程序性細(xì)胞死亡蛋白4調(diào)控K562細(xì)胞活力和凋亡的研究*

龍馨妍， 何澤詔， 彭 鵬， 李 濤， 張慧慧， 袁仕善， 張 霞△

（湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1免疫學(xué)教研室，2生物化學(xué)教研室，湖南長沙410013）

程序性細(xì)胞死亡蛋白4（programmed cell death protein 4，PDCD4）是 1995 年 Shibahara 等［1］在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因，隨后在其他動物和人類中被鑒定出來［2］。人類PDCD4基因定位于染色體10q24 處，編碼區(qū)約1.4 kb，編碼469 個氨基酸。PDCD4 蛋白的氨基側(cè)有2 個重要的α-螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)“MA3”，PDCD4 通過該結(jié)構(gòu)域與翻譯起始因子eIF4A分子結(jié)合，抑制核糖體復(fù)合物的形成和蛋白質(zhì)的翻譯。此外，PDCD4 還可以直接與mRNA 結(jié)合以抑制其翻譯［3］。PDCD4 作為一種新的腫瘤抑制因子，在很多實體腫瘤中，如乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌和肺癌中表現(xiàn)為下調(diào)甚至缺失，常預(yù)示著腫瘤的惡性程度及不良預(yù)后，其發(fā)揮抑癌作用主要是通過抑制一組與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因的翻譯而實現(xiàn)的，而且其在不同組織類型中發(fā)揮的作用不盡相同［4-5］。慢性粒細(xì)胞白血?。╟hronic myeloid leukemia，CML）是造血系統(tǒng)腫瘤，其主要特征是9 號染色體上ABL基因和22 號染色體上的BCR基因相互融合形成了BCR-ABL融合基因進(jìn)而表達(dá)BCRABL 蛋白，很多學(xué)者都致力于靶向BCR-ABL 及其相關(guān)通路的研究［6］。我們前期研究顯示PDCD4 在慢性粒細(xì)胞白血病中表達(dá)顯著下調(diào)，而且PDCD4 的表達(dá)和BCR/ABL 表達(dá)成負(fù)相關(guān)，PDCD4 的表達(dá)上調(diào)伴隨著細(xì)胞增殖抑制［7］，另有研究表明慢性淋巴細(xì)胞白血病中也存在PDCD4 的表達(dá)下調(diào)［8］，這些結(jié)果都提示我們PDCD4 除了在實體腫瘤中發(fā)揮作用，同時也能影響血液腫瘤，然而PDCD4 在血液腫瘤中具體的作用和機(jī)制仍不清楚。

本研究通過在人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562 中過表達(dá) PDCD4，研究 PDCD4 對 K562 細(xì)胞的活力、周期和凋亡的作用，并進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)錄組測序（RNA sequencing，RNA-seq）檢 測 確 定 PDCD4 在K562細(xì)胞中調(diào)控的下游基因，為深入研究PDCD4對K562作用的分子機(jī)制提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1 細(xì)胞和實驗主要材料

人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562 由山東大學(xué)附屬第二醫(yī)院血液病實驗室饋贈，PDCD4 過表達(dá)慢病毒和對照慢病毒［均攜帶綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）］購自上海吉凱基因。RPMI -1640 培養(yǎng)液和胎牛血清（Gibco）；總 RNA 提取試劑Trizol（Invitrogen）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR 檢測試劑盒（Gene Copoeia）；CCK-8 試劑盒（Biosharp）；細(xì)胞周期檢測試劑盒和細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；彩虹蛋白Marker 和BCA 蛋白檢測試劑盒（Thermo Fisher Scientific）；PDCD4 單抗和 β-actin 單抗（Cell Signaling Technology）。

2 方法

2.1 K562細(xì)胞培養(yǎng) K562細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液中，并將其置于37 ℃、5%CO2的孵育箱中，根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)情況進(jìn)行換液及傳代處理，取處于生長對數(shù)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.2 構(gòu)建穩(wěn)定的過表達(dá)細(xì)胞系 取對數(shù)生長的K562細(xì)胞接種于24孔板，每孔5×104個細(xì)胞，分別感染PDCD4 過表達(dá)慢病毒和空載體慢病毒，MOI 設(shè)置為30，72 h后用熒光顯微鏡確定感染效率，加入終濃度為2.5 mg/L 的嘌呤霉素（purornycin，Puro）進(jìn)行篩選 5～7 d，得 到陽性克隆 PDCD4 過表達(dá)（K562-PDCD4）組和空載體對照（K562-MOCK）組并進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。

