植物中長鏈非編碼RNA研究進展綜述

劉琳營 蘇曉俊 閔玲

摘要：長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，簡稱lncRNA），通常定義為長度超過200 nt的非編碼RNA，是幾乎不具有編碼能力或具有弱編碼能力的RNA轉(zhuǎn)錄本。早期的研究質(zhì)疑lncRNA的重要性，因為與mRNA相比，lncRNA具有低表達和低序列保守性的特點，認(rèn)為它是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，故將其存在歸因于轉(zhuǎn)錄噪聲。近年來，隨著對非編碼RNA的深入研究，lncRNA獨特的生物學(xué)特性和功能被陸續(xù)鑒定，多數(shù)研究學(xué)者認(rèn)為lncRNA是一種在生物體中普遍存在且參與基因調(diào)控的重要組分。本文主要對植物中發(fā)現(xiàn)的lncRNA的種類、發(fā)揮功能的分子機制、參與的生物學(xué)過程及研究策略等進行綜述，為在植物領(lǐng)域進一步研究lncRNA提供依據(jù)和參考。

關(guān)鍵詞：長鏈非編碼RNA;植物;功能;分子機制;研究策略

中圖分類號： S184文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）12-0012-08

收稿日期：2020-11-07

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（編號：2016YFD0101402）。

作者簡介：劉琳營（1994—），女，山東濟寧人，碩士研究生，研究方向為lncRNA與棉花花藥發(fā)育及高溫響應(yīng)。E-mail：linyingliu_257@webmail.hazu.edu.cn。

通信作者：閔 玲，博士，副教授，主要從事棉花生殖發(fā)育、環(huán)境與生殖發(fā)育互作研究。E-mail：lingmin@mail.hazu.cn。

近年來，生物技術(shù)的快速發(fā)展使研究者證實真核生物的基因組中并非全部序列都可以編碼蛋白質(zhì)，其中大多數(shù)是非編碼序列 [1]。在以往對于非編碼RNA的研究中，備受重視的是一系列短鏈非編碼RNA，如siRNA、miRNA、snRNA等，自1991年科學(xué)家證實Xist參與X染色體失活的調(diào)控后[2]，不斷有研究表明，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，簡稱lncRNA）在調(diào)控真核生物的生命活動中具有重要的作用。

大多數(shù)的lncRNA與mRNA一樣，能夠被RNA Pol Ⅱ轉(zhuǎn)錄，具有5′端帽子、3′端poly（A）尾以及選擇性剪接位點等結(jié)構(gòu)特點[3-4]，一些lncRNA可被RNA Pol Ⅲ轉(zhuǎn)錄，植物中也有少數(shù)lncRNA是由植物特異性RNA Pol Ⅳ和Ⅴ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的[5-7]。一般來說，真核生物編碼蛋白質(zhì)的序列相對保守，同源性很高，而lncRNA是一類在不同物種中具有低序列保守性的轉(zhuǎn)錄本，由此推測，個體和物種間存在差異的原因可能是由于非編碼序列差異導(dǎo)致[8-9]。隨著高通量轉(zhuǎn)錄組測序和表達譜分析技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多的研究表明lncRNA在真核生物的生長發(fā)育過程中扮演著十分重要的角色[10]。相比于動物中l(wèi)ncRNA的研究，植物lncRNA的探索仍處于初級階段，研究主要集中在擬南芥、蒺藜苜蓿、番茄和水稻等植物中（表1）。本文主要對植物lncRNA的分類、分子機制研究進行綜述，總結(jié)了lncRNA參與植物生長發(fā)育和逆境脅迫中的重要調(diào)控機制，并對植物中l(wèi)ncRNA的研究策略進行概述，為深入研究植物中l(wèi)ncRNA的功能和分子機制提供科學(xué)依據(jù)。

