三七總皂苷通過激活PI3K/AKT/mTOR 信號通路調(diào)控低氧高二氧化碳環(huán)境下大鼠PASMCs的自噬和增殖*

陳玲瓏， 武垣伶 ， 張 賽 ， 黃丹娜， 王萬鐵△

（1溫州市人民醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，浙江溫州325000；2溫州醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)與病理生理學(xué)系，浙江溫州325035；3山西白求恩醫(yī)院檢驗科，山西太原030000）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種以肺氣流慢性阻塞為特征、會干擾正常呼吸且不能完全逆轉(zhuǎn)的疾病［1］，進(jìn)一步發(fā)展可能導(dǎo)致慢性肺心病的發(fā)生。肺動脈高壓（pulmonary hypertension，PH）是肺心病的特征性改變，直接影響肺心病的預(yù)后，其病理特征是阻塞性血管重構(gòu)，部分原因是過度的肺動脈平滑肌細(xì)胞（pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs）增殖［2］。

三七總皂苷（Panax notoginsengsaponins，PNS）為三七根莖的主要活性成分，主要含有人參皂苷Rg1、人參皂苷 Rb1 及三七皂苷 R1［3］。PNS 具有抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移［4］，減少血小板聚集［5］和抗動脈粥樣硬化的作用［6］。但PNS 干預(yù)低氧高二氧化碳性肺動脈高壓（hypoxic hypercapnia-induced pulmonary hypertension，HHPH）的具體作用機制尤其在涉及到自噬相關(guān)通路方面并不是十分明了。因此，本研究以基于磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB/AKT）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路的細(xì)胞自噬為切入點，探討PNS在低氧高二氧化碳（hypoxia and hypercapnia，HH）環(huán)境下對大鼠PASMCs 自噬和增殖的調(diào)控作用。

材料和方法

1 細(xì)胞和主要試劑及儀器

大鼠PASMCs 購于北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司。PNS 購于成都德思特生物技術(shù)有限公司；LY294002及兔抗大鼠AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、LC3B、P62 和增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體購于MCE；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 購于Biosharp；高糖DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清購于Gibco；CCK-8 試劑盒購于Dojindo。酶標(biāo)儀（Bio-Rad）；電泳儀（北京六一儀器廠）；熒光顯微鏡（Nikon）；蛋白電泳/轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad）；透射電鏡（HITACHI）；化學(xué)發(fā)光成像儀（上海勤翔科學(xué)儀器）。

2 實驗方法

2.1 細(xì)胞模型的制備及分組 取符合條件的細(xì)胞，隨機分為5組，饑餓處理 24 h。（1）對照（control，CON）組：置于常氧（21% O2，5% CO2，37 ℃）箱內(nèi)用DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；（2）HH 組：置于造模箱（5%O2，6%CO2，37 ℃）內(nèi)用DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；（3）HH+PNS 組：在 DMEM 高糖培養(yǎng)基中加入200 mg/L PNS 并置于造模箱內(nèi)培養(yǎng)24 h；（4）PI3K 抑制劑 LY294002 組（HH+LY 組）：在DMEM 高糖培養(yǎng)基中加入20 μmol/L LY294002 并置于造模箱內(nèi)培養(yǎng)24 h；（5）HH+PNS+LY 組：在DMEM 高糖培養(yǎng)基中加入 20 μmol/L LY294002 和 200 mg/L PNS 并置于造模箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。

2.2 CCK-8 法檢測細(xì)胞活力 按每孔1×104個細(xì)胞數(shù)鋪96 孔板（每組3 或4 個復(fù)孔）于37 ℃培養(yǎng)24 h。造模結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基混合液，PBS 洗滌，每孔加入 110 μL 混合液（100 μL 純培養(yǎng)基+10 μL CCK-8 溶液），不要有氣泡。放入37 ℃常氧培養(yǎng)箱。孵育適當(dāng)時間（50 min左右），用酶標(biāo)儀測定450 nm處A值。

2.3 RT-qPCR 檢 測 AKT、mTOR、LC3 和 p62 的mRNA 表達(dá) 分組處理完畢的細(xì)胞去除培養(yǎng)液洗滌后，每孔加960 μL Trizol，用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，加入192 μL 氯仿混勻靜置，吸取上層水相（約400 μL）加等體積異丙醇使RNA 沉于管底，棄上清加960 μL 75%乙醇使沉淀懸浮，再次離心收集RNA。測完RNA 濃度后，按說明書進(jìn)行第1 鏈cDNA 合成和gDNA 去除及RT-qPCR 體系與條件的操作。引物序列設(shè)計與合成見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