2.3 RT-qPCR 收集 K562、K562-MOCK 和 K562-PDCD4 3 組細(xì)胞各 1×106個，采用 Trizol 一步法抽提細(xì)胞總RNA，用核酸蛋白定量儀測定RNA 純度和濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，采用SYBR Green 實時熒光定量PCR 方法檢測目的基因mRNA 的表達(dá)。引物由Invitrogen 設(shè)計合成，詳細(xì)信息見表1。反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為：95 ℃10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，共計 40 個循環(huán)。每個樣本設(shè)3 個復(fù)孔，以2-ΔΔCt表示目的基因在實驗組與對照組中表達(dá)的倍比關(guān)系。

表1 RT-qPCR引物序列信息Table 1.The sequence of primers for RT-qPCR

2.4 Western blot 收集上述3 組細(xì)胞各1×106個，加入200 μL RIPA細(xì)胞裂解液置于冰上裂解，13 400×g離心5 min，收集上清液，采用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品加入上樣緩沖液，煮沸 10 min 進(jìn)行變性，12% SDS-PAGE 分離后，采用濕轉(zhuǎn)的方法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜；用含5%脫脂奶粉的TBST 封閉1 h；再將膜分別浸入1∶2 000 稀釋的兔抗人PDCD4 單克隆抗體和1∶2 000 稀釋的兔抗人β-actin多克隆抗體中，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min；最后在1∶2 000 稀釋的羊抗兔Ⅱ抗中室溫孵育 1 h；TBST 洗 3 次，每次 10 min；滴加 ECL 化學(xué)發(fā)光液顯影。

2.5 CCK-8 實驗 取上述各組處于對數(shù)生長期的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以每孔5 000個的密度接種于96 孔板中，共設(shè)4 個時點（0、24、48 和72 h，細(xì)胞接種當(dāng)天為0 h），每個時點設(shè)3 個復(fù)孔。置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至各時點后，加入CCK-8 溶液（每孔10 μL）繼續(xù)培養(yǎng)，2 h后用酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度（A450）。根據(jù)各組細(xì)胞相對活力，繪制細(xì)胞生長曲線。

2.6 細(xì)胞周期 取上述各組對數(shù)生長期細(xì)胞1×106個，PBS 洗滌 1 遍，棄掉上清后，加入 500 μL 預(yù)冷的70% 乙醇，4 ℃固定過夜，PBS 洗滌1 遍，加入500 μL PI/RNase A 工作液（PI∶RNase A=9∶1），室溫避光30～60 min，細(xì)胞懸液用200 目篩網(wǎng)過濾一次，使用流式細(xì)胞儀記錄激發(fā)波長488 nm 處紅色熒光，檢測細(xì)胞DNA含量。應(yīng)用FlowJo軟件分析細(xì)胞周期數(shù)據(jù)。

2.7 細(xì)胞凋亡 取上述各組處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)至5×108/L接種于6孔板中，各孔加入終濃度為2.5 μmol/L 阿糖胞苷（cytosine arabinoside，Ara-C）預(yù)處理48 h 后，離心收集各組細(xì)胞，PBS洗滌2遍，棄掉上清，加入500 μL的Binding Buffer 重懸細(xì)胞，加入5μL Annexin V-APC 和5μL 7-AAD 染液混勻；室溫、避光、反應(yīng)5～15 min，進(jìn)行流式細(xì)胞儀的觀察和檢測。應(yīng)用FlowJo 軟件分析細(xì)胞凋亡數(shù)據(jù)。

2.8 RNA-seq 實 驗 將 K562-MOCK 組 和 K562-PDCD4組的細(xì)胞樣本送到深圳華大基因股份有限公司的基因組服務(wù)中心進(jìn)行分析，用Trizol一步法提取兩組細(xì)胞中的總RNA，構(gòu)建質(zhì)量合格的DNA 文庫后，使用BGISEQ 平臺進(jìn)行測序。每組檢測3 個樣本，取3 個樣本數(shù)據(jù)的平均值對結(jié)果進(jìn)行分析。為了驗證RNA-seq的準(zhǔn)確性，隨機(jī)挑選6個差異基因進(jìn)行RT-qPCR檢測以驗證基因芯片結(jié)果。引物的序列信息見表1。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有的實驗均采用獨立重復(fù)3 次的數(shù)據(jù)，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，3 組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩組間數(shù)據(jù)的比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 穩(wěn)定過表達(dá)PDCD4 的K562 細(xì)胞系的構(gòu)建及鑒定

