羅哌卡因通過抑制STAT3的磷酸化誘導(dǎo)PC12細(xì)胞線粒體自噬*

曾 煉， 劉晨光， 孫曉東， 丁旭東， 桑 明， 羅輝宇

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院，湖北襄陽441000）

羅哌卡因（ropivacaine）作為酰胺類局麻藥的代表，被廣泛應(yīng)用于周圍神經(jīng)阻滯，椎管內(nèi)麻醉以及疼痛治療［1］。流行病學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)羅哌卡因在大劑量和長時間的作用下會產(chǎn)生神經(jīng)毒性，而目前尚無安全有效的預(yù)防及治療措施［2-3］。羅哌卡因誘導(dǎo)神經(jīng)毒性涉及多種機(jī)制，包括神經(jīng)元鈣超載，神經(jīng)元凋亡以及神經(jīng)元自噬［3-6］。線粒體自噬（mitochondrial autophagy，mitophagy）屬于細(xì)胞自噬的特殊類型，其目的在于去除受損的線粒體。理論上，適度的線粒體自噬可以維持神經(jīng)元內(nèi)穩(wěn)態(tài)，但當(dāng)線粒體自噬過度激活時，會導(dǎo)致神經(jīng)元線粒體功能進(jìn)行性的損害，最終誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡［7-8］。在羅哌卡因誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的過程中，已有研究證實羅哌卡因會導(dǎo)致神經(jīng)元線粒體功能障礙［9-11］，但尚無研究報道其對于神經(jīng)元線粒體自噬的作用，同時研究表明信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）可以通過第727 位點絲氨酸的磷酸化保護(hù)神經(jīng)元線粒體功能，抑制過度的線粒體自噬［12-13］。故此，本項工作旨在探討羅哌卡因?qū)Υ笫笫茹t細(xì)胞瘤PC12 細(xì)胞線粒體自噬及STAT3 磷酸化的作用。

材料和方法

1 實驗材料

PC12 細(xì)胞購自于中科院上海細(xì)胞庫；鹽酸羅哌卡因（原料藥，純度：99.99%，恒瑞醫(yī)藥）；高糖DMEM 培養(yǎng)液和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自Gibco；Cell Counting Kit-8（CCK-8）購自Biosharp；活性氧（reactive oxygen species，ROS）分析試劑盒和JC-1 線粒體膜電位檢測試劑盒（KeyGEN BioTECH）；抗p-STAT3 及STAT3 抗體（Proteintech）；抗α-tubulin及 GAPDH 抗體（Abcam）；抗 PINK1、parkin、LC3 及P62抗體（Wanleibio）；DyLight 488綠色熒光II抗（Abcam）；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗鼠IgG、細(xì)胞核染料Hoechst 33258 及線粒體紅色熒光探針Mito-Tracker Red CMXRos（Beyotime）。

SpectraMax i3x 酶標(biāo)儀（Molecular Devices）；IX70倒置熒光顯微鏡（Olympus）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) PC12 細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS、1×105U/L 青和 100 mg/L 鏈霉素的高糖 DMEM 培養(yǎng)液中，置于5%CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，狀態(tài)良好。待其融合度達(dá)80%～90%，用0.25%胰酶消化，進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)或接種。

2.2 CCK-8 實驗檢測細(xì)胞活力 將PC12 細(xì)胞按照3×107/L 的密度接種于96 孔板中，待細(xì)胞處于對數(shù)增長期，參考前期已發(fā)表的文章［14］，使用不同濃度的羅哌卡因（0.5、1、2、4 和8 mmol/L）進(jìn)行處理，另設(shè)空白對照組，每組5個復(fù)孔，培養(yǎng) 24 h 后，加入CCK-8（每孔10 μL）溶液，反應(yīng)3 h，熒光酶標(biāo)儀（激發(fā)光波長450 nm）測定每孔吸光度，以空白孔調(diào)零，計算細(xì)胞相對活力，取對照組細(xì)胞活力為1。

2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 將密度為1×108/L 的PC12細(xì)胞接種于12 孔板中，取對數(shù)增殖期的細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，處理方式同上，培養(yǎng)24 h 后，倒置相差顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 線粒體活性氧的測定 將密度為1×108/L 的PC12細(xì)胞接種于12孔板中，取對數(shù)增殖期的細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，處理方式同上，培養(yǎng)24 h 后，參考文獻(xiàn)中的方法［15］，使用熒光探針2'，7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFHDA）標(biāo)記細(xì)胞中的活性氧，同時選用線粒體熒光探針MitoTracker Red CMXRos 標(biāo)記細(xì)胞中的線粒體，共同孵育30 min后，加入PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定，使用Hoechst 33258標(biāo)記細(xì)胞核，置于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照。