1 lncRNA的來源和種類

1.1 lncRNA的來源

在真核生物中，編碼蛋白質(zhì)的基因幾乎是通過部分或整體復(fù)制以及隨后的序列分化而產(chǎn)生的，由于大多數(shù)非編碼RNA受到較低程度的進化限制，所以只有很少一部分在不同物種之間表現(xiàn)出序列保守性，因此研究者推測lncRNA可能來自以下幾種途徑：（1）閱讀框插入蛋白質(zhì)編碼基因的內(nèi)含子之間，插入的閱讀框與先前的編碼序列重新整合形成功能性lncRNA;（2）染色體重排，將2個分開的非轉(zhuǎn)錄區(qū)連接在一起而產(chǎn)生有多外顯子的lncRNA;（3）非編碼基因進行逆轉(zhuǎn)座復(fù)制形成功能性逆基因或非功能性假基因;（4）局部重復(fù)序列串聯(lián)產(chǎn)生相鄰重復(fù)的lncRNA;（5）轉(zhuǎn)座因子插入產(chǎn)生功能性lncRNA[11]。

1.2 lncRNA的種類

1.2.1 基于所在基因組位置進行分類

根據(jù)lncRNA在基因組中與蛋白編碼基因的相對位置，可將其分為正義lncRNA（sense long non-coding RNA）、反義lncRNA（antisense long non-coding RNA）、雙向lncRNA（bidirectional long non-coding RNA）、基因內(nèi)lncRNA（intronic long non-coding RNA）、基因間lncRNA（intergenic long non-coding RNA）5類，其中基因間lncRNA也被稱為大型介入性非編碼RNA，即lincRNA（large intervening noncoding RNA）[30-31]。

1.2.2 基于分子機制進行分類

大多數(shù)lncRNA具有功能，前期研究者發(fā)現(xiàn)lncRNA可按分子功能進行以下分類[32-33]。

信號分子：lncRNA可作為信號分子調(diào)控鄰近基因表達。例如在雌性動物發(fā)育過程中，Xist誘導(dǎo)X染色體的失活，該lncRNA在一條X染色體上表達會導(dǎo)致整個染色體沉默[34]。而在植物發(fā)育調(diào)控中，DOG1（delay of germination 1）基因調(diào)控擬南芥種子休眠，as-DOG1（antisense delay of germination 1） lncRNA會抑制DOG1基因的表達，打破種子休眠[11]。

誘餌分子：lncRNA可以作為誘餌，通過招募RNA結(jié)合蛋白（RNA binging protein，簡稱RBP），例如：轉(zhuǎn)錄因子、染色質(zhì)修飾物或者其他調(diào)控因子間接調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)編碼基因的表達[32]。此外，lncRNA作為誘餌可以結(jié)合miRNAs，阻斷miRNAs與其特異性的靶基因互作，這個過程被稱為內(nèi)源模擬靶標(biāo)（endogenous target mimicry，簡稱eTM）[33]。在擬南芥中，miR399及其靶基因PHO2（PHOSPHATE 2，編碼泛素結(jié)合酶相關(guān)蛋白的基因）在維持磷酸鹽穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用[35]。lncRNA IPS1（INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION1）和At4都會競爭性地與miR399結(jié)合，導(dǎo)致PHO2上調(diào)表達 [12-13，24]。

引導(dǎo)分子：lncRNA可以引導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白復(fù)合體定位到特定位置或招募染色質(zhì)修飾酶到靶基因，順式（cis）或反式（trans）作用于靶基因[32]。例如，在蒺藜苜蓿中發(fā)現(xiàn)lncRNA Enod40可直接與根瘤中的MtRBP1（medicago truncatula RNA binding protein 1）蛋白結(jié)合，將MtRBP1從植物細(xì)胞的核斑點重新定位到細(xì)胞質(zhì)顆粒中發(fā)揮重要的作用[14]。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)lncRNA COLDAIR與植物PRC2（polycomb repressive complex 2）蛋白復(fù)合體中的亞基CLF（CURLY LEAF）特異結(jié)合，指導(dǎo)PRC2復(fù)合體到達FLC（FLOWERING LOCUS C）位點，PRC2通過組蛋白H3K27甲基化改變FLC位點的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而抑制FLC的表達，調(diào)控開花時間[15-16]，這一過程中COLDAIR作為引導(dǎo)分子進行反式調(diào)節(jié)。最近研究發(fā)現(xiàn)lncRNA MAS可以與COMPASS-like復(fù)合物中的WDR5a（WD40-REPEAT 5a）結(jié)合并將其引導(dǎo)到MAF4（MADS AFFECTING FLOWERING4）位點，從而促進H3K4的甲基轉(zhuǎn)移酶活性并激活MAF4的表達，進而微調(diào)開花時間[17]。

