中優(yōu)勢表達(dá)，在時(shí)間上與香氣釋放高峰階段同期上調(diào)，且與矮牽牛[10-11]和草莓[15]中調(diào)控香氣的轉(zhuǎn)錄因子同源性高的2個(gè)MYB序列（編號C58515、C50112），推測其參與香氣的調(diào)控。此外，我們從轉(zhuǎn)錄組中挖掘了4個(gè)萜稀合成酶（terpene synthase，TPS），與草莓芳樟醇合成酶FaNES1[22]、云杉（Picea abies）芳樟醇合成酶[23]、油橄欖（Olea europaea）倍半萜合成酶（AF I47927.1）同源性高，且在花朵和夜間優(yōu)勢表達(dá)，編號為c60643_g1、c58633_g1、c60545_g4、c58382_g2，分別命名為JsTPS1、JsTPS2、JsTPS3、JsTPS4。為探究這2個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子是否參與了萜類香氣物質(zhì)的調(diào)控，本研究將它們的編碼序列進(jìn)行克隆并構(gòu)建入植物表達(dá)載體，并利用茉莉莖段遺傳轉(zhuǎn)化體系檢測其對茉莉愈傷中4個(gè)JsTPS基因表達(dá)的調(diào)控。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 植物材料? 以雙瓣茉莉盆栽3年生植株為供試材料。擴(kuò)增MYB基因編碼序列時(shí)，于花蕾開放次日凌晨1點(diǎn)采集花朵的花瓣，檢測基因在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平時(shí)，采集花蕾開放當(dāng)夜21：00、次日凌晨01：00、次日白天中午11：00和下午15：00花朵，用錫箔紙包好后立即置于液氮中，保存于–80 ℃超低溫冰箱用于提RNA。用于誘導(dǎo)茉莉愈傷組織時(shí)，采集幼嫩枝條中上部不帶腋芽的莖段用于后期消毒和組織培養(yǎng)。

使用長至4～6片葉片的本氏煙草（Nicotiana benthamiana）進(jìn)行表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化后的GFP檢測。本氏煙草種植于人工氣候室，光周期為16 h/8 h（晝/夜），溫度為26 ℃/22 ℃（晝/夜）。

1.1.2? 載體和菌株? Gateway系統(tǒng)載體pK7FWG2.0（35 S啟動子，GFP報(bào)告基因）以及農(nóng)桿菌（Agrobacterium tunmefaciens）GV3101株系為福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。感受態(tài)大腸桿菌（E. coli）DH5α購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2? 方法

1.2.1? 茉莉花2個(gè)MYB基因的克隆? 茉莉花瓣總RNA提取按照TransZol Up Plus RNA Kit 試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）說明書進(jìn)行。第一鏈cDNA按照EasyScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組中c58515和c50112序列（已包含完整的編碼序列），設(shè)計(jì)擴(kuò)增MYB基因特異性引物（表1），以cDNA為模板，擴(kuò)增編碼序列，PCR的擴(kuò)增體系：1 μL上游引物，1 μL下游引物，12.5 μL Fastpfu mix（北京全式金生物技術(shù)有限公司），1 μL cDNA，9.5 μL H2O。PCR程序：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后取2 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，大小無誤后回收PCR產(chǎn)物，與TOPO入門載體（pENTR/SD/D-TOPO，Invitrogen）相連，連接體系和條件見說明書。連接完成后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取白斑搖菌后送測序（鉑尚生物技術(shù)有限公司）。

1.2.2? MYB序列的分析? 將測序之后得到的核酸序列用生物軟件網(wǎng)的SMS在線工具（http：// www.bio-soft.net/sms/index.html）中的DNA Figures進(jìn)行序列翻譯，Protein Figures進(jìn)行多重序列比對;運(yùn)用NCBI中的BLASTP進(jìn)行MYB間的同源性比對;使用NCBI中的Conserved Domain Search Service（CD Search）進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析;用MEGAX軟件分析茉莉花P450基因與擬南芥R2R3MYB基因的進(jìn)化關(guān)系，使用Maximum Likelihood方法構(gòu)建進(jìn)化樹;使用Protparam在線軟件對MYB蛋白分子量進(jìn)行預(yù)測。