慢病毒感染K562 細(xì)胞72 h 后，在熒光顯微鏡下觀察顯示，K562-PDCD4 組和 K562-MOCK 組均可見綠色熒光，而空白對照K562組未見熒光（圖1A）。篩選得到穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系后，流式細(xì)胞儀檢測到病毒表達(dá)蛋白GFP 的陽性率達(dá)到95%以上（圖1B）；RT-qPCR 和 Western blot 結(jié) 果 顯 示 ，K562-PDCD4 組PDCD4 mRNA 水平和蛋白水平均顯著升高（圖1C、1D）。上述實驗結(jié)果證明成功構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)PDCD4 的K562 細(xì)胞系，可用于下一步的細(xì)胞功能分析。

Figure 1.Expression of PDCD4 in the K562 cells infected by lentivirus.A：GFP positive cells which meant successful infection of the lentivirus were observed under fluorescence microscope（scale bar=50 μm）.Almost all the cells of K562-MOCK and K562-PDCD4 groups showed green fluorescence，while no fluorescence was observed in K562 group.B：the proportion of GFP positive cells detected by flow cytometry（K562：0.23%；K562-MOCK：98.8%，K562-PDCD4：98.2%）.C：the mRNA level of PDCD4 detected by RT-qPCR；D：the protein level of PDCD4 detected by Western blot.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs K562-MOCK group.圖1 慢病毒感染的K562細(xì)胞中PDCD4的表達(dá)

2 過表達(dá)PDCD4對K562細(xì)胞活力的影響

CCK-8 實驗檢測過表達(dá) PDCD4 后 K562 細(xì)胞的活力變化情況。結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h后，K562、K562-MOCK 和K562-PDCD4 3 組細(xì)胞的活力沒有明顯差異，但在培養(yǎng) 48 h 和 72 h 后，K562-PDCD4 組的細(xì)胞活力比K562 組和K562-MOCK 組明顯減若，有顯著差異（P＜0.05），見圖2。

Figure 2.The growth curves of the K562 cells after over-expression of PDCD4.CCK-8 assay was used to detect the viability of cells.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs K562-MOCK group.圖2 過表達(dá)PDCD4后K562細(xì)胞生長曲線圖

3 過表達(dá)PDCD4對K562細(xì)胞周期的影響

用PI 對細(xì)胞進(jìn)行染色，運用流式細(xì)胞儀檢測過表達(dá)PDCD4 后K562 細(xì)胞周期的變化情況。FlowJo軟件分析結(jié)果顯示，與K562 組和K562-MOCK 組相比，K562-PDCD4 組 S 期的細(xì)胞比例下降、G2/M 期細(xì)胞比例增加（P＜0.05），見圖3。

Figure 3.Effects of PDCD4 over-expression on cell cycle of K562 cells.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs K562-MOCK group.圖3 過表達(dá)PDCD4對K562細(xì)胞周期的影響

4 過表達(dá)PDCD4對K562細(xì)胞凋亡的影響

采用Ara-C 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，Annexin V-APC/7-AAD 染色檢測過表達(dá)PDCD4 后K562 細(xì)胞凋亡的變化情況。結(jié)果顯示，與K562 組和K562-MOCK 組相比，K562-PDCD4 組細(xì)胞的早期凋亡率沒有明顯變化，但是總凋亡率增加且有顯著差異（P＜0.05），見圖4。

Figure 4.Effects of PDCD4 over-expression on apoptosis of Ara-C-stimulated K562 cells.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs K562-MOCK+Arac-C group.圖4 過表達(dá)PDCD4對K562細(xì)胞凋亡的影響

5 PDCD4過表達(dá)對K562細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響

收集K562-MOCK和K562-PDCD4兩組細(xì)胞的總RNA，經(jīng)鑒定質(zhì)量合格后進(jìn)行RNA 測序分析，每組選取3 個樣本取平均值，進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選。結(jié)果顯示，與K562-MOCK 組比較，K562-PDCD4組有394 種基因有明顯差異表達(dá)，其中16 種基因的水平上調(diào)，378 種基因的水平下調(diào)。根據(jù)KEGG pathway富集分析找出差異表達(dá)基因中富集的信號通路，表明這些基因功能涉及多個方面，包括新陳代謝、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡和細(xì)胞自噬等，見圖5、6 和表 2。選取其中 6 個基因進(jìn)行 RT-qPCR 驗證，其中 2 個表達(dá)上調(diào)的基因：TENM4和MAP3K7CL，以及 4 個表達(dá)下調(diào)的基因：PIK3CA、TRPM7、CCDC186和RANBP3L。結(jié)果顯示，這6 個差異基因的相對表達(dá)量與測序結(jié)果趨勢一致，驗證了RNA-seq 結(jié)果的可靠性，見圖7。