支架分子：lncRNA可以作為支架分子行使分子功能。以往有研究認(rèn)為很多復(fù)合物都是用蛋白質(zhì)作為支架[36]。但近年來研究表明，lncRNA有多種不同的結(jié)合功能域，可以與不同的蛋白復(fù)合體或效應(yīng)分子結(jié)合，這對復(fù)雜的生物信息傳遞、分子間的相互作用以及對信號本身特異性的精準(zhǔn)調(diào)控非常重要[37-38]。植物中特有的Pol V可以產(chǎn)生siRNA和相關(guān)蛋白，識別其靶基因所需的支架轉(zhuǎn)錄本，通過RNA介導(dǎo)的DNA甲基化（RNA directed DNA methylation，簡稱RdDM）途經(jīng)進行染色質(zhì)修飾[39]。RdDM途經(jīng)主要依賴2種核心蛋白DICER-LIKE 3（DCL3）和ARGONAUTE 4（AGO4），前者切割長雙鏈RNA產(chǎn)生小干擾RNAs（small interfering RNAs，簡稱siRNAs），這些siRNAs與AGO蛋白結(jié)合，形成AGO-siRNAs復(fù)合物，Pol V產(chǎn)生的lncRNA作為支架將AGO-siRNAs復(fù)合物轉(zhuǎn)運到染色質(zhì)的目標(biāo)位點[40-42]。例如，lincRNA APOLO（AUXIN REGULATED PROMOTER LOOP RNA）作為支架RNA參與染色質(zhì)環(huán)的形成[18]。

lncRNA除以上4種分子機制，還是小RNA（siRNA和miRNA）生物合成的前體，如植物中特有的Pol Ⅳ產(chǎn)生的lncRNA，可以由DCL蛋白切割產(chǎn)生siRNA[43];也可能是miRNA的靶標(biāo)，如miRNA可通過靶向切割lncRNA生成phasiRNA的方式參與植物對長日照脅迫的響應(yīng)[44]。由于lncRNA在植物中的研究尚處于早期階段，導(dǎo)致植物中缺乏系統(tǒng)和一致的lncRNA調(diào)控機制，隨著研究的不斷深入，對lncRNA的分子功能劃分將更加完善。