1.2.3? 植物表達(dá)載體的構(gòu)建? 利用Gateway技術(shù)，將測序無誤的TOPO-JsMYBs質(zhì)粒（AxyPrepTM PCR Clean up Kit提取質(zhì)粒）與pK7FWG2.0植物表達(dá)載體進(jìn)行LR反應(yīng)，體系包含150 ng TOPO- JsMYB載體，150 ng pK7FWG2.0，加H2O至8 μL，再加入2 μL LR ClonaseTM II Enzyme mix，輕微渦旋后在25 ℃下反應(yīng)1 h，加入Proteinase K solution終止反應(yīng)。將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取白斑搖菌后送測序。將測序正確的pK7FWG2.0-JsMYBs（共2個(gè)）分別通過凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101株系，PCR檢測無誤后備用。

1.2.4? 煙草瞬時(shí)表達(dá)? 為驗(yàn)證pK7FWG2.0- JsMYBs載體是否構(gòu)建成功，我們進(jìn)行了煙草瞬時(shí)表達(dá)的檢測。將驗(yàn)證轉(zhuǎn)化成功的陽性克隆菌液取1 mL放入10 mL LB液體培養(yǎng)基，含50 mg/L慶大霉素（Gen）、50 mg/L 利福平（Rif）、50 mg/L 壯大霉素（Spec），于28 ℃、200 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)過夜，再取出適量菌液接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基中（菌液OD600初始值在0.2左右）繼續(xù)于28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)若干小時(shí)至OD600值為0.8～1.0。將菌液5000 r/min離心10 min收集菌體，加入重懸液（1/2MS+200 ?mol/L乙酰丁香酮AS+10 mmol/L MES），暗培養(yǎng)3 h之后，輕輕搖勻菌液，用10 mL無菌注射器吸取菌液，去掉針頭，用注射口貼住葉背面，輕柔地注入菌液，直到肉眼觀察到菌液完全浸染整個(gè)煙草葉片，吸干凈葉片表面沾染的菌液，將侵染的葉片做好標(biāo)記，暗培養(yǎng)24～30 h，用激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP8）觀察判斷GFP是否表達(dá)，觀察GFP時(shí)Ex=488 nm，Em=507 nm，觀察葉綠素Ex=488 nm，Em=681 nm。

1.2.5? 茉莉莖段愈傷組織的獲得及轉(zhuǎn)化? 從生長健壯的茉莉植株上剪取當(dāng)年生無病蟲害的幼嫩枝條，將幼嫩枝條依次使用洗衣粉水、多菌靈、鏈霉素、巴氏消毒液進(jìn)行處理，用無菌水沖洗多次備用[25]。將消毒后幼嫩枝條切成長0.5 cm左右的莖段，接種至預(yù)培養(yǎng)基W1（表2）中培養(yǎng)30 d用于浸染。共培養(yǎng)：挑取轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌單菌落，接種于10 mL含50 mg/L Rif、50 mg/L Gen和50 mg/L Spec的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，再將過夜培養(yǎng)的菌液3 mL接種于50 mL含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3～4 h，至菌液濃度OD600=0.6左右。將菌液在5000 r/min室溫離心8 min收集菌體，用W2重懸液重懸OD600=0.6左右可用于浸染。將30 d的外植體放入侵染液中侵染30 min，期間不斷輕柔晃動，取出后置于濾紙上吸干水分，然后置于共培養(yǎng)基W3上，25 ℃遮光培養(yǎng)2 d。各培養(yǎng)基配方見表2。

1.2.6? 抗性茉莉莖段愈傷組織的篩選? 將共培養(yǎng)后的莖段使用含頭孢Cef（300 mg/L）的無菌水輕晃清洗3次，每次10 min，再無菌水沖洗4～5遍，濾紙上吸干表面水分，置于含80 mg/L Kan的篩選培養(yǎng)基W4上培養(yǎng)。

1.2.7? 茉莉愈傷組織中GFP熒光檢測? 為驗(yàn)證pK7FWG2.0-JsMYBs是否成功轉(zhuǎn)入茉莉莖段并表達(dá)，檢測了愈傷組織中的GFP熒光。將經(jīng)Kan抗性篩選14 d后生長良好的抗性茉莉愈傷組織，使用Leica體式熒光顯微鏡（Leica M205 FA）觀察愈傷組織中報(bào)告基因GFP的表達(dá)情況。

