脂聯(lián)素抑制甲基環(huán)糊精包被的膽固醇誘導(dǎo)的人血管平滑肌細(xì)胞泡沫化*

薛貽敏， 孟 春， 曾麗娟， 黃廷烽， 吳 畏， 林風(fēng)輝△

（1福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院，福建省立醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)四科，福建福州350001；2福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建福州350108）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心腦血管疾病的首要原因，后期斑塊區(qū)域破裂形成的血栓可導(dǎo)致急性供血障礙甚至死亡。血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）源性泡沫細(xì)胞大量存在于AS 斑塊病變區(qū)域內(nèi)，是主要的泡沫細(xì)胞之一，它們通過自分泌細(xì)胞因子并促進(jìn)自身的增殖、遷移和炎癥反應(yīng)，在AS 斑塊重塑及失穩(wěn)過程中發(fā)揮重要作用［1-2］。脂聯(lián)素（adiponectin，APN）是脂肪細(xì)胞分泌的一種內(nèi)源性蛋白質(zhì)，具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、降低炎癥反應(yīng)、減輕胰島素抵抗、穩(wěn)定血管斑塊等多種生物學(xué)效應(yīng)，在AS 相關(guān)的多種心血管疾病中起保護(hù)作用［3］，但其具體作用機(jī)制仍未被完全闡明。本研究用甲基環(huán)糊精包被的膽固醇（cholesterol：methyl-βcyclodextrin，Chol：MβCD）誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的 VSMCs源性泡沫細(xì)胞，并基于沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）/過氧化物酶增殖物激活受體γ 輔激活因子1α（peroxisomal proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α）通路探討APN 對 VSMCs 泡沫化的影響，尋找 APN 抗 AS 的潛在機(jī)制。

材料和方法

1 主要試劑

人主動脈平滑肌細(xì)胞株（CRL-1999）購自ATCC。人重組 APN、Chol：MβCD 及油紅 O 染料均購自 Sigma；膽固醇檢測試劑盒及熒光標(biāo)記膽固醇外流分析試劑盒均購自BioVision；胎牛血清購自Gibco。硫酸鏈霉素和青霉素均購自華北制藥股份公司；DMEM低糖培養(yǎng)液及TRIzol 試劑購自Invitrogen；BCA 蛋白濃度測驗盒購自上海碧云天生物工程有限公司；逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒購自TaKaRa；RT-qPCR 試劑盒購自Roche；PCR 引物由上海生工生物技術(shù)有限公司設(shè)計合成；兔抗 SIRT1、PGC-1α 和 GAPDH 抗體及辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG均購自Cell Signaling Technology。

2 主要方法

2.1 VSMCs 的培養(yǎng) 用DMEM 低糖培養(yǎng)液（加入10%胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素）培養(yǎng)人主動脈平滑肌細(xì)胞，于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（37 ℃、5%CO2）內(nèi)培養(yǎng)。每2～3 d更換一次培養(yǎng)液，實驗選取對數(shù)期增殖旺盛的細(xì)胞。

2.2 實驗分組 以每孔 1×105接種 VSMCs 至 24 孔板上，細(xì)胞貼壁后更換為無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為5 組：對照組（正常培養(yǎng)）、泡沫細(xì)胞組（加入含有100 mg/L Chol：MβCD 的DMEM 低糖培養(yǎng)液，繼續(xù)刺激 24 h 構(gòu)建 VSMCs 源性泡沫細(xì)胞模型［4］）及低、中、高劑量APN 組（在泡沫細(xì)胞構(gòu)建成功后分別加入2.5、5 和 10 mg/L APN 繼續(xù)干預(yù)24 h，其余兩組給予同等體積的 PBS 干預(yù) 24 h［5］）。每組設(shè) 3 個復(fù)孔。

2.3 油紅O 染色 油紅O 染料0.7 g溶于200 mL 異丙醇中制成油紅O 儲存液，稀釋2/3 后配成工作液。培養(yǎng)結(jié)束后，倒去培養(yǎng)液，PBS 沖洗3 次，4%多聚甲醛固定30 min，室溫放置10 min 后加入油紅O 工作液，避光染色30 min，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，對紅染顆粒計數(shù)，計算單個細(xì)胞內(nèi)平均脂質(zhì)含量。