2.5 線粒體膜電位的檢測 參考文獻(xiàn)中的方法［16］，將密度為 1×108/L 的 PC12 細(xì)胞接種于 12 孔板中，取對數(shù)增殖期的細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，處理方式同上，設(shè)空白對照，培養(yǎng)24 h 后棄培養(yǎng)液，PBS 洗滌細(xì)胞，加入線粒體膜電位檢測試劑盒中的JC-1 工作液覆蓋細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱孵育30 min 后，用新鮮培養(yǎng)液洗滌2 次，PBS 清洗1 次后加入4%多聚甲醛室溫固定30 min，再用PBS 清洗2 次后加入Hoechst 33258 標(biāo)記細(xì)胞核，置于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照。正常細(xì)胞：線粒體膜電位正常，細(xì)胞內(nèi)含大量JC-1 聚合體呈高綠高紅的熒光信號；受損細(xì)胞：線粒體膜電位降低，細(xì)胞中JC-1聚合體減少呈現(xiàn)出高綠低紅的熒光信號。

2.6 Western blot 培養(yǎng)于6孔板中的PC12細(xì)胞，處理方式同上，設(shè)空白對照，培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞，加入含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，冰上裂解細(xì)胞，取上清液，使用BCA 試劑盒測定蛋白濃度，每孔上樣蛋白量25 μg，電泳并轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完畢后，用含5%脫脂牛奶的TBST 溶液室溫封閉2 h，加入 I 抗（p-STAT3，1∶1 000；STAT3，1∶500；α-tubulin，1∶1 000；LC3，1∶1 000；p62，1∶1 000；PINK，1∶1 000；parkin，1∶1 000），4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌5 次，每次 3 min，加入 HRP 標(biāo)記的Ⅱ抗（山羊抗兔IgG，1∶10 000；山羊抗鼠IgG，1∶3 000）室溫孵育2 h，TBST 洗滌5次，每次 3 min；加入 ECL 進(jìn)行顯色，使用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)對灰度值進(jìn)行定量。

2.7 免疫熒光染色 將密度5×107/L 的細(xì)胞接種于多聚賴氨酸包被的載玻片上，羅哌卡因作用24 h后，棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞2 次，加入4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞30 min，PBS 洗滌后使用0.2% Triton X-100 透膜10 min，加入含1%馬血清的PBST 溶液室溫封閉 2 h，使用抗 p-STAT3 抗體（1∶200）4 ℃孵育過夜，PBST 洗滌 3 次，每次5min，Dy-Light 488綠色熒光Ⅱ抗（1∶1 000）避光室溫孵育2 h，PBST 洗滌后Hoechst 33258復(fù)染核，置于熒光顯微鏡下觀察并攝片。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 25 統(tǒng)計軟件處理。正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間比較采用多樣本均數(shù)單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 羅哌卡因引起PC12細(xì)胞活力下降及形態(tài)改變

CCK-8 實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，羅哌卡因處理24 h后，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.01），且呈劑量依賴性，其中4 mmol/L羅哌卡因處理24 h 后細(xì)胞活力下降約50%，8 mmol/L 羅哌卡因組細(xì)胞活力下降約70%（圖1）。

Figure 1.The cytotoxicity of ropivacaine on PC12 cells.The PC12 cells were treated with different concentrations of ropivacaine for 24 h，and the cell viability was detected by CCK-8 assay.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs 0 mol/L group.圖1 羅哌卡因?qū)C12細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用

光學(xué)顯微鏡的結(jié)果顯示，從細(xì)胞形態(tài)上來看，對照組的PC12 細(xì)胞呈不規(guī)則狀，多突起，具有類神經(jīng)元結(jié)構(gòu)及特征，而隨著羅哌卡因濃度的增加，細(xì)胞變圓，突起減少，凋亡壞死細(xì)胞數(shù)量增多（圖2）。

Figure 2.The effect of ropivacaine on the morphological changes of PC12 cells.The PC12 cells were treated with different concentrations of ropivacaine for 24 h，and the cell morphological changes were observed under optical microscope.The cells in control group were polygonal with protrusions，and those in ropivacaine group changed to be circular and their protusions were decreased.圖2 不同濃度羅哌卡因?qū)C12細(xì)胞形態(tài)的作用

