不同葉稻瘟抗性水稻品種對根際真菌的影響

馬繼瓊 孫一丁 楊奕 許明輝

摘要：為了解水稻稻瘟病抗性與土壤根際真菌之間的關(guān)系，利用ITS高通量測序技術(shù)對7個不同抗稻瘟病水稻品種土壤根際真菌ITS1序列進行分析。結(jié)果表明，共檢測到根際真菌ITS1有效片段486 250個，以97%的相似度聚為1 178分類操作單位（operational taxonomic unit，簡稱OTU）;物種查詢顯示，歸為12個門（含1個未分類的真菌群），35個綱（含8個未分類的菌群），82個目（含12個未分類的菌群），146個科（含34個未分類的菌群），248個屬（含63個分類地位未定或未分類的菌群）和362個種（含63個未分類種）。7個土樣真菌門類相似，子囊菌門（Ascomycota）是最大的優(yōu)勢菌門，相對豐度為67.04%?？购透械疚敛∑贩N群土樣在稻綠核菌屬（Ustilaginoidea）和稻綠核菌（Ustilaginoidea sp.）上存在顯著性差異（P<0.05），其相對豐度平均數(shù)分別為5.09%、7.31%，即在稻瘟病病菌侵染條件下抗稻瘟病品種對稻曲病病原菌稻綠核菌具有抑制作用。結(jié)果可為探尋水稻抗稻瘟病機制提供土壤微生物的線索。

關(guān)鍵詞：稻瘟病;根際真菌;ITS1序列;測序

中圖分類號：S182;S435.111.4+1 文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）12-0075-05

收稿日期：2020-09-23

基金項目：國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金（編號：31860369）。

作者簡介：馬繼瓊（1969—），女，云南永平人，碩士，副研究員，主要從事作物種質(zhì)資源研究，E-mail：mjq_503@163.com;共同第一作者：孫一?。?979—），男，云南個舊人，博士，副研究員，主要從事作物種質(zhì)資源研究，E-mai：3182335606@qq.com。

通信作者：許明輝，博士，研究員，主要從事種質(zhì)資源與遺傳育種研究。E-mail：ynxuminghui@163.com。

土壤微生物是土壤中最活躍的部分，在促進土壤物質(zhì)、能量轉(zhuǎn)化和地球生物化學(xué)循環(huán)方面發(fā)揮著重要作用[1]。稻田是世界上最大的人工濕地，大量研究表明，稻田土壤微生物的多樣性受到土質(zhì)[2]、耕作方式[3]、施肥[4-7]、農(nóng)藥[8-9]等環(huán)境因素的顯著影響，作物不同的基因型[10-13]甚至同一基因型不同的發(fā)育階段均會影響土壤微生物的多樣性[14]。在稻田土壤生態(tài)系統(tǒng)中，水稻根系分泌物是影響根際微生物種類及豐度的重要因素。水稻根系分泌物包括有機酸、維生素、酶、植物生長調(diào)節(jié)劑和氨基酸，為植物根際微生物的生長和繁殖提供了良好的生長環(huán)境和充足的養(yǎng)分，分泌物組成或某些成分數(shù)量的變化可能會改變根際微生物的種類和數(shù)量[11-12]。隨著微生物的生長，根際微生物又會對水稻的磷和氮利用效率、化感作用和稻米品質(zhì)產(chǎn)生影響[10，15]。真菌是土壤微生物的重要組成部分，參與植物殘體的分解，推動土壤養(yǎng)分的循環(huán)[16]，對環(huán)境污染物有指示作用[17]，同時也受到植物的影響[18]。因此，植物土壤根際真菌的多樣性是研究植物與土壤微生物之間關(guān)系的重要內(nèi)容之一。

微生物多樣性的研究方法可大致分為2類：一種是傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離方法，其主要通過不同的培養(yǎng)基來分離微生物。另一種是分子鑒定方法，利用磷脂脂肪酸、RNA或DNA等指示劑分子的特征來分析微生物的生態(tài)多樣性[19]。目前環(huán)境中能培養(yǎng)的微生物僅占總微生物的1%～10%[20-21]，傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法僅反映在此條件下存活的這部分微生物的具體信息，因此傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法用于反映土壤微生物的多樣性具有一定的局限。分子鑒定方法克服了傳統(tǒng)分離方法的局限性，在分子水平上揭示了土壤微生物種類和遺傳多樣性。 ITS基因存在于所有真菌的基因組中，分布于18S、5.8S、80S間，包含ITS1和ITS2區(qū)，中度保守，已被廣泛應(yīng)用于土壤微生物的遺傳多樣性分析[22-25]。