2.4 酶熒光化學(xué)法檢測細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量 離心管收集細(xì)胞，PBS 洗脫后加入 500 μL 正己烷/異丙醇混合液，超聲破碎細(xì)胞，以800×g離心10 min，收集上清液，按照膽固醇測定試劑盒說明書，測定胞內(nèi)總膽固醇（total cholesterol，TC）和游離膽固醇（free cholesterol，F(xiàn)C），以mg/（g protein）表示。膽固醇酯（cholesteryl ester，CE）=TC-FC。CE/TC×100%＞50%則認(rèn)為符合泡沫細(xì)胞改變。

2.5 膽固醇流出率的檢測 按照熒光檢測試劑盒說明書檢測細(xì)胞膽固醇流出率，計算方法：膽固醇流出率（%）=細(xì)胞上清液熒光測值/（細(xì)胞上清液熒光測值+細(xì)胞裂解液熒光測值）×100%。

2.6 RT-qPCR 檢測 各 組細(xì) 胞 SIRT1 和 PGC-1α 的mRNA 表達(dá) 各組細(xì)胞用 PBS 清洗 2 次，TRIzol 試劑提取總RNA 后，按逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒及RT-qPCR 試劑盒說明書進(jìn)行RT-qPCR 檢測。反應(yīng)參數(shù)為：95.0 ℃5 min預(yù)變性；95.0 ℃ 15 s變性，60 ℃ 30s退火，循環(huán)40 次。各樣本重復(fù)3 次，以β-肌動蛋白（actin）為內(nèi)參照，各基因的相對表達(dá)量均采用2-ΔΔCt法表示。所用引物序列詳見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for RT-qPCR

2.7 Western blot 檢測各 組 細(xì)胞 SIRT1 和 PGC-1α的蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞總蛋白并進(jìn)行蛋白定量（BCA 法），取等量蛋白（30 μg）行SDS-PAGE 分離后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，非特異性封閉2 h，加入Ⅰ抗（兔抗 SIRT1 和 PGC-1α 抗體 1∶500 稀釋，兔抗GAPDH 抗體 1∶1 000 稀釋），4 ℃孵育過夜，HRP 標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗（1∶2 000 稀釋）室溫孵育1 h 后ECL 顯色，凝膠圖形分析系統(tǒng)Image Lab 3.0 采集掃描，以 SIRT1、PGC-1α 與 GAPDH 條帶灰度值的比值表示其相對表達(dá)量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組細(xì)胞油紅O染色結(jié)果

對照組的VSMCs呈梭形，胞內(nèi)幾乎無紅色顆粒，生長過程呈典型峰谷狀；泡沫細(xì)胞組VSMCs 形態(tài)增大變圓，胞質(zhì)大量紅色脂滴聚集，胞內(nèi)脂質(zhì)含量顯著升高（P＜0.05），呈泡沫樣改變；與泡沫細(xì)胞組比較，低、中和高劑量APN 干預(yù)組VSMCs 胞內(nèi)脂質(zhì)含量均顯著下降（P＜0.05），泡沫細(xì)胞減少；隨著APN 濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)紅色顆粒呈下降趨勢，見圖1。

Figure 1.Results of oil red O staining in each group（scale bar=50 μm）.A：control group；B：foam cell group；C：low-dose（2.5 mg/L）APN group；D：middle-dose（5 mg/L）APN group；E：high-dose（10 mg/L）APN group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs A；#P＜0.05 vs B；?P＜0.05 vs C.圖1 各組細(xì)胞油紅O染色結(jié)果

2 各組細(xì)胞胞內(nèi)膽固醇檢測結(jié)果

與對照組相比，泡沫細(xì)胞組胞內(nèi)TC、FC 和CE 的含量及CE/TC 值均顯著升高（P＜0.05）；各APN 干預(yù)組中，胞內(nèi)TC 和CE 含量及CE/TC 值均較泡沫細(xì)胞組顯著下降（P＜0.05）；高劑量APN 降低CE 和CE/TC的效果優(yōu)于中、低劑量APN（P＜0.05），見表2。