1.2.8? 熒光定量PCR分析? 為分析2個(gè)JsMYB和4個(gè)JsTPS基因在開花不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平，提取相應(yīng)花瓣RNA進(jìn)行檢測;為分析轉(zhuǎn)化后愈傷組織中2個(gè)JsMYB和JsTPS基因表達(dá)水平時(shí)，提取抗性愈傷組織RNA。RNA提取同1.2.1，第一鏈cDNA合成使用試劑盒同1.2.1，體系為42 ℃15 min，85 ℃ 5 s。使用TransStart? Top Green qPCR SuperMix試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行熒光定量PCR分析，體系為：cDNA模板1.6 μL，上下游引物0.4 μL，Super mix 10 μL，ddH2O 7.6 μL;程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)，引物見表1。每個(gè)樣品做3次生物學(xué)重復(fù)?；虮磉_(dá)量為相對JsActin2基因[24]的表量，以2–ΔΔCT [25-26]法進(jìn)行計(jì)算。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2007軟件對熒光定量結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。使用GraphPad Prism 7軟件繪圖，差異顯著性分析使用IBM SPSS Statistics軟件中的two-way ANOVA分析和t檢測。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 茉莉花2個(gè)MYB基因的克隆及序列分析

轉(zhuǎn)錄組中C58515和C50112序列已包含完整的編碼序列，根據(jù)編碼序列設(shè)計(jì)特異性引物，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別獲得864、588 bp的片段（圖1），分別編碼287、195個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測分子量分別為32.68、22.42 kDa。

通過與擬南芥R2R3MYB成員進(jìn)行進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)C58515與擬南芥AtMYB112和AtMYB108親緣關(guān)系較近，C50112與擬南芥AtMYB21和AtMYB305親緣關(guān)系較近（圖2），通過NCBI比對，發(fā)現(xiàn)C58515和C50112分別與油橄欖（Olea europaea var. sylvestris）中的MYB108-like protein和MYB305-like protein同源性最高，相似度分別為78.36%和88.21%（表3）?；谝陨辖Y(jié)果，將這2個(gè)基因命名為JsMYB108和JsMYB305。

通過多序列比對的結(jié)構(gòu)域分析（圖3），發(fā)現(xiàn)JsMYB108和JsMYB305氨基酸序列存在明顯的R2和R3基序，屬于R2R3-MYB類蛋白。在這2個(gè)結(jié)構(gòu)域中均含有保守色氨酸殘基W。

2.2? 茉莉花JsMYB108和JsMYB305在花朵開放過程中的表達(dá)特征

在獲得JsMYB108和JsMYB305序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，測定了這2個(gè)基因在晝夜不同時(shí)間點(diǎn)（夜間21：00、次日凌晨01：00、次日白天中午11：00和下午15：00）的表達(dá)水平，花朵狀態(tài)見圖4。結(jié)果顯示，JsMYB108在夜間21：00和次日凌晨01：00的相對表達(dá)量分別為17.6和13.2，而在白天中午11：00及下午15：00表達(dá)量僅1.02和1.01;相似的，JsMYB305在夜間21：00和次日凌晨01：00的表達(dá)量分別為22.5和8.6，而在白天中午11：00及下午15：00相對表達(dá)量僅1.2和2.7，即JsMYB108和JsMYB305在夜間2個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量高，在白天2個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量低，夜間顯著高于白天。

JsMYB108 和JsMYB305在開放過程中晝夜不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)特征與茉莉花4個(gè)萜類合成酶基因JsTPS相同，JsTPS1、JsTPS2、JsTPS3、 JsTPS4均表現(xiàn)為夜間的時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量高，白天的時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量低，晝夜表達(dá)量差異可達(dá)100倍（圖4）。

2.3? 表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增目的片段，將PCR產(chǎn)物分別與TOPO入門載體連接、轉(zhuǎn)化、涂板后進(jìn)行菌液PCR檢測，使用載體上的獲得陽性克?。▓D5A），測序無誤后，將TOPO-JsMYB108和TOPO-JsMYB305與pK7FWG2.0植物表達(dá)載體進(jìn)行LR反應(yīng)，連接、轉(zhuǎn)化、涂板后進(jìn)行菌液PCR檢測，獲得片段長度與預(yù)期一致（圖5B），經(jīng)測序驗(yàn)證后正確，提取重組質(zhì)粒，獲得植物表達(dá)載體pK7FWG2.0-JsMYB108和pK7FWG2.0-JsMYB305。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101株系，并進(jìn)行PCR檢測，片段大小無誤（圖5C），表明重組質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。

2.4? 煙草葉片GFP熒光檢測

為檢測pK7FWG2.0-JsMYB108和pK7FWG 2.0-JsMYB305是否構(gòu)建成功，將帶有pK7FWG 2.0-JsMYB108和pK7FWG2.0-JsMYB305表達(dá)載體的農(nóng)桿菌注射到本氏煙草葉片中，暗培養(yǎng)24～30 h后，用激光共聚焦顯微鏡觀察煙草葉片，均可在細(xì)胞中檢測到綠色熒光，位置為細(xì)胞核（圖6），表示pK7FWG2.0-JsMYB108和pK7FWG2.0- JsMYB 305載體構(gòu)建成功，JsMYB108-GFP、JsMYB305-GFP融合蛋白成功表達(dá)。