稻瘟病由稻瘟病原菌引起，在水稻全生育期中均可發(fā)病，該病遍布于全世界稻區(qū)，是稻作生產(chǎn)中最具破壞性的病害之一。在稻田生態(tài)系統(tǒng)中，環(huán)境條件的變化可能會影響微生物群落的多樣性，微生物群落的生長也會在一定程度上改變環(huán)境并影響水稻。水稻對葉稻瘟的抗性是包括葉面附生微生物在內(nèi)的許多因素相互作用的結(jié)果[26]。但水稻抗病性與土壤微生物之間的關(guān)系鮮有報道。分析不同抗性水稻品種根際微生物群落的結(jié)構(gòu)和豐度，可能會發(fā)現(xiàn)一些抗性機制的線索。本研究利用ITS高通量測序技術(shù)分析7種不同抗稻瘟病水稻品種根際土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)和豐度。

1 材料與方法

1.1 水稻品種和稻瘟病的自然誘發(fā)

田間試驗于2019年4—10月在云南省昆明市宜良縣進行，試驗田為肥力均勻的水田，前茬作物為大白菜。根據(jù)多年的鑒定，選擇7個對葉瘟具有不同抗性的水稻品種（表1）在同一田塊種植，以確保每個品種的試驗條件相同。試驗小區(qū)面積為20 m2（4 m×5 m），每個小區(qū)種植1個品種。通過重施氮肥（525 kg/hm2 尿素）、密集種植行距（20 cm×10 cm），不使用任何殺菌劑，并在小區(qū)四周種植易感品種蒙古稻進行葉瘟的自然誘發(fā)。到孕穗期葉瘟病癥充分顯現(xiàn)后，按標(biāo)準(zhǔn)進行調(diào)查分級（GB/T 15790—2009稻瘟病測報調(diào)查規(guī)范）品種抗性劃分標(biāo)準(zhǔn)）。

1.2 土壤樣品采集

在水稻種植之前，從試驗田的5個點（梅花狀）采集混合土壤樣品，并在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與測試技術(shù)研究所對土壤的基本特性進行測試。土壤較為肥沃，基本特征如下：pH值為7.35，有機質(zhì)含量為23.31 g/kg，堿性氮含量為85.31 mg/kg，速效磷含量為89.13 mg/kg，速效鉀含量為46.21 mg/kg。

水稻移栽后一直在土壤淹水條件下種植，為便于取土壤樣品，在水稻孕穗期（8月12日）采集土壤樣品時放干水。在每個品種試驗小區(qū)中，帶土取5個水稻植株，用刀削去四周土壤，保留植株根系周圍5 cm土壤，在離表層約10 cm處取土樣，將5個水稻植株土樣均勻混合。后將樣品置入液氮中保存，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行土壤DNA提取，并進行測序和數(shù)據(jù)分析。

1.3 DNA提取和PCR擴增

使用E.Z.N.A. soil DNA Kit （Omega Bio-tek，Norcross，GA，美國） 土壤DNA提取試劑盒，按照說明書對7個土壤樣品微生物群落基因組DNA進行提取。在1%瓊脂糖凝膠上檢查DNA質(zhì)量，并用Nano Drop 2000紫外可見分光光度計測定DNA的濃度和純度。使用引物ITS1-F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2-R（5′-TGCGTTCTTCATCGATGC-3′）[27]在ABI Gene Amp9700 PCR儀上擴增真菌rDNA 的ITS1序列。具體擴增程序如下：95 ℃變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 45 s，擴增程序包括34個循環(huán);最后于72 ℃延伸10 min，并于4 ℃保存。 PCR混合物包含4 μL 5×Trans Start Fast Pfu緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL正向引物（5 μmol/L），0.8 μL反向引物（5 μmol/L），0.4 μL Trans Start Fast Pfu DNA聚合酶，模板1 μL DNA（10 ng/μL），最后添加ddH2O至總體積40 μL。該反應(yīng)體系重復(fù)3次。

1.4 Illumina Miseq測序

將來自相同樣本的PCR產(chǎn)物混合，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后純化回收?；厥债a(chǎn)物經(jīng)Quantus Fluorometer （Promega，美國） 定量檢測合格后，使用NEXTFLEXRapid DNA-Seq Kit進行建庫：（1）接頭鏈接;（2）利用磁珠吸附篩選，去除接頭自連片段;（3）對文庫模板利用PCR擴增進行富集;（4）利用磁珠進行PCR產(chǎn)物回收，得到文庫。然后在Miseq PE300（Illumina，美國）平臺進行測序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.5 測序數(shù)據(jù)的處理