表2 各組細(xì)胞胞內(nèi)膽固醇檢測結(jié)果檢測Table 2.The levels of intracellular cholesterol in each group（Mean±SD. n=3）

3 各組細(xì)胞膽固醇流出率檢測結(jié)果

與對照組相比，泡沫細(xì)胞組細(xì)胞膽固醇流出率顯著升高（P＜0.05）；各劑量APN 干預(yù)后，細(xì)胞膽固醇流出率均較泡沫細(xì)胞組顯著升高（P＜0.05）；不同劑量組間比較結(jié)果顯示，中、高劑量APN 組細(xì)胞膽固醇流出率顯著高于低劑量 APN 組（P＜0.05），見圖2。

Figure 2.Cholesterol efflux in each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs foam cell group；?P＜0.05 vs low-dose APN group.圖2 各組細(xì)胞膽固醇流出率檢測結(jié)果

4 各組細(xì)胞SIRT1和PGC-1α的mRNA表達(dá)

與對照組比較，泡沫細(xì)胞組SIRT1 和PGC-1α 的mRNA 相對表達(dá)量均顯著下降（P＜0.05）；各APN 干預(yù)組中，SIRT1 和 PGC-1α 的 mRNA 相對表達(dá)量均較泡沫細(xì)胞組顯著升高（P＜0.05）；中、高劑量APN 組SIRT1和PGC-1α的mRNA相對表達(dá)量顯著高于低劑量APN組（P＜0.05），見圖3。

Figure 3.The mRNA levels of SIRT1（A）and PGC-1α（B）in each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs foam cell group；?P＜0.05 vs low-dose APN group圖3 各組細(xì)胞SIRT1和PGC-1α的mRNA表達(dá)

5 各組細(xì)胞SIRT1和PGC-1α的蛋白表達(dá)

與對照組比較，泡沫細(xì)胞組SIRT1 和PGC-1α 蛋白的相對表達(dá)量均顯著下降（P＜0.05）；各APN 干預(yù)組中，SIRT1 和PGC-1α 蛋白的相對表達(dá)量均較泡沫細(xì)胞組顯著升高（P＜0.05）；中、高劑量APN 組SIRT1和PGC-1α 蛋白的相對表達(dá)量顯著高于低劑量APN組（P＜0.05），見圖4。

Figure 4.The protein levels of SIRT1（A）and PGC-1α（B）in each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs foam cell group；?P＜0.05 vs low-dose APN group.圖4 各組細(xì)胞SIRT1和PGC-1α蛋白的表達(dá)

討 論

VSMCs攝取大量脂質(zhì)成分使得細(xì)胞外觀呈現(xiàn)泡沫樣改變是AS 病變過程的中心環(huán)節(jié)。體外實驗中膽固醇因不溶于水難以被細(xì)胞直接吸收，β-環(huán)糊精具有外側(cè)親水、內(nèi)側(cè)疏水的環(huán)狀立體結(jié)構(gòu)，性質(zhì)穩(wěn)定，可吸附膽固醇而形成緊密的包合物。Chol：MβCD 作為膽固醇和β-環(huán)糊精的包合物，可順利進(jìn)入細(xì)胞中并釋放出膽固醇，造成胞內(nèi)膽固醇蓄積，從而建立穩(wěn)定的泡沫細(xì)胞模型［6］。故本研究利用Chol：MβCD 刺激VSMCs，誘導(dǎo)VSMCs 源性泡沫細(xì)胞模型，模擬人體內(nèi)AS 病變過程中膽固醇沉積和泡沫細(xì)胞的形成。目前認(rèn)為，在中晚期AS 斑塊病變中，絕大多數(shù)泡沫細(xì)胞為VSMCs 源性，抑制VSMCs 泡沫化有助于穩(wěn)定斑塊、延緩AS 進(jìn)程。APN 是維持血管穩(wěn)態(tài)的重要因子，可通過與其受體結(jié)合，抑制脂質(zhì)合成，促進(jìn)脂肪酸氧化，從而調(diào)控脂質(zhì)平衡［7］。本研究使用不同濃度APN 干預(yù)VSMCs 源性泡沫細(xì)胞，結(jié)果顯示APN 可呈濃度依賴性抑制VSMCs 的脂質(zhì)沉積，促進(jìn)細(xì)胞膽固醇流出，提示APN 可有效抑制Chol：MβCD誘導(dǎo)的人VSMCs泡沫化。