Figure 5.Cluster map of the differentially expressed genes.The horizontal axis is the log2（expression value + 1）of the sample，and the vertical axis is the gene.The redder，the higher expression，and the bluer，the lower expression. n=3.圖5 差異基因表達(dá)聚類圖

Figure 6.KEGG pathway enrichment histogram of the differentially expressed genes.The horizontal axis：the blue represents the -lg（P value）of the sample；the orange represents the number of candidate gene.The vertical axis is the signal pathway.圖6 差異基因KEGG pathway富集柱狀圖

表2 部分上調(diào)或下調(diào)基因Table 2.Partially up-regulated or down-regulated genes

Figure 7.The mRNA levels of differentially expressed genes.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 group vs K562-MOCK group.圖7 RT-qPCR驗證RNA-seq測序結(jié)果

討 論

PDCD4 是一種新的腫瘤抑制因子，具有抑制細(xì)胞生長、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等功能，在多種實體腫瘤中表達(dá)下調(diào)，但PDCD4 在血液腫瘤中的研究報道較少。我們在前期研究中證實PDCD4在慢性粒細(xì)胞白血病中表達(dá)降低，且和融合基因BCR/ABL的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示 PDCD4 在 CML 中發(fā)揮作用。本研究通過慢病毒表達(dá)系統(tǒng)在人類慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562 細(xì)胞中過表達(dá)PDCD4，顯示PDCD4 可以明顯抑制其細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并且通過RNA-seq 分析了差異表達(dá)基因，為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制提供了依據(jù)。

PDCD4在腫瘤中的表達(dá)普遍降低并且受多方面因素的調(diào)控，其中miR-21 可以獨立調(diào)控PDCD4 的表達(dá)［9-10］。目前，在多種腫瘤中證實miR-21可以通過下調(diào)PDCD4 的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化，影響腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲［11-12］。在血液腫瘤中也有研究表明反義抑制miR-21 上調(diào)PDCD4 水平可有助于CML 的治療［13］，并且采用miR-21 拮抗劑可以通過誘導(dǎo)凋亡增強(qiáng)K562 細(xì)胞對三氧化二砷（一種用作治療白血病的中藥）的敏感性［14］。這些結(jié)果都提示我們PDCD4作為一個抑癌基因，不僅僅對實體腫瘤有抑制作用，對血液腫瘤同樣也發(fā)揮作用。最近有報道稱轉(zhuǎn)錄因子STAT5 的磷酸化，可以直接或間接由BCR-ABL1 和FLT3-ITD（AML）驅(qū)動，從而使miR-21 的表達(dá)上調(diào)，表明酪氨酸激酶-STAT5-miR-21-PDCD4 調(diào)節(jié)軸在CML 和 AML 的進(jìn)展和惡性增殖中發(fā)揮重要作用［15］。然而，PDCD4 對CML 存在哪些作用，目前未見有直接的研究報道。因此，我們在CML 代表性細(xì)胞系K562 中過表達(dá) PDCD4，研究 PDCD4 對 K562 細(xì)胞的作用及其可能的機(jī)制。

首先，我們通過CCK-8 實驗證明PDCD4 可以抑制K562 細(xì)胞的活力，這個結(jié)果和實體腫瘤中的研究結(jié)果是一致的，在很多腫瘤實驗中都顯示了PDCD4可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖，包括乳腺癌［16］，鼻咽癌［17］和膠質(zhì)瘤［18］等；其次，我們顯示 PDCD4 可以改變 K562的細(xì)胞周期，表現(xiàn)為G2/M 期阻滯。這個結(jié)果和其他實體腫瘤的研究有些不同，比如在非小細(xì)胞肺癌中，PDCD4 通過抑制PI3K/AKT 通路及其下游的細(xì)胞周期蛋白 CCND1 和激酶 CDK4 從而誘導(dǎo) G1期阻滯［19］；而我們之前的研究顯示PDCD4 對卵巢癌細(xì)胞的周期調(diào)控則是誘導(dǎo)S 期阻滯［20］。在本研究中，我們證實PDCD4 可以誘導(dǎo)K562 細(xì)胞的G2/M 期阻滯，也有研究表明異紫堇定堿可通過PDCD4 誘導(dǎo)G2期阻滯從而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡［21］的，但是具體的作用機(jī)制不清楚。最近有研究表明PDCD4 可在端粒酶永生化的人類上皮細(xì)胞系中抑制p53基因活性，阻止p53