2 lncRNA在植物中參與的生物學(xué)過程

2.1 lncRNA參與植物生長發(fā)育

對lncRNA參與植物生長發(fā)育的研究主要集中在生長素運輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面。lncRNA ENOD40和lnc351被稱為ASCO-RNA（alternative splicing competitor RNA），可以與核斑RNA結(jié)合蛋白（nuclear speckle RNA-binding proteins，簡稱NSRs）相互作用，進而調(diào)節(jié)基因選擇性剪切。在擬南芥中ASCO-RNA能與mRNA競爭性結(jié)合NSRs，干擾下游生長素應(yīng)答基因的選擇性剪接，進而影響側(cè)根的生長[45]。此外，ENOD40能參與調(diào)節(jié)細(xì)菌或真菌與豆科植物的共生關(guān)系，在共生相互作用中，根瘤菌迅速誘導(dǎo)根瘤菌原基中ENOD40的表達。雖然潛在的分子機制尚不清楚，但ENOD40可以在運輸非共生植物細(xì)胞生長所必需的代謝物方面發(fā)揮作用[46-47]。最近研究表明，生長素調(diào)控啟動子環(huán)APOLO（auxin egulated promoter loop）可以動態(tài)調(diào)節(jié)下游基因PID（PINOID）啟動子的環(huán)化過程，從而影響PID啟動子的活性。PID是植物生長素極性轉(zhuǎn)運的重要調(diào)節(jié)因子，生長素激活RDD（ROS1、DML2、DML3）介導(dǎo)的DNA去甲基化，促進覆蓋PID啟動子區(qū)域的環(huán)打開[18，48]。HID1（HIDDEN TREASURE 1）是長度為236 nt的lncRNA，在擬南芥中，HID1受持續(xù)紅光調(diào)控，抑制了光敏色素互作因子PIF3（phytochrome-interacting factor 3）的轉(zhuǎn)錄，促進了幼苗的光形態(tài)發(fā)生[49]。在水稻中，LAIR（LRK antisense inetrgenic RNA）是由鄰近基因LRK（leucine-rich repeat receptor kinase）的反義鏈轉(zhuǎn)錄而來，LAIR可以結(jié)合染色質(zhì)修飾蛋白OsMOF和OsWDR5，并共同定位于LRK1基因組位點，從而激活LRK1轉(zhuǎn)錄，提高水稻產(chǎn)量[19]。此外，在水稻中發(fā)現(xiàn)的另一個lncRNA TL（TWISTED LEAF）可以通過調(diào)控R2R3-MYB基因的表達，維持水稻葉片的平展度[20]。

2.2 lncRNA參與植物的開花調(diào)控及生殖發(fā)育

有大量研究報道，在植物生殖發(fā)育過程中，lncRNA也起到了非常重要的調(diào)控作用。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)lncRNA COLDAIR可以調(diào)控FLC（FLOWERING LOCUS）染色質(zhì)區(qū)域的組蛋白甲基化，COLDAIR由FLC的第1個內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄而來，春化期間可以與多梳組蛋白復(fù)合體PRC2（Polycomb Repressive Complex 2）中的CLF（CURLY LEAF）直接相互作用，指導(dǎo)PRC2復(fù)合體到FLC基因位點，PRC2具有H3K27甲基轉(zhuǎn)移酶的作用，通過使H3K27me3富集來抑制FLC基因表達，促進擬南芥正常開花[15，50-51]。近年來，有研究者在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了一個天然反義轉(zhuǎn)錄長鏈非編碼RNA（natural antisense transcript-lncRNAs，簡稱NAT-lncRNAs），命名為MAS（one NAT-lncRNA，NAT-lncRNA_2962），可結(jié)合組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的關(guān)鍵組分WDR5a（WD40 containing repeat 5a），將其招募到MAF4（MADS AFFECTING FLOWERING4）的基因位點，增強H3K4me3并激活MAF4的表達[17]，從而調(diào)控擬南芥的開花時間。

除了調(diào)節(jié)植物開花，lncRNA也會影響花粉發(fā)育過程。與水稻光敏雄性不育相關(guān)的lncRNA被稱為長日照特異性雄性不育相關(guān)RNA（long-day-specific male-fertility-associated RNA，簡稱LDMAR），在長日照環(huán)境下，花粉正常發(fā)育需要LDMAR的表達，而突變產(chǎn)生的單核苷酸多態(tài)性（SNP）改變了LDMAR 的二級結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致LDMAR的啟動子區(qū)域中甲基化作用增強，降低了LDMAR的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致發(fā)育中的花粉過早發(fā)生細(xì)胞程序性死亡，這是造成水稻光敏不育系敗育的重要原因[21]。在大白菜中，研究人員基于花粉特異性克隆了一個全長828 bp的cDNA，命名為BcMF11（Brassica campestris male fertility gene 11），是一種全新的非編碼RNA，其沒有明顯的開放閱讀框或編碼能力，當(dāng)BcMF11的表達降低時會產(chǎn)生花藥絨氈層降解推遲、小孢子分離不同步、花粉粒發(fā)育中斷等異?，F(xiàn)象[22-23]，最終導(dǎo)致花粉粒不正常發(fā)育，出現(xiàn)敗育表型。