膽固醇在細(xì)胞內(nèi)以FC 及CE 兩種形式存在，二者存在著動態(tài)平衡，?；o酶A：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶是調(diào)控胞內(nèi)膽固醇代謝平衡的關(guān)鍵酶，可將多余的FC 轉(zhuǎn)化為CE 并儲存于細(xì)胞內(nèi)的脂滴中，從而避免過量的FC 對細(xì)胞造成損傷，減少CE 在胞內(nèi)的沉積是抑制泡沫細(xì)胞形成的關(guān)鍵［8］。本研究中APN 可顯著降低細(xì)胞內(nèi)TC，隨著劑量的增加對胞內(nèi)CE 的抑制更加顯著，從而降低CE/TC，促進(jìn)細(xì)胞膽固醇流出，說明APN 主要通過抑制CE 沉積抑制細(xì)胞泡沫化。此外，Ebrahimi-Mamaeghani 等［9］的研究證實，APN 可通過抑制血小板聚集，減少血小板活化，發(fā)揮一定的抗血栓作用；Wang 等［10］的研究顯示，抑制APN 的表達(dá)可使內(nèi)皮依賴性平滑肌松弛障礙加重，從而進(jìn)一步損害血管內(nèi)皮細(xì)胞。以上研究說明APN可通過多種途徑發(fā)揮抗AS作用。

SIRT1 是sirtuin 家族成員之一，可通過對底物的去乙酰化作用參與細(xì)胞的分化、增殖、凋亡和代謝等過程。已有研究表明，VSMCs中SIRT1的表達(dá)減少可促進(jìn)AS中斑塊纖維帽的破裂，SIRT1還可通過抑制核因子κB信號通路而抑制VSMCs泡沫化［11-12］。PGC-1α是SIRT1的靶分子，SIRT1對PGC-1α的去乙酰化能顯著提高PGC-1α 的活性；作為眾多轉(zhuǎn)錄因子的共激活因子，PGC-1α 能通過抑制活性氧自由基介導(dǎo)的VSMCs遷移及增殖，減少泡沫細(xì)胞的形成［13-14］。本研究中VSMCs 源性泡沫細(xì)胞的形成伴隨著SIRT1 和PGC-1α 的表達(dá)降低，提示 SIRT1/PGC-1α 通路參與VSMCs的泡沫化進(jìn)程，這與上述文獻(xiàn)研究一致。近年研究顯示APN 可通過干擾Toll 樣受體4 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)抑制 VSMCs 泡沫化［15］，另外蛋白激酶 C/活化蛋白激酶C受體1也可能是APN 抑制VSMCs泡沫化的作用通路［5］，然而 APN 是否通過調(diào)控 SIRT1/PGC-1α通路影響VSMCs泡沫化還未見報道。本研究結(jié)果顯示，APN 可以逆轉(zhuǎn)VSMCs 源性泡沫細(xì)胞中SIRT1 和PGC-1α的低表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞膽固醇流出，減輕胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，說明APN 可能通過SIRT1/PGC-1α 通路抑制VSMCs泡沫化。既往在成肌細(xì)胞中，有研究證實APN可通過誘導(dǎo)胞外Ca2+內(nèi)流，激活腺苷酸活化蛋白激酶信號來調(diào)控SIRT1/PGC-1α通路［16］。本研究中APN對SIRT1/PGC-1α通路的調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。

綜上所述，本研究結(jié)果表明APN 在體外可呈濃度依賴性抑制Chol：MβCD 誘導(dǎo)的人VSMCs 泡沫化，并可能通過調(diào)控SIRT1/PGC-1α 通路來實現(xiàn)，為進(jìn)一步探討APN的抗AS作用奠定了實驗基礎(chǔ)。