大鼠來(lái)源骨髓MSCs聯(lián)合嗅鞘細(xì)胞在大鼠脊髓損傷模型中的有效性分析

陳傳杰，朱立娟，陳佳子，于洋

（承德市中心醫(yī)院 骨科，河北 承德 067000）

0 引言

脊髓是人以及脊椎動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)以及運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)必不可少的一部分，一旦發(fā)生損傷預(yù)后較差，損傷面以下的肢體，其運(yùn)動(dòng)與感覺能力都將很難恢復(fù)[1]?，F(xiàn)階段關(guān)于脊髓損傷的治療手段中，細(xì)胞移植是當(dāng)下的研究熱點(diǎn)之一。研究人員逐漸將視線放在嗅鞘細(xì)胞(OECs)與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）上。為探究在脊髓損傷中應(yīng)用鼠來(lái)源骨髓MSCs聯(lián)合嗅鞘細(xì)胞治療方案的療效，本研究構(gòu)建脊髓損傷大鼠模型，并將聯(lián)合培養(yǎng)的兩種細(xì)胞注射入大鼠體內(nèi)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇本研究中心飼養(yǎng)的8周大SPF級(jí)SD雌性大鼠30只，體重范圍在200～300g之間。飼養(yǎng)在IVC獨(dú)立送風(fēng)系統(tǒng)中，光照與黑暗按照12h的規(guī)律交替，相對(duì)濕度45%左右，室溫21℃～24℃。本研究得到醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 方法

（1）大鼠脊髓損傷模型的構(gòu)建：30只8周大SPF級(jí)SD雌性大鼠，采用75%乙醇對(duì)手術(shù)區(qū)域的皮膚進(jìn)行消毒處理，用3%水合氯醛對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉后，將大鼠以俯臥位固定在實(shí)驗(yàn)室自制的恒溫固定板上。備皮后用碘伏對(duì)大鼠背部進(jìn)行消毒處理。用剪刀在背部的正中位置做一個(gè)寬約4cm的縱行切口，切開皮膚、皮下肌肉與脊柱旁的肌肉，將第九與第十胸椎椎板間的黃韌帶剪開，剔除第九胸椎的椎體與椎板，使得對(duì)應(yīng)平面的脊髓暴露在視野中，使用特制的鑷子把脊髓鉗夾15s后松開鑷子，用滅菌生理鹽水對(duì)手術(shù)區(qū)域的血液進(jìn)行清洗后，縫合傷口后局部涂抹抗生素防止感染[2]。

（2）提取大鼠骨髓MSCs：選擇健康的雄性8周SD大鼠，頸椎脫臼處死，用75%酒精消毒過(guò)后轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)中，分離大鼠的股骨，用PBS沖出股骨中的骨髓。離心后取沉淀物進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)條件37℃，5%CO2，顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞增殖到70%～80%時(shí)即進(jìn)行傳代。加入PBS沖洗干凈培養(yǎng)液后，加入適量胰酶消化，當(dāng)細(xì)胞恢復(fù)圓球形態(tài)后加入新鮮培養(yǎng)液，終止消化。低速離心后取沉淀，加入新鮮培養(yǎng)液，吹打混勻后分入不同的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)[3]。

（3）提取嗅鞘細(xì)胞：上一步中處死的大鼠，從其枕骨大孔處剖開露骨，將大腦與鼻骨去除后，暴露鼻腔，取出鼻中隔，保留近端三分之一，在解剖顯微鏡下將上皮組織剝離并清洗后分離原代細(xì)胞，經(jīng)鑒定后為嗅鞘細(xì)胞的繼續(xù)培養(yǎng)。

（4）將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與嗅鞘細(xì)胞按照1∶1的比例混合培養(yǎng)，一周后取培養(yǎng)液，用ELISA法對(duì)其中的神經(jīng)生長(zhǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，所用試劑盒來(lái)自上?？道噬锟萍加邢薰?。

（5）模型制作成功后，立即在損傷處注射約5×104個(gè)細(xì)胞進(jìn)行治療，對(duì)照組注射等量的PBS，模型組注射單獨(dú)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，研究組注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與嗅鞘細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)的混合細(xì)胞。

（6）在術(shù)前與手術(shù)一周后應(yīng)用BBB評(píng)分系統(tǒng)對(duì)三組大鼠的運(yùn)動(dòng)能力進(jìn)行評(píng)估。范圍0～21分，分?jǐn)?shù)越高表示大鼠的運(yùn)動(dòng)能力更強(qiáng)[4]。

1.3 觀察指標(biāo)

分光光度計(jì)在450nm出測(cè)得吸光度值，借助標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算出培養(yǎng)液中的神經(jīng)生長(zhǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