隨著高通量轉(zhuǎn)錄組測序的快速發(fā)展，在很多物種中鑒定出與生殖發(fā)育有關(guān)的lncRNA。有研究表明，在蕪菁的花粉發(fā)育過程中，lncRNA可以作為內(nèi)源模擬靶標(biāo)調(diào)節(jié)miRNA的功能，其中bra-eTM160-1和 bra-eTM160-2這2個lncRNAs預(yù)測是bra-miR160-5p的eTM，研究證實轉(zhuǎn)基因植株的花器官形狀雖然正常，但花藥中有一半的花粉粒具有小且皺縮、無活力、沒有細(xì)胞核或花粉內(nèi)壁缺失的敗育表型[24]。在水稻中，同源四倍體水稻在遺傳進化方面比二倍體水稻具有更大的優(yōu)勢，但常伴有育性低及種子結(jié)實不良等特點，研究人員利用高通量測序發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)座因子和減數(shù)分裂調(diào)控靶點相關(guān)的lncRNA可能是花粉和胚囊發(fā)育的內(nèi)源調(diào)控因子，其差異表達導(dǎo)致同源四倍體水稻的育性降低[52]。在棉花中，研究人員對棉花的RNA-seq數(shù)據(jù)分析表明，在花藥組織中優(yōu)勢表達的lncRNA較其他組織多，共鑒定到3 925個在花藥中高表達的lincRNAs[53]。為了進一步研究lncRNA在棉花花藥中的作用，Zhang等對三系雜交棉（胞質(zhì)不育系、保持系、恢復(fù)系）的花藥發(fā)育過程進行了轉(zhuǎn)錄組測序，共鑒定到80 695個參與胞質(zhì)雄性不育和生育力恢復(fù)的候選lncRNAs，隨后分別對不育系-保持系和不育系-恢復(fù)系差異表達的lncRNA進行GO分析，分析結(jié)果顯示不育系-保持系在細(xì)胞激素代謝過程和氧化還原反應(yīng)過程中存在明顯差異，而不育系-恢復(fù)系的差異主要在于棉花育性恢復(fù)過程中調(diào)控細(xì)胞形態(tài)形成的功能基因[54]。研究人員對不育系-保持系的花粉母細(xì)胞時期、四分體時期和小孢子時期的差異lncRNAs和mRNAs分析時發(fā)現(xiàn)，這些差異lncRNAs和mRNAs可能參與了絨氈層細(xì)胞降解、小孢子發(fā)育、花粉發(fā)育以及棉花花藥細(xì)胞壁的分化、增殖和凋亡等生殖發(fā)育過程，進一步的GO和KEGG分析顯示它們分別參與植物氧化磷酸化、類黃酮生物合成、戊糖和葡萄糖酸相互轉(zhuǎn)化、脂肪酸生物合成和MAPK信號通路，由于代謝途經(jīng)異常導(dǎo)致花藥敗育，最終造成雄性不育[55]。

2.3 lncRNA參與植物的逆境脅迫響應(yīng)

植物在生長過程中往往會經(jīng)歷高溫、干旱、鹽堿等非生物脅迫及細(xì)菌、真菌、病毒等生物脅迫。由于植物的固著生長，只能通過調(diào)節(jié)基因表達及代謝物的改變來應(yīng)對不斷變化的環(huán)境條件，其中l(wèi)ncRNA在植物響應(yīng)非生物脅迫中發(fā)揮重要的角色。lncRNA DRIR（drought induced RNA）在干旱、鹽脅迫和脫落酸處理后被激活，調(diào)控植物中ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、水運輸?shù)软憫?yīng)非生物脅迫相關(guān)基因的表達[25]。此外，Li等對水稻進行全轉(zhuǎn)錄組鏈特異性測序，分析發(fā)現(xiàn)lncRNA可以參與短期干旱“記憶”反應(yīng)[56]。近年來，有研究對耐旱甘藍(lán)型油菜及敏旱甘藍(lán)型油菜在干旱和復(fù)水條件下進行轉(zhuǎn)錄組分析，構(gòu)建了lncRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡(luò)，進而篩選出了在干旱中參與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的lncRNA，并且驗證了這些lncRNA在油菜中可以正調(diào)控靶基因的表達，從而對干旱脅迫作出響應(yīng)[57]。在低磷脅迫下，擬南芥中的lncRNA IPS1（induced by phosphate starvation1）和玉米中的lncRNA PILNCR1（Pi-deficiency-induced long-noncoding RNA1）都可以模擬miR399的靶標(biāo)，競爭性地與miR399結(jié)合，從而增加miR399靶標(biāo)基因PHO2的表達，維持植株在低磷脅迫下的正常生長[12，58]。在蒺藜苜蓿中，lncRNA PDIL1（Phosphate Deficiency-Induced lncRNA 1）作為miR399的模擬靶標(biāo)競爭性地抑制MtPHO2轉(zhuǎn)錄本，MtPHO2通過泛素化途經(jīng)參與Pi轉(zhuǎn)運蛋白的降解[26]，表明PDIL1通過間接控制MtPHO2對Pi的轉(zhuǎn)運來保持植物體中相對穩(wěn)定的磷濃度。