將原始的ITS1測序讀段通過Trimmomatic進行質(zhì)量過濾并通過FLASH合并，并遵循以下標(biāo)準(zhǔn)：（1）在50 bp滑動窗口中，任何平均質(zhì)量得分小于20的位點均截短了300 bp讀段，并且短于50 bp截短的讀段將被丟棄，包含歧義字符的讀段也將被丟棄;（2）根據(jù)重疊序列，針對長于10 bp的重疊序列進行組裝，無法組裝的讀物將被丟棄;（3）根據(jù)條形碼和引物區(qū)分樣品，并調(diào)節(jié)序列方向，精確的條形碼匹配，引物匹配中的2個核苷酸錯配，使用UPARSE（7.1版，http：//drive5.com/uparse/）對具有97%相似性截止值的操作分類單位（OTU）進行聚類，鑒定并去除了嵌合序列。利用RDP分類器（http：//rdp.cme.msu.edu/）在數(shù)據(jù)庫UNITE（version 8.0）中依次對單個OTU代表序列進行查詢分類，置信度閾值為0.7。使用DPS軟件進行顯著性測試。

2 結(jié)果與分析

2.1 7個水稻品種葉瘟抗性

孕穗期對7個水稻品種進行葉瘟抗性調(diào)查，由表1可知，誘發(fā)品種蒙古稻表現(xiàn)高感（HS），說明稻瘟病誘發(fā)成功，其他6個品種具有高抗（HR）到高感（HS）不同的抗性，抗性鑒定結(jié)果與以往結(jié)果一致，說明這幾個品種抗性穩(wěn)定。根據(jù)葉瘟抗性可將7個品種分為抗感2群，其中岫粳12號（HR）、濟稻8號（HR）、楚粳42號（MR）為抗性群，松遼5號（MS）、藤系144號（HS）、蒙古稻（HS）、南29（HS）為易感群。

2.2 7個土壤樣品的多樣性指數(shù)

7個樣品測序覆蓋度均超過 99.95%，表明測序深度足夠，滿足后續(xù)分析。通過過濾和連接等步驟，從7個土壤樣品中獲得了486 250（個）有效片段，以97%的相似度聚為1 178分類操作單位OTU，平均長度為219 bp。其中有很大一部分OUT豐度小，僅在部分樣品中出現(xiàn)，每個樣本只能檢測到其中一部分OUT，范圍為312～567個（表1：Sob指數(shù)）。樣品間Shannon指數(shù)數(shù)值相似，Simpson（1-D）指數(shù)非常低（表1），表明樣品間多樣性并不存在較大的差異，根際真菌群落是多樣的。

物種注釋顯示，在7個土壤樣品中檢測到12個門（包含1個未分類的真菌群），35個綱（包含8個未分類的菌群），82個目（包含12個未分類的菌群），146個科（包含34個未分類的菌群），248個屬（包含63個分類地位未定或未分類的菌群）和362個種（包含63個分類地位種）。可見，本試驗中稻田土壤真菌多樣性較為豐富。

2.3 真菌群落的結(jié)構(gòu)和豐度差異

門水平上，各樣品真菌群落結(jié)構(gòu)組成較相似（圖1）。子囊菌門（Ascomycota）是最大的優(yōu)勢菌門，平均相對豐度為67.04%，其他門相對豐度依次為羅茲菌門（Rozellomycota） 8.78%、被孢霉門（Mortierellomycota）5.41%、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）1.45%、梳霉門（Kickxellomycota）1.16%、油壺菌門（Olpidiomycota）0.96%、壺菌門（Chytridiomycota）0.64%、球囊菌門（Glomeromycota）0.52%、捕蟲霉門（Zoopagomycota）0.09%、芽枝霉門（Blastocladiomycota）0.07%、單毛壺菌門 （Monoblepharomycota）0.01%。其中，球囊菌門、芽枝霉門、單毛壺菌門并未在所有樣品中檢測到，僅在3～5個樣品中出現(xiàn)。未分類的真菌（p__unclassified_k__Fungi）豐度為13.88%，占比較大。

綱水平上，其中相對豐度大于1%的有糞殼菌綱（Sordariomycetes）56.21%、 未分類的真菌菌群（unclassified_k__Fungi）13.86%、未分類的隱真菌門菌群（unclassified_p__Rozellomycota）7.51%、被孢霉綱（Mortierellomycetes）5.39%、散囊菌綱（Eurotiomycetes） 3.97%、 座囊菌綱（Dothideomycetes）2.71%、 錘舌菌綱 （Leotiomycetes） 2.16%、分類地位未定羅茲菌群（Rozellomycotina_cls_Incertae_sedis）1.27%、Harpellomycetes 1.16%、未分類的子囊菌群體（unclassified_p__Ascomycota）1.04%;在相對豐度小于1%的綱或菌群中有17個相對豐度極低，范圍在0.000 775%～0.500 000%之間，僅在部分樣品中（1～6個）出現(xiàn)。經(jīng)平均數(shù)顯著性測驗，抗感稻瘟病品種群間在門、綱、目、科水平上相對豐度均沒有顯著性差異。