2.5? 茉莉花莖段愈傷組織誘導(dǎo)與抗性篩選

茉莉莖段在預(yù)培養(yǎng)期間切口處不斷生長和膨大（圖7A～圖7C），當(dāng)茉莉莖段預(yù)培養(yǎng)7 d后，莖段兩端膨大形成白色愈傷組織（圖7B），預(yù)培養(yǎng)30 d后，莖段切口處愈傷組織已形成較多白綠色小塊愈傷組織（圖7C）。將預(yù)培養(yǎng)30 d的茉莉愈傷莖段分別侵染pK7FWG2.0-JsMYB108和pK7FWG 2.0-JsMYB305載體，然后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基，結(jié)果顯示愈傷組織生長狀態(tài)較好，抗性愈傷生成率較高（圖7D）。

2.6? 茉莉抗性愈傷組織中GFP熒光檢測

將轉(zhuǎn)化了JsMYB108和JsMYB305的茉莉莖段愈傷篩選培養(yǎng)14 d后進(jìn)行熒光體式顯微鏡檢測，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化了JsMYB108和JsMYB305的愈傷組織中均檢測到強(qiáng)烈的綠色熒光，而未轉(zhuǎn)化的茉莉愈傷組織中未檢測到熒光（圖8），說明JsMYB108-GFP、JsMYB305-GFP融合蛋白在愈傷組織中成功表達(dá)。

2.7? 轉(zhuǎn)化后愈傷組織中JsMYB基因及4個(gè)JsTPS基因表達(dá)水平檢測

當(dāng)JsMYB108和JsMYB305構(gòu)建到35S啟動子之下并轉(zhuǎn)化茉莉莖段愈傷組織后，轉(zhuǎn)化后愈傷組織中JsMYB108和JsMYB305的轉(zhuǎn)錄本為未轉(zhuǎn)化的愈傷組織中表達(dá)量的2.12倍和2.28倍（圖9A～圖9B），有顯著提高，說明JsMYB108和JsMYB305基因在愈傷組織中已表達(dá)。

JsMYB108轉(zhuǎn)化后的茉莉莖段愈傷組織中JsTPS2表達(dá)量顯著提高。pK7FWG2.0-JsMYB108使JsTPS2表達(dá)量顯著提高，為未轉(zhuǎn)化愈傷組織的5.07倍，對另4個(gè)JsTPS基因的表達(dá)水平無顯著影響（圖9C）。JsMYB305轉(zhuǎn)化后的愈傷組織中4個(gè)JsTPS基因的表達(dá)量均顯著提高，其中提高量最大的是JsTPS2，為未轉(zhuǎn)化愈傷組織的5.46倍，其次為JsTPS3和JsTPS4，分別為未轉(zhuǎn)化愈傷組織的3.53倍和2.06倍（圖9D），JsTPS4表達(dá)量為未轉(zhuǎn)化的1.85倍。以上結(jié)果說明JsMYB108和JsMYB305不同程度地激活了4個(gè)JsTPS基因的表達(dá)。

3? 討論

3.1? 茉莉花愈傷組織轉(zhuǎn)化體系可用于轉(zhuǎn)錄激活檢測

茉莉花在自然條件下結(jié)實(shí)率非常低[27]，種子在自然條件下難以萌發(fā)，實(shí)生苗很難獲得[28]。因此通過傳統(tǒng)的雜交育種手段改良茉莉香型存在巨大困難。利用基因工程技術(shù)對香型進(jìn)行改造已在月季[29]、草莓[15]、蘋果[30]、矮牽牛[31]等多個(gè)物種中得以實(shí)現(xiàn)，為茉莉的香型改造提供了可能。孫艷妮等[32]、何麗斯[33]和李聰聰[34]、嚴(yán)華兵等[35]對雙瓣茉莉的離體快繁體系進(jìn)行了探索和優(yōu)化，甘煌燦等人對雙瓣茉莉愈傷組織培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化進(jìn)行了一系列研究[28， 36-37]，為實(shí)驗(yàn)的開展提供了重要參考。本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)中使用了不同的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間，發(fā)現(xiàn)采用預(yù)培養(yǎng)1個(gè)月長出小塊愈傷組織的茉莉莖段為轉(zhuǎn)化材料進(jìn)行轉(zhuǎn)化，前期生長周期短，轉(zhuǎn)化后愈傷組織生長穩(wěn)定，且方便進(jìn)行GFP檢測，與甘煌燦等[36]發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)30 d的茉莉莖段愈傷生長迅速且穩(wěn)定的結(jié)論相一致。