此外，lncRNA在植物響應(yīng)生物脅迫的過程中也具有關(guān)鍵調(diào)控作用。在擬南芥中，RNA Pol Ⅲ轉(zhuǎn)錄的lncRNA AtR8在擬南芥根中特異性表達，對野生型和atr8突變體的微陣列分析表明AtR8與防御反應(yīng)存在較強的關(guān)聯(lián)，在擬南芥處于發(fā)育早期、低水楊酸條件或感染紫丁香假單胞菌時，AtR8的積累與2個WRKY基因（WRKY53/WRKY70）的積累呈負(fù)相關(guān)，由NPR1（nonexpressor of pathogenesis-related gene 1）協(xié)同調(diào)控植物的防御反應(yīng)及根系伸長[27，59]。在番茄中，lncRNA33732沉默會導(dǎo)致RBOH基因的表達降低，減少H2O2的含量，導(dǎo)致番茄對番茄疫霉根腐病的敏感性增強，而番茄lncRNA16397可激活SlGRX表達，降低細(xì)胞內(nèi)ROS含量積累，使細(xì)胞膜不易損傷，從而增強番茄對致病疫霉的抗性[28-29]。同時，番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus，簡稱TYLCV）也是番茄作物的毀滅性病害，對番茄的生產(chǎn)具有重要威脅，最新的研究發(fā)現(xiàn)易感番茄的lncRNA SILNR1可與TYLCV的小干擾RNA （small-interfering RNAs，簡稱siRNAs）互作，為TYLCV誘導(dǎo)疾病及宿主抗病毒免疫提供了合理的模型[60]。在棉花中，lncRNAs Ghlnc NAT-ANX 2（L2）和Ghlnc NAT-RLP 7（L3）在棉花對黃萎病菌和灰霉病菌的抗性中發(fā)揮重要作用，研究發(fā)現(xiàn)對L2和L3進行沉默后會上調(diào)其鄰近蛋白質(zhì)編碼基因的表達，從而增強棉花的抗病性[61]。

3 植物中l(wèi)ncRNA的研究策略

在真核基因組中非編碼序列雖沒有蛋白質(zhì)編碼能力，但在調(diào)控個體的生命過程中扮演著重要的角色，目前對非編碼RNA研究占主導(dǎo)地位的是長度小于200 nt的小RNA（如microRNAs、siRNA、與Piwi蛋白互作的piRNA），其分類和功能機制研究的較為透徹[62]。由于lncRNA在不同物種間具有保守性差、易降解、表達豐度低等特點[5]，早期沒有引起研究者的重視，隨著現(xiàn)代生物測序技術(shù)的不斷發(fā)展，更多的lncRNA被鑒定出來，成為科研領(lǐng)域的熱點。