2 羅哌卡因誘導(dǎo)PC12細(xì)胞線粒體功能障礙

免疫熒光染色結(jié)果顯示，與對照組比較，羅哌卡因組中代表ROS的綠色熒光強(qiáng)度隨藥物濃度增加而增加，同時紅色熒光標(biāo)記的線粒體與綠色熒光標(biāo)記的ROS 間的共定位顯著增多，且呈劑量依耐性，以2 mmol/L羅哌卡因組增加最顯著，見圖3。

Figure 3.The effect of ropivacaine on the production of mitochondrial reactive oxygen species（ROS）.The PC12 cells were treated with different concentrations of ropivacaine for 24 h，and the fluorescent probes H2DCFDA and MitoTracker Red CMXRos were used to label the ROS and mitochondria，respectively.Compared with control group，the cells treated with ropivacaine showed the increases in the green fluorescence intensity and the colocalization of ROS（green fluorescence）and mitochondria（red fluorescence）.圖3 不同濃度羅哌卡因?qū)C12細(xì)胞中線?；钚匝跎傻淖饔?/p>

此外，圖4 的結(jié)果顯示，與對照組比較，羅哌卡因組中代表JC-1聚合體的紅色熒光強(qiáng)度隨藥物濃度增加而減少，細(xì)胞呈現(xiàn)出高綠低紅的熒光信號，與高綠高紅的正常對照細(xì)胞差異顯著。

3 羅哌卡因促進(jìn)PC12細(xì)胞線粒體自噬

圖5A 中Western blot 的結(jié)果顯示，與對照組比較，羅哌卡因組PC12 細(xì)胞LC3-II/LC3-I 的比值增加，線粒體自噬標(biāo)志蛋白PINK1 和parkin 的表達(dá)隨藥物濃度增加而增加，自噬底物P62 的蛋白水平顯著下降（P＜0.01），且呈劑量依賴性。圖5B 中比較了對照組與羅哌卡因組中紅色熒光標(biāo)記的線粒體與綠色熒光標(biāo)記的LC3 間的共定位水平，結(jié)果顯示，隨著羅哌卡因濃度的升高，LC3 標(biāo)記的自噬體的數(shù)量顯著增加，呈點狀分布于細(xì)胞質(zhì)中；同時自噬體與Mito-Tracker 標(biāo)記的線粒體間的共定位也顯著增多，呈劑量依賴性，以2 mmol/L增加最顯著。

Figure 5.Ropivacaine induced mitophagy in PC12 cells.A：the expression levels of mitophagy-related proteins were detected by Western blot；B：the colocalization of mitochondria（red fluroresence）and LC3（green fluoresence）was detected by fluorescence microscopy.Compared with control group，the cells treated with ropivacaine showed the increase in the colocalization of mitochondria（red fluoresence）and LC3-labeled autophagosomes（green fluoresence）.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖5 羅哌卡因促進(jìn)PC12細(xì)胞線粒體自噬

4 羅哌卡因抑制STAT3的磷酸化

圖 6C、D 中 Western blot 的結(jié)果顯示，與對照組比較，羅哌卡因組中總STAT3 的蛋白表達(dá)未發(fā)生顯著變化，而p-STAT3 的蛋白水平隨羅哌卡因濃度的升高而逐漸下降，呈劑量依賴性，其中2 mmol/L 羅哌卡因組降低最顯著（P＜0.01）。同樣的，p-STAT3 的免疫熒光染色結(jié)果與上述Western blot 的結(jié)果保持一致，如圖6A、B 所示，與對照組比較，羅哌卡因組中代表p-STAT3 的綠色熒光強(qiáng)度隨藥物濃度的升高而下降，以2 mmol/L羅哌卡因組最顯著（P＜0.01）。

Figure 6.Ropivacaine inhibited the phosphorylation of STAT3 protein in PC12 cells.A：the protein level of p-STAT3 was detected by immunofluorescence；B：quantification of the fluorescence intensity in A；C：the protein levels of STAT3 and p-STAT3 were detected by Western blot；D：quantification of the gray values in C.Compared with control group，the cells treated with ropivacaine showed decreased p-STAT3 level（green fluoresence）in a dose-dependent manner.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group.圖6 羅哌卡因抑制PC12細(xì)胞中STAT3蛋白的磷酸化

