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    基因測序技術研究進展

    2019-04-16 04:09:15王錦秀
    科海故事博覽·下旬刊 2019年6期
    關鍵詞:高通量通量基因組

    基因組序列是開展遺傳研究重要的信息基礎,自人類基因組計劃完成以來,基因組學進入功能研究時代?;蚪M研究技術引入水產動物的研究后,推進了水產動物基因組的結構和功能研究,解析和詮釋了水產動物生物學現(xiàn)象的遺傳基礎和分子機制,在遺傳育種,疾病防治和醫(yī)藥等方面的研究應用也取得較大進展。本文介紹了第一、二和三代測序技術的整個發(fā)展歷程以及各自的優(yōu)缺點和主要測序技術或平臺。

    第一代測序技術

    1975年,Sanger等提出雙脫氧鏈合成終止法測序技術[1],測定了第一個基因組序列—噬菌體X174 [2],人類首次實現(xiàn)了對生物遺傳信息的解碼,開啟了全基因組測序時代。1977年,A.M.Maxam和W.Gilbert建立了DNA片段序列的測定方法,即 Maxam-Gilbert 化學降解法[3],該測序法對未經(jīng)克隆的 DNA 片段可以直接測序。但是化學降解法過程操作繁瑣,對有毒化學品和放射性同位素接觸較多,逐漸被雙脫氧鏈終止法替代。20世紀80年代,在sanger法理論基礎上,出現(xiàn)了熒光自動測序技術,1986年,美國應用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems Inc,ABI)推出的第一代商用ABI 370A測序儀可在雙脫氧核苷酸上直接標記不同顏色熒光基團;1998年,ABI采用其開發(fā)的毛細管凝膠電泳技術,推出的ABI Prism3700毛細管測序儀可同時進行96個并行測序反應,真正實現(xiàn)了測序規(guī)?;痆4-5]。

    以上測序技術均被稱為第一代測序技術,其中雙氧鏈終止法的應用最為廣泛,因此第一代測序也常認為是sanger測序。一代測序技術測序讀長長,準確率高,主要用于PCR產物測序、小片段序列分析和基因分型等研究,對生物學研究具有重要意義,至今在世界范圍內仍在使用。但是,一代測序的通量低,成本高,限制了其大規(guī)模高通量的應用。

    第二代測序技術

    盡管第一代DNA測序技術以其可達 1000 bp 的測序讀長、99.999% 的高準確性幫助人們完成了大量的測序工作,但其測試速度慢、成本高、通量低等方面的不足,也致使其不能得到大眾化的應用。進入21世紀,隨著科學技術的進步以及科研人員對測序技術的努力開發(fā),以Roche公司的454技術[6]、illumina公司的Solexa[7],Hiseq技術和ABI公司的SOLiD技術[8]為標志的第二代測序技術誕生,又稱下一代測序技術(next generation sequencing,NGS)。

    2005年,Roche 公司的454 技術是第一個商業(yè)化的二代測序平臺,初期被很多研究者使用, 454技術優(yōu)勢測序讀長較長,平均可達400bp[9],缺點是無法準確測量類似于PolyA的情況時,測序反應會一次加入多個T,可能導致結果不準確。也正是由于這一原因,454技術會在測序過程中引入插入和缺失的測序錯誤。

    Solexa 分析儀通常也被稱為 Illumina 測序儀,所使用的方法是克隆單分子陣列技術。Illumina的測序技術每次只添加一個dNTP的特點能夠很好的地解決同聚物長度的準確測量問題,它的主要測序錯誤來源是堿基的替換。而讀長短(200bp-500bp)也讓其應用有所局限。

    HeliScope測序儀在第二代的基礎上引入了單分子測序[10]的概念,被稱為2.5代,測序前不進行PCR 擴增,克服了第二代測序技術中需要用PCR擴增來增強瑩光信號的技術難題,不進行DNA 擴增避免了擴增時引入的錯誤和偏好性,但是讀長較短(25 ~ 30 bp),導致拼接困難、質量低,儀器成本高,并未大規(guī)模應用。

    除此之外,Ion Torrent 測序儀是第一個不需要光學系統(tǒng)的商業(yè)測序儀,是非常適合擴增子測序的革命性技術。與其他技術相比,Ion Torrent 測序不需要昂貴的物理成像設備,實現(xiàn)了高密度高通量陣列的制作[11],它測序時間短,速度快,儀器設備便宜,但芯片的通量并不高,非常適合小基因組和外顯子驗證的測序。

    在過去的十多年里,二代測序技術迅猛發(fā)展,憑借其低成本、高通量的優(yōu)勢在很多領域得到了應用,在很多探索性研究中,如對新物種基因組的de novo 測序、目標區(qū)域或全基因組重測序、轉錄組測序、宏基因組測序、表觀修飾測序等領域都取得了突破性的進展。第二代測序技術雖然已經(jīng)得到了廣泛的應用,在各技術方面趨于成熟,但是依然依賴于模板擴增、熒光分析、序列讀長限制等缺點,以及不可避免的系統(tǒng)誤差,這些缺點都在一定程度上的制約了第二代測序技術的應用和發(fā)展。