屬水平上，相對豐度大于1%的共有12個屬（其中含有3個未分類菌群）（表2）。在相對豐度小于1%的236個屬（含分類地位未定或未分類菌群）中有185個相對豐度極低，僅在部分樣品中（1～6個）出現(xiàn)。經(jīng)顯著性測驗，抗稻瘟病和感稻瘟病品種群間在稻綠核菌屬（Ustilaginoidea）上存在顯著性差異（P<0.05），其相對豐度平均數(shù)分別為5.09%、7.31%。進一步分析表明，7個樣品檢測到362個種（包含95個分類地位未定或未分類菌種），抗稻瘟病和感稻瘟病品種群間僅在稻綠核菌上存在顯著性差異（圖2）（P<0.05）。

3 討論與結(jié)論

已有的研究表明，我國不同生態(tài)區(qū)水稻土壤真菌不僅在門類上存在差異，各菌門比例（豐度）上也存在差異，土壤功能肯定也存在差異。重慶[22]、湖南[23]、江蘇[24]等地稻田土壤真菌門類相對簡單，僅含有3～5門的菌群;子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、接合菌門（Zygomycota）是共有的，其中子囊菌門是最大的菌門，一般占比在42.59%以上;而烏魯木齊市水稻根際土壤共檢測出11 個門的真菌，種類較為豐富，子囊菌門也是最大的菌門，但卻沒有上述3個地區(qū)中共有的接合菌門[25]。本研究田塊7個土壤樣品檢測到11門和1個未分類的真菌群，門類相對上述地區(qū)較為豐富，子囊菌門也是優(yōu)勢門，其中隱真菌門（Rozellomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）、梳霉門（Kickxellomycota）、油壺菌門（Olpidiomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）、捕蟲霉門（Zoopagomycota）、芽枝霉門（Blastocladiomycota）、單毛壺菌門（Monoblepharomycota）是江蘇、湖南、重慶等地水稻土沒有的，而梳霉門、捕蟲霉門、芽枝霉門是烏魯木齊市也沒有的，但該田塊卻沒檢測到接合菌門菌群，也未檢測到烏魯木齊市有的輪形動物門（Rotifera）。造成這種水稻土壤菌門差異的原因有很多，其中生態(tài)區(qū)不同和土質(zhì)不同可能是最大的影響因素，而輪作、施肥等措施一般僅改變菌門的豐度比例[22-25]。值得一提的是，真菌檢測方法可能是造成這種差異的原因之一;上述研究均基于ITS1的研究，檢測方法基本相同，但分類查詢的真菌ITS數(shù)據(jù)庫版本不同也可能造成檢測結(jié)果的差異。本研究用真菌ITS1序列進行真菌種類和豐度分析，可將大多數(shù)真菌進行分類，但在各水平上仍有一定比例未分類的菌群，說明本試驗田塊真菌種類較為豐富，可能存在一些未知的菌群，但也反映出ITS1序列的局限。本研究中，稻綠核菌屬只檢測到一個OUT，且比例高達真菌總量的6.36%，查詢結(jié)果為Ustilaginoidea sp.，序列與稻曲病病原菌稻綠核菌（U. virens）和稻白色綠核菌（U. albicans）相應(yīng)序列均100%相同，而這是2個不同的種[28]，無法將2個種分開?？梢姡枰渌蛄腥鏘TS2加入或其他方法補充才能進行更為精確的分類研究。

該稻田多年以來均是由筆者進行水稻資源鑒定，每年稻曲病均有不同程度的發(fā)生，稻曲病病菌落入土中越冬，所以土壤中檢測到稻曲病病菌不足為奇，證明稻曲病病原菌主要來源于土壤中。有趣的是抗感稻瘟病品種群之間存在顯著性差異，抗稻瘟病品種具有抑制稻綠核菌的作用。參試品種均種植在同一田地上，所有環(huán)境條件均相同，只是水稻基因型不同，即對葉瘟的抗性不同。所以筆者推測水稻品種對稻瘟病和稻曲病存在某些共同的抗菌機制，品種在受到稻瘟病病菌侵襲的情況下，其根系可能分泌某些特殊成分，選擇性地抑制了稻曲病菌，并改變了它們的豐度。作為回報，稻曲病病菌可能對水稻品種對葉瘟的抗性具有促進或抑制作用。這是一個值得進一步研究的課題。試驗中未能檢測到主要真菌性病害的紋枯病菌（Thanatephorus cucumeris）、稻瘟病菌（Pyricutaria orazae）、惡苗病菌（Fusarium moniliforme），說明這3種主要病害的病原物不存在土壤來源。

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