2.4 Western blot 檢 測 PASMCs 中 AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、LC3B、P62 和 PCNA 的蛋白水平分組處理完畢的細(xì)胞用PBS清洗后加入1 mL細(xì)胞裂解混合液（PMSF∶RIPA=1∶100），離心后收集上清于新的1.5 mL EP 管。用BCA 濃度測定試劑盒檢測所收集的上清液蛋白總濃度。將測好濃度的蛋白樣品與相應(yīng)體積的loading buffer 混合后，于100 ℃煮沸5 min 備用。每孔20 μg 的蛋白上樣量進(jìn)行電泳，并轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜后將其置于5%脫脂牛奶中室溫?fù)u晃封閉2 h。加Ⅰ抗（抗AKT、mTOR、p-mTOR、LC3B、PCNA 和 GAPDH 抗體稀釋比例均為 1∶1 000，抗 p-AKT 抗體稀釋比例為1∶2 000）于4 ℃冰箱中孵育過夜。次日取出PVDF 膜用TBST 快速漂洗后，加Ⅱ抗（用TBST 稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗，比例為1∶10 000）于室溫緩慢孵育1 h。配制化學(xué)發(fā)光液，將漂洗后的PVDF 膜置于曝光儀中，滴加發(fā)光液，曝光并保存結(jié)果。

2.5 透射電鏡觀察PASMCs 中自噬小體 取長勢良好的對數(shù)期的血管平滑肌細(xì)胞制成細(xì)胞懸液并離心，加入預(yù)冷的2.5%戊二醛固定液于4 ℃固定，經(jīng)0.1 mol/L PBS 漂洗后每管加入1 滴1%鋨酸固定液后放入37 ℃烘箱1 h 進(jìn)行后固定。再次漂洗后每管加入1 滴1%醋酸鈾染色液放置1 h 進(jìn)行塊染。將標(biāo)本分別浸入70%、80%和90%丙酮脫水各10 min，后浸入純丙酮2次，共20 min（通風(fēng)柜中進(jìn)行）。浸透時分3 步：丙酮∶包埋液=1∶1，37 ℃烘箱1 h；丙酮∶包埋液=1∶4，37 ℃烘箱過夜；純包埋液45 ℃烘箱1 h。包埋聚合后，依次進(jìn)行半薄切片，超薄切片，最后用透射電鏡觀察及拍片。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21 軟件對各組實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。所有實驗數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組樣本的均數(shù)比較采取單因素方差分析（one-way ANOVA）。若方差齊，則采用SNK-q檢驗進(jìn)行兩兩組間比較；若方差不齊，則采用 Dunnett's T3 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PNS濃度的確定

CCK-8 結(jié)果顯示 ，與 0 mg/L組相比 ，3.125、6.25、12.5、25、50 和 100 mg/L 組細(xì)胞存活率的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性（P＞0.05），200 mg/L 組的細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.05），400、800 和1 600 mg/L 組的細(xì)胞存活率過分降低。因此，選擇200 mg/L 作為此研究中PNS的濃度，見圖1。

Figure 1.Effects of different concentrations of PNS on the survival rate of PASMCs.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs 0 mg/L group.圖1 不同濃度三七總皂苷對大鼠PASMCs存活率的影響

2 各組細(xì)胞活力

結(jié)果顯示，與CON 組相比，HH 組細(xì)胞活力減弱（P＜0.05）；與HH 組相比，HH+PNS組及HH+LY 組細(xì)胞活力均減弱（P＜0.05）；與HH+PNS 組相比，HH+PNS+LY組細(xì)胞活力無顯著改變（P＞0.05），見圖2。

Figure 2.The viability of PASMCs in each group.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs HH group.圖2 各組大鼠PASMCs活力的變化

3 各組細(xì)胞AKT、mTOR、LC3和P62的mRNA表達(dá)

與 CON 組 相 比 ，HH 組 AKT、mTOR 及 P62 的mRNA 表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與HH 組相比，HH+PNS 組 AKT、mTOR 及 P62 的 mRNA 表達(dá)水平升高，HH+LY 組 AKT、mTOR 及 P62 的 mRNA 表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與 HH+PNS 組相比，HH+PNS+LY 組AKT、mTOR 及 P62 的 mRNA 表 達(dá)水 平降 低（P＜0.05）。與 CON 組相比，HH 組 LC3 的 mRNA 表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與HH 組相比，HH+PNS 組LC3 的mRNA 表達(dá)水平降低，HH+LY 組 LC3 的 mRNA 表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與 HH+PNS 組相比，HH+PNS+LY 組 LC3 的 mRNA 表 達(dá) 水 平 升 高（P＜0.05）。見圖3。

Figure 3.The mRNA levels of AKT，mTOR，LC3 and P62 in each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs HH group；△P＜0.05 vs HH+PNS group.圖3 各組細(xì)胞AKT、mTOR、LC3及P62的mRNA表達(dá)情況