討 論

探討局麻藥產(chǎn)生神經(jīng)毒性的作用機(jī)制對預(yù)防局麻藥引發(fā)的神經(jīng)損傷具有重要意義，本體外實驗著重探究了羅哌卡因?qū)Υ笫笫茹t細(xì)胞瘤PC12 細(xì)胞線粒體自噬以及STAT3 磷酸化的作用，結(jié)果表明羅哌卡因通過誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞線粒體功能障礙產(chǎn)生神經(jīng)毒性，同時羅哌卡因促進(jìn)了PC12 細(xì)胞線粒體自噬，包括增加LC3-II/LC3-I的比值，促進(jìn)線粒體自噬相關(guān)蛋白PINK1 和parkin 的表達(dá)，抑制自噬底物蛋白p62的表達(dá)。同樣的，羅哌卡因抑制了PC12 細(xì)胞STAT3的磷酸化，可能作為其發(fā)揮上述作用的潛在機(jī)制。

作為酰胺類局麻藥的代表，羅哌卡因因其具有良好的臨床療效而被廣泛地應(yīng)用周圍神經(jīng)阻滯，椎管內(nèi)麻醉以及疼痛治療［17］。然而在椎管內(nèi)麻醉中可能會產(chǎn)生短暫神經(jīng)綜合征和馬尾綜合征等毒性反應(yīng)，但具體機(jī)制的尚不清楚。近年來，大量的研究表明羅哌卡因誘導(dǎo)神經(jīng)毒性涉及多種病理生理過程，包括細(xì)胞鈣超載，細(xì)胞凋亡，氧化應(yīng)激以及細(xì)胞自噬［18-20］。Wen 等［4，21］的研究證實 T 型鈣通道及其調(diào)節(jié)蛋白的激活誘導(dǎo)細(xì)胞鈣超載作為羅哌卡因產(chǎn)生神經(jīng)毒性的重要環(huán)節(jié)，當(dāng)抑制上述蛋白的表達(dá)可以顯著減少神經(jīng)元損傷。除鈣超載外，Niu等［10］的研究顯示羅哌卡因可以誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞線粒體數(shù)量的減少以及氧化磷酸化功能障礙，進(jìn)一步通過內(nèi)源性凋亡途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡。我們的研究同樣證實了羅哌卡因可以誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞線粒體功能障礙包括增加線粒體活性氧的產(chǎn)生以及降低線粒體膜電位，作為其產(chǎn)生神經(jīng)毒性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。除上述因素外，Xiong 等［3］觀察到羅哌卡因具有促進(jìn)細(xì)胞自噬的作用，而當(dāng)抑制自噬時會進(jìn)一步加重羅哌卡因誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，這與我們的結(jié)果相吻合。

自噬是細(xì)胞降解多余蛋白質(zhì)及損傷細(xì)胞器的生理過程，而線粒體自噬作為細(xì)胞自噬的特殊類型，其目的在于去除功能受損及衰老的線粒體，從而維持線粒體質(zhì)量與功能的穩(wěn)定［22］。線粒體自噬是生命體進(jìn)化出的有效清除機(jī)制，適度的線粒體自噬可以幫助細(xì)胞清除受損的線粒體，以保證能量的供應(yīng)，而當(dāng)線粒體自噬過度激活時，會進(jìn)一步加重細(xì)胞損傷，包括誘導(dǎo)線粒體活性氧的生成以及降低線粒體膜電位，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［23-24］。線粒體自噬受多種信號分子的調(diào)控［25］，這其中也包括 STAT3。Yang 等［26］的研究證實激活STAT3通路可以抑制缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，減少線粒體活性氧的產(chǎn)生，從而抑制過度的細(xì)胞自噬。作為IL-6 激活基因的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，STAT3 具有廣泛的生物學(xué)功能，有研究指出STAT3 與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育與分化密切相關(guān)［27］，同時其在神經(jīng)元損傷的過程中也發(fā)揮重要作用，磷酸化的 STAT3 能夠顯著保護(hù)受損的神經(jīng)元，Chen 等［28］的研究顯示當(dāng)使用IL-6 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑抑制STAT3 的磷酸化過程可以導(dǎo)致腦卒中小鼠缺血半暗帶中受損神經(jīng)元的增多，進(jìn)一步加重神經(jīng)元受損。然而在羅哌卡因誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的研究中，目前尚無關(guān)于STAT3 的報道。故本研究探討了羅哌卡因?qū)C12細(xì)胞線粒體自噬和STAT3 信號通路的作用，結(jié)果顯示羅哌卡因在激活細(xì)胞線粒體自噬同時抑制了細(xì)胞中STAT3 的磷酸化，于是我們提出羅哌卡因可能是通過抑制STAT3 磷酸化誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞線粒體自噬的假說。