激活 G1/S 檢查點［22］。在肝癌細(xì)胞中PDCD4敲低會抑制細(xì)胞生長以及誘導(dǎo)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（retinoblastoma protein，Rb）磷酸化，這個過程是通過下調(diào)Rb自身、下調(diào)磷酸化Rb的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）的表達(dá)以及上調(diào)CDK 抑制劑 p21 的表達(dá)來完成的［23］。因此，我們推論PDCD4 很可能是通過直接或間接作用于細(xì)胞周期蛋白或激酶來發(fā)揮作用的，相關(guān)的靶點還需要進(jìn)一步確證。

由于很多抑癌基因可以使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［24］，因此，我們進(jìn)一步檢測了PDCD4 對K562 細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明PDCD4可以促進(jìn)阿糖胞苷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。PDCD4是在細(xì)胞凋亡時發(fā)現(xiàn)的表達(dá)上調(diào)基因，因此有很多關(guān)于PDCD4 促進(jìn)細(xì)胞凋亡的研究。已有研究表明PDCD4蛋白在胞核內(nèi)積累，激活Bcl-2蛋白家族的促凋亡成員Bax 和caspases-8-9 和-3，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡［25］。我們也在卵巢癌中發(fā)現(xiàn)PDCD4 可以促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，主要是通過抑制凋亡抑制因子c-FLIP 從而增強(qiáng) caspases-8 的活性來實現(xiàn)的［26］。然而，最近有研究指出PDCD4 通過抑制proCASP3mRNA 表達(dá)而在 HeLa 細(xì)胞中起抗凋亡作用［27］，這表明PDCD4 的促凋亡作用僅局限于某些細(xì)胞類型。很早就有學(xué)者提出，PDCD4 的作用具有細(xì)胞特異性［28］，在不同的細(xì)胞類型中，PDCD4發(fā)揮的作用不盡相同，甚至還出現(xiàn)相反的情況，因此我們研究PDCD4在K562 細(xì)胞系中的作用機(jī)制就更加重要，血液腫瘤和實體腫瘤細(xì)胞的惡性行為存在一定的差異，基因表達(dá)譜也不同。

在本研究中，我們通過轉(zhuǎn)錄組測序分析K562-PDCD4和對照K562-MOCK 兩種細(xì)胞基因表達(dá)差異，初步篩選PDCD4在K562細(xì)胞中下游潛在的靶基因，為后續(xù)的分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。我們的結(jié)果顯示，與對照組相比，過表達(dá)PDCD4 的K562 細(xì)胞有394 種差異表達(dá)基因，其中表達(dá)上調(diào)的有16 種，表達(dá)下調(diào)的有378 種。這可能和PDCD4 的作用機(jī)制有關(guān)，目前認(rèn)為PDCD4 是個翻譯抑制因子，其主要通過抑制基因的翻譯來調(diào)控基因的表達(dá)從而在不同的細(xì)胞種類中發(fā)揮不同的作用，因此下調(diào)基因占大部分。我們進(jìn)一步分析顯示這些差異表達(dá)的基因與新陳代謝、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡和細(xì)胞自噬等相關(guān)，提示PDCD4在K562細(xì)胞中可能通過參與調(diào)節(jié)這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而發(fā)揮作用。除了細(xì)胞周期和凋亡，這些基因中很多和自噬相關(guān)，而我們前期實體腫瘤細(xì)胞實驗也顯示PDCD4 可以通過直接抑制自噬相關(guān)蛋白ATG5 的翻譯從而發(fā)揮很強(qiáng)的自噬抑制作用［29］。新近研究顯示免疫反應(yīng)、造血干細(xì)胞分化和腫瘤細(xì)胞的耐藥性都和自噬相關(guān)。在血液腫瘤中，調(diào)節(jié)自噬可能成為一個在靶向治療領(lǐng)域有前途的研究方向［30］。因此，PDCD4 是否能調(diào)節(jié) K562 細(xì)胞的自噬是我們將要解決的一個問題。此外，基因測序還提示了很多PDCD4 調(diào)控的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，為進(jìn)一步的機(jī)制研究提供了方向。

綜上所述，本研究初步探討了PDCD4對K562細(xì)胞的作用，在后續(xù)工作中，我們將根據(jù)測序的結(jié)果繼續(xù)深入研究PDCD4 在K562 細(xì)胞中具體的分子作用機(jī)制，或進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)實驗以更系統(tǒng)的闡述PDCD4 在髓系白血病CML 中的作用，期望找到更好的靶點，為CML 的發(fā)生發(fā)展以及防治措施的研發(fā)提供初步的參考資料。