4 各組細(xì)胞p-AKT、p-mTOR、P62、LC3B和PCNA蛋白水平的比較

與 CON 組相比，HH 組 p-AKT、p-mTOR 和 P62 的蛋白水平降低（P＜0.05）；與HH 組相比，HH+PNS 組p-AKT、p-mTOR 和 P62 的蛋白水平升高，HH+LY 組p-AKT、p-mTOR 和 P62 的蛋白水平降低（P＜0.05）；與 HH+PNS 組相比，HH+PNS+LY 組 p-AKT、p-mTOR和P62 的蛋白水平降低（P＜0.05）。與CON 組相比，HH 組 LC3B 的蛋白水平升高（P＜0.05）；與 HH 組相比，HH+PNS 組 LC3B 的蛋白水平降低，HH+LY 組LC3B 的蛋白水平升高（P＜0.05）；與 HH+PNS 組相比 ，HH+PNS+LY 組 LC3B 的蛋 白水 平升 高（P＜0.05）。與 CON 組相比，HH 組 PCNA 的蛋白水平升高（P＜0.05）；與 HH 組相比，HH+PNS 組 PCNA 的蛋白水平降低，HH+LY 組PCNA 的蛋白水平升高（P＜0.05）；與 HH+PNS 組相比，HH+PNS+LY 組 PCNA 的蛋白水平升高（P＜0.05）。見圖4。

Figure 4.The protein levels of p-AKT，p-mTOR，LC3B，P62 and PCNA in each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs HH group；△P＜0.05 vs HH+PNS group.圖4 各組細(xì)胞p-AKT、p-mTOR、LC3B、P62及PCNA蛋白的表達(dá)情況

5 透射電鏡觀察大鼠PASMCs內(nèi)自噬小體形成情況

與CON 組相比，HH 組的自噬小體數(shù)量增多；與HH 組相比，HH+PNS 組的自噬小體數(shù)量明顯減少，HH+LY 組的自噬小體數(shù)量明顯增多；與HH+PNS 組相比，HH+PNS+LY組的自噬小體數(shù)量增多，見圖5。

Figure 5.The ultrastructural changes of the PASMCs in each group observed by electron microscopy（×25 000）.The scale bar=0.2 μm.圖5 各組細(xì)胞電鏡超微結(jié)構(gòu)

討 論

HHPH 是一個多因子參與的病理生理學(xué)過程，包括肺血管收縮（pulmonary vasoconstriction，PV）、肺血管重構(gòu)（pulmonary vascular structural remodeling，PVSR）及血栓形成等方面［7］，其中 PV 和 PVSR 是兩個主要的發(fā)病環(huán)節(jié)［8］。在PVSR 中，存在管壁平滑肌細(xì)胞、內(nèi)膜彈力纖維及膠原纖維增生。而PASMCs的增殖和遷移是重要的形成因素。簡言之，HH 引起PASMCs 增殖，導(dǎo)致PVSR，加重PH 的發(fā)展。對于肺部疾病和（或）低氧引起的PH 而言，其發(fā)生往往同時伴隨著肺泡和血液中二氧化碳分壓的升高［9］。因此，制備低氧伴高二氧化碳混合氣體細(xì)胞模型能更好地模擬患者的臨床發(fā)病情況。

自噬普遍存在于真核生物中，是一種細(xì)胞在壓力條件下的自我適應(yīng)性機制。這是一把“雙刃劍”：在生理條件下低水平自噬作為細(xì)胞自穩(wěn)的保護(hù)性機制存在；當(dāng)受到損傷刺激時，自噬信號高表達(dá)參與疾病進(jìn)程。有研究發(fā)現(xiàn)，自噬可以通過調(diào)節(jié)血管壁細(xì)胞的一系列變化從而影響肺血管的穩(wěn)態(tài)［10］，從自噬的角度研究PVSR可能會有所突破。

前期動物實驗結(jié)果顯示，PNS 可通過抑制PVSR而減輕 HHPH［11］，但它是否通過 PI3K/AKT/mTOR 信號通路介導(dǎo)的細(xì)胞自噬來緩解PH 尚未見詳細(xì)報道，需進(jìn)一步研究。

本研究在使用PNS 后檢測了細(xì)胞自噬及增殖的相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果表明，PNS 可改變HH 環(huán)境下PASMCs 的自噬和增殖相關(guān)指標(biāo)，即PNS 可引起HH環(huán)境下 PASMCs 中 AKT、mTOR 和 P62 的 mRNA 及 p-AKT、p-mTOR 和 P62 的蛋白水平上調(diào)，LC3 的 mRNA和蛋白水平下調(diào)，自噬小體數(shù)量減少，PCNA 的表達(dá)下調(diào)。這表明在HH 條件下，加入PNS 有助于降低PASMCs的自噬和增殖，有助于緩解PVSR，維持正常的肺血管形態(tài)。

本實驗將LY294002 與PNS 合用，結(jié)果表明，與HH+PNS 組相比，HH+PNS+LY 組自噬相關(guān)指標(biāo)AKT、mTOR 和 P62 的 mRNA 及 p-AKT、p-mTOR 和P62 的蛋白水平下調(diào)，LC3 的mRNA 和蛋白水平上調(diào)，自噬小體數(shù)量增加，PCNA 的表達(dá)上調(diào)。這表明加入PI3K/AKT/mTOR 信號通路抑制劑LY294002后，PNS對PASMCs自噬的緩解程度有所減弱。

綜上所述，在HH 環(huán)境下，PNS 有助于降低大鼠PASMCs的自噬，減弱其增殖，機制可能與激活PI3K/AKT/mTOR信號通路有關(guān)。