甘煌燦等[28]將刺葡萄DFR基因成功轉(zhuǎn)化茉莉愈傷組織，表明外源基因可成功通過愈傷組織轉(zhuǎn)化體系進(jìn)入茉莉的基因組中。本研究將茉莉JsMYB108和JsMYB305基因轉(zhuǎn)化茉莉莖段愈傷組織，通過煙草GFP熒光檢測、愈傷組織GFP熒光檢測以及JsMYB108和JsMYB305轉(zhuǎn)錄本分析，表明2個(gè)MYB基因在自身愈傷組織中成功地進(jìn)行了過表達(dá)。JsMYB108和JsMYB305基因過表達(dá)后愈傷組織中4個(gè)JsTPS的表達(dá)量得到了不同程度的提高，表明利用愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄激活實(shí)驗(yàn)是可行的。我們進(jìn)一步將JsMYB108和JsMYB305構(gòu)建到誘導(dǎo)型載體pMDC7[38-39]轉(zhuǎn)化茉莉莖段愈傷，誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d，使用10 μm雌二醇（17α-estradiol）誘導(dǎo)表達(dá)48 h后檢測愈傷組織中4個(gè)JsTPS基因的表達(dá)水平，獲得了與本研究中一致的結(jié)果（未發(fā)表），進(jìn)一步證實(shí)了此系統(tǒng)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄激活的可行性。

3.2? 茉莉花JsMYB108和JsMYB305可能參與了萜類香氣物質(zhì)合成的調(diào)控

茉莉花JsMYB108和JsMYB305有典型的R2R3結(jié)構(gòu)域，表明它們?yōu)镽2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子。JsMYB108和JsMYB305與其他物種中MYB108和MYB305蛋白相似度最大，MYB108對花瓣顏色的遺傳調(diào)控與進(jìn)化發(fā)揮了重要作用[36]，而MYB305相關(guān)蛋白在花中苯丙類生物合成基因中有一定的激活作用[37]，表明它們可能參與了花色和花香的調(diào)控。此外，將JsMYB108和JsMYB 305與擬南芥 R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)JsMYB108和JsMYB305與擬南芥AtMYB112以及AtMYB21親緣關(guān)系最近，其中MYB112是在非生物脅迫條件下促進(jìn)花青素積累的調(diào)控因子[36]。而擬南芥MYB21和MYB24分別與矮牽牛EOBI和EOBII同源，屬于MYB家族的不同分支，通過同時(shí)調(diào)節(jié)初級代謝和苯丙烷代謝的基因來觸發(fā)苯丙烷途徑代謝產(chǎn)物的合成[38]，提示JsMYB108和JsMYB305與香氣調(diào)控相關(guān)。

對一些植物香氣相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的研究表明其調(diào)控的下游基因通常與轉(zhuǎn)錄因子具有一致的表達(dá)特征[10-12]。本研究中，JsMYB108和JsMYB305在晝夜不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平與4個(gè)JsTPS基因的表達(dá)特征一致，表現(xiàn)為夜間21：00及1：00高量表達(dá)，白天11：00和15：00表達(dá)量低，與前人對雙瓣茉莉花主要萜烯類成分相對含量變化規(guī)律相一致[40]。此外，JsMYB108轉(zhuǎn)化茉莉愈傷組織后JsTPS2表達(dá)水平顯著提高，JsMYB305轉(zhuǎn)化茉莉愈傷組織后4個(gè)JsTPS基因表達(dá)量均顯著提高。介于TPS是萜類代謝途徑下游的限速酶[9]，JsTPS1、JsTPS2和JsTPS3與倍半萜合成酶TPS2高度同源，而JsTPS4與單萜合成酶FaNES1[22]高度同源，此結(jié)果提示JsMYB108和JsMYB305可能參與倍半萜和單萜類香氣的調(diào)控。由于萜類合成途徑中報(bào)道的轉(zhuǎn)錄因子很少，目前僅在姜花[18]、紫丁香[19]和金龍膽[20]中有初步探索，本研究的結(jié)果為將來茉莉花萜類香氣的深入調(diào)控研究提供了一些候選方向和基因選擇。

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