    第三代測序技術

    測序技術經(jīng)過第一代、第二代的發(fā)展,讀長從一代測序的近1000bp,降到了二代測序的幾百bp,通量和速度大幅提升,那么第三代測序的發(fā)展思路在于保持二代測序的速度和通量優(yōu)勢同時,彌補其讀長較短的劣勢。三代測序與前兩代相比,最大的特點就是單分子測序,測序過程無需進行PCR擴增,實現(xiàn)了對每一條DNA分子的單獨測序。第三代測序技術也叫從頭測序技術,即單分子實時DNA測序。

    第三代測序技術主要包括第三代測序技術主要包括Helicos公司的真正單分子測序技術、Oxford Nanoporetech公司的單分子納米孔測序技術、Pacific Biosciences (PacBio)公司的單分子實時測序技術等。Helicos 公司的Heliscope是第一個商業(yè)化的單分子測序平臺,該技術基于邊合成邊測序的思想,將DNA隨機打斷成小片段分別進行dNTP熒光標記,經(jīng)過不斷地重復合成、洗脫、成像、淬滅過程完成測序。但是其讀長短,存在很多技術限制,并未得到廣泛應用。

    ONT(Oxford Nanopore Technologies)納米孔單分子測序技術優(yōu)點是讀長很長,大約在幾十kb,甚至100 kb;通量很高;數(shù)據(jù)可實時讀取;樣品制備簡單又便宜;可直接測序RNA。但錯誤率目前相比較高,且是隨機錯誤,而不是聚集在讀取的兩端。

    下一代測序技術已成為基因組學研究中應用最廣泛的測序技術,但在處理高GC含量基因組時也存在固有缺陷。最近,由美國Pacific Bioscience開發(fā)的單分子實時測序 (inglemolecule Real-time,SMRT)作為第三代測序策略被引入,以彌補這一不足。雖然現(xiàn)在Oxford Nanopore 測序儀也逐漸投入了市場,但是由于它的推廣及使用都不如PacBio,因此,目前三代的測序主流還是以PacBio為主[12]。

    二代和三代測序各有所長,二代測序讀長短、通量高、準確度和性價比高,而讀長長、通量低、錯誤率高、單堿基成本高是三代測序的特點。利用二代測序高通量和準確度高的短讀長片段對三代測序的長讀長片段進行修正,以降低三代測序的費用和錯誤率。三代測序技術在基因組測序(多倍體或大量重復序列),甲基化研究,突變鑒定以及RNA直接測序等領域有顯著優(yōu)勢。除此之外,三代測序的缺點也存在缺陷:單讀長的錯誤率偏高,需重復測序以糾錯(增加測序成本);依賴DNA聚合酶的活性;成本較高(二代Illumina的測序成本是每100萬個堿基0.05-0.15美元,三代測序成本是每100萬個堿基0.33-1.00美元)。生信分析軟件不夠豐富、數(shù)據(jù)積累少等。

    參考文獻:

    [1] SANGER F ,NICKLEN S ,COULSON A R .DNA sequencing with chain-terminating inhibitors [J].Proceedings of the N ational A cademy o f Sciences,1977,74(12):5463-5467 .

    [2] Sedat J,Ziff E,Galibert F. Direct determination of DNA nucleotide sequences. Structure of large specific fragments of bacteriophage φX174 DNA[J]. Journal of Molecular Biology,1976,107(4):391-416.

    [3] Maxam A M,Gilbert W. A new method for sequencing DNA[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1977,74(2):560-564.

    [4] Prober JM, Trainor GL, Dam RJ, et al. A system for rapid DNA sequencing with fluorescent chain-terminating dideoxynucleotides. Science. 1987;238(4825):336–341.

    [5] VALENCIA C A,PERVAIZ M A,HUSAMI A,et al.A survey of next-generation-sequencing technologies[M].New York,2013:13-24.

    [6] Margulies M,Egholm M,Altman W E,et al. Genome sequencing in open microfabricated high density picoliter reactors[J]. Nature, 2005, 437(7057):376-380.

    [7] Fedurco M,Romieu A,Williams S,et al. BTA,a novel reagent for DNA attachment on glass and efficient generation of solid-phase amplified DNA colonies[J]. Nucleic Acids Research,2006,34(3):e22.

    [8] Shendure J,Porreca G J,Reppas N B,et al. Accurate multiplex polony sequencing of an evolved bacterial genome[J]. Science,2005,309(5741):1728-1732.

    [9] Eid J,F(xiàn)ehr A,Gray J,et al. Real-time DNA sequencing from single polymerase molecules[J]. Science,2009,323(5910):133-138.

    [10] METZKER M L .Sequencing technologies the next generation[J].N ature Rev iews Genetics,2010,11(1):31-46 .

    [11] ROTHBERG J M,HINZ W,REARICKTM,et al .An integrated semiconductor device enabling nonoptical genome sequencing[J].N ature,2011,475(7356):348-352 .

    [12]鐘偉民,張興坦,趙茜, 等.三代測序PacBio在轉錄組研究中的應用[J].福建農林大學學報(自然科學版),2018,47(5):524-529. DOI:10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2018.05.002.

    王錦秀 遼寧師范大學

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