目前對lncRNA的研究一般集中在動物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，研究的基本策略主要分為：（1）lncRNA的篩選與鑒定。隨著鏈特異性建庫的廣泛應(yīng)用，lncRNA預(yù)測算法的不斷發(fā)展，在擬南芥[17，63]、桑樹[64]、甘藍(lán)[65]和棉花[54-55]等植物中篩選和鑒定了大量潛在的lncRNAs。近年來，以單分子測序為特點的第三代測序技術(shù)的快速發(fā)展，可實現(xiàn)RNA的直接測序以及RNA上修飾的檢測[66]，從擬南芥[67]、水稻[68]、澳洲棉[69]等物種中鑒定了大量lncRNAs。（2）lncRNA的表達和定位。通過高通量測序篩選的lncRNA需要運用成熟的技術(shù)驗證其表達水平及定位，包括Northern印記、實時熒光定量PCR（qRT-PCR）、RNA熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，簡稱FISH）和瞬時表達等。（3）lncRNA的功能和機制研究。通過高效穩(wěn)定的植物遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)可以進一步揭示候選lncRNA的生物學(xué)功能?；静呗灾饕δ塬@得性研究和功能缺失性研究。功能獲得性研究主要是通過導(dǎo)入過表達載體實現(xiàn)，功能缺失性研究主要采用CRISPR/Cas9基因敲除和RNAi干涉等方法進行研究。在水稻中，通過對病原體敏感的lncRNA轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，過表達ALEX1可以激活茉莉酸途經(jīng)和對白葉枯病的抗性[70];在番茄中，利用CRISPR/Cas9編輯技術(shù)獲得lncRNA1459缺失突變體，其果實表現(xiàn)出明顯的成熟延遲[71];在番茄中超表達和干涉lncRNA33732可以影響番茄對致病疫霉的抗性[29]。此外，lncRNA與蛋白質(zhì)的互作研究常用RNA-pull down技術(shù)、RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation，簡稱RIP）、RNA純化的染色質(zhì)分離（chromatin isolation by RNA purification，簡稱ChIRP）、目標(biāo)RNA的捕捉雜交分析（capture hybridization analysis of RNA targets，簡稱CHART）和交聯(lián)免疫沉淀（crosslinking-immunopurification，簡稱CLIP）。因此依據(jù)前人研究結(jié)果，總結(jié)出在植物中可以實現(xiàn)的lncRNA的研究策略（圖1）。

4 展望

隨著高通量測序技術(shù)與生物信息學(xué)的飛速發(fā)展，越來越多的lncRNA被發(fā)現(xiàn)，研究顯示，lncRNA并不是之前所認(rèn)識的“垃圾序列”，而是可以在各種層面上調(diào)控基因的表達，如表觀遺傳[15，17，72]、轉(zhuǎn)錄調(diào)控[73-74]及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[12，43，75]。雖然目前對lncRNA的研究取得了一些成果，但研究者所面臨的問題仍然很多，如：許多l(xiāng)ncRNA的生物學(xué)功能未得到闡明;判斷非編碼轉(zhuǎn)錄物是否有功能依然困難;lncRNA作用機制復(fù)雜多樣，不同的lncRNA研究結(jié)果之間的借鑒意義不高。面對這些問題，可以從新的技術(shù)策略和思路入手：（1）納米孔測序技術(shù)可以直接對RNA進行測序，并可擴展到lncRNA的全長繪制[67]。（2）單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和表觀基因組的同時分析可以建立lncRNA與染色質(zhì)之間的功能聯(lián)系[76]。（3）對已獲得的差異lncRNAs實行靶基因預(yù)測、與差異mRNA的共表達分析及轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測。（4）CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可應(yīng)用在多種植物基因工程中，雖然目前CRISPR基因編輯技術(shù)

發(fā)展較快，且編輯精度日益提高，為研究重要的植物生長和發(fā)育特征提供了有力的支持，但對lncRNA的編輯則需要更特異的sgRNA靶標(biāo)來確保敲除全長。隨著研究技術(shù)的逐漸成熟，研究領(lǐng)域的逐漸深入，相信對植物中l(wèi)ncRNA功能的挖掘和調(diào)控機制的了解會更加透徹，對探索其在植物生命活動及發(fā)育過程中的作用具有十分重要的意義。

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