收集得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析時(shí)使用SPSS 18.0軟件，用χ2（%）檢驗(yàn)表示其中計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，用t檢測(cè)（）檢驗(yàn)表示計(jì)量統(tǒng)計(jì)，若P＜0.05表明有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異，數(shù)據(jù)可信。

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)方法的神經(jīng)生長(zhǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3表達(dá)水平的對(duì)比

應(yīng)用不同的培養(yǎng)方法，培養(yǎng)液中神經(jīng)生長(zhǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3表達(dá)水平的對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但是聯(lián)合培養(yǎng)的培養(yǎng)液中這兩種物質(zhì)濃度比較居中，適合向大鼠模型體內(nèi)注射，見表1。

表1 不同培養(yǎng)方法的神經(jīng)生長(zhǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3表達(dá)水平的對(duì)比（）

表1 不同培養(yǎng)方法的神經(jīng)生長(zhǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3表達(dá)水平的對(duì)比（）

2.2 三組大鼠模型BBB運(yùn)動(dòng)能力評(píng)分的對(duì)比

手術(shù)前，三組大鼠的運(yùn)動(dòng)能力，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），手術(shù)后，研究組大鼠的運(yùn)動(dòng)能力顯著高于其他兩組大鼠，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 三組大鼠模型BBB運(yùn)動(dòng)能力評(píng)分的對(duì)比（）

表2 三組大鼠模型BBB運(yùn)動(dòng)能力評(píng)分的對(duì)比（）

3 討論

脊髓作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，尤其是對(duì)成年的哺乳動(dòng)物而言，受傷之后的自我恢復(fù)能力很差，脊髓受到損傷以后，其軸突的再生被抑制，因此神經(jīng)功能很難得到恢復(fù)[5]。急性脊髓損傷臨床表現(xiàn)為肢體感覺障礙和運(yùn)動(dòng)功能受損。急性脊髓損傷致殘率和致死率均較高，給患者、家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。目前對(duì)于脊髓損傷，尚無(wú)統(tǒng)一治療的金標(biāo)準(zhǔn)。

嗅鞘細(xì)胞是目前治療脊髓損傷的熱門研究方向，嗅鞘細(xì)胞來(lái)源于自體組織，沒有免疫排斥反應(yīng)，而且是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能夠穿越中樞與周圍神經(jīng)邊界的膠質(zhì)細(xì)胞。嗅鞘細(xì)胞可以分泌大量不同種類的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和支持因子，為神經(jīng)細(xì)胞和軸突再生、重建連接創(chuàng)造良好條件。而骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在脊髓損傷中應(yīng)用目前也是諸多學(xué)者的研究方向之一，MSCs在適合環(huán)境下可以分化為神經(jīng)細(xì)胞，與鄰近神經(jīng)組織相互作用，產(chǎn)生某些細(xì)胞因子（腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等），提高神經(jīng)元存活率、介導(dǎo)軸突生長(zhǎng)，也可以分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞，有利于受損區(qū)神經(jīng)、血管組織修復(fù)。近些年，隨著對(duì)脊髓損傷的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的存在能夠促使受損軸突的再生[6]。故本研究通過(guò)聯(lián)合培養(yǎng)鼠來(lái)源骨髓MSCs和嗅鞘細(xì)胞，將兩種細(xì)胞應(yīng)用于脊髓損傷大鼠。在對(duì)大鼠模型進(jìn)行手術(shù)前，本研究分別對(duì)三種細(xì)胞，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，嗅鞘細(xì)胞，以及兩者的聯(lián)合培養(yǎng)，對(duì)其培養(yǎng)液中神經(jīng)生長(zhǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，以確定向模型體內(nèi)注射哪種類型的細(xì)胞。結(jié)果說(shuō)明，三種類型的細(xì)胞培養(yǎng)液中，神經(jīng)生長(zhǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但是聯(lián)合培養(yǎng)的培養(yǎng)液中這兩種物質(zhì)濃度比較居中，適合向大鼠模型體內(nèi)注射。

在進(jìn)行手術(shù)前，對(duì)三組大鼠模型的運(yùn)動(dòng)能力應(yīng)用BBB評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，三組大鼠的運(yùn)動(dòng)能力，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），手術(shù)后，研究組大鼠的運(yùn)動(dòng)能力顯著高于其他兩組大鼠，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），證明在本研究中采用聯(lián)合培養(yǎng)的方法對(duì)脊髓損傷大鼠模型的運(yùn)動(dòng)能力具有一定的恢復(fù)作用。

綜上所述，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與嗅鞘細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)在大鼠脊髓損傷動(dòng)物模型中取得了一定的療效，為進(jìn)一步在脊髓損傷修復(fù)的基礎(chǔ)研究以及將來(lái)的臨床實(shí)驗(yàn)提供了一定依據(jù)。