茶樹ZF-HD轉(zhuǎn)錄因子基因家族的鑒定及表達(dá)分析

龐丹丹 劉玉飛 田易萍 孫云南 陳林波

摘要：【目的】搜索鑒定茶樹ZF-HD（Zinc finger homeodomain）轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析及在不同組織及非生物脅迫和激素處理下的表達(dá)模式，為茶樹ZF-HD基因家族的功能研究及茶樹遺傳性狀改良提供理論依據(jù)。【方法】通過(guò)隱馬爾可夫模型預(yù)測(cè)和序列比對(duì)從茶樹基因組中篩選鑒定出茶樹ZF-HD基因家族成員，利用在線生物信息學(xué)分析軟件對(duì)其基因結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)子元件，以及編碼蛋白的理化性質(zhì)、氨基酸序列、結(jié)構(gòu)特征、進(jìn)化關(guān)系等進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，并基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq）數(shù)據(jù)分析其在不同組織及在干旱脅迫、鹽脅迫和茉莉酸甲酯（MeJA）處理下的表達(dá)模式。【結(jié)果】從茶樹基因組中鑒定出17個(gè)ZF-HD基因家族成員（CsZHD1～CsZHD17），其編碼區(qū)（CDS）序列長(zhǎng)度為369～2187 bp，編碼122～728個(gè)氨基酸殘基，蛋白分子量13.51～80.42 kD，理論等電點(diǎn)為6.09～9.19，均屬于親水性不穩(wěn)定蛋白，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)均由β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈、α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成。除CsZHD2、CsZHD5和CsZHD7蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，CsZHD9蛋白定位于細(xì)胞外，其他13個(gè)蛋白均定位于細(xì)胞核。僅CsZHD2、CsZHD7、CsZHD9、CsZHD10和CsZHD12基因含外顯子和內(nèi)含子，其他12個(gè)CsZHDs基因均無(wú)內(nèi)含子。除CsZHD7蛋白具有2個(gè)ZF-HD_dimer結(jié)構(gòu)域外，其他16個(gè)蛋白均具有1個(gè)ZF-HD_dimer結(jié)構(gòu)域。CsZHD1～CsZHD17蛋白具有2～5個(gè)保守基序（motif），其中motif 1和motif 3為共有的保守基序。茶樹ZF-HD家族蛋白可分為5個(gè)亞族（ZHD Ⅰ、ZHD Ⅱ、ZHD Ⅲ、ZHD Ⅳ和MIF），較擬南芥少了ZHD Ⅴ亞族。除CsZHD2、CsZHD12和CsZHD17基因在8個(gè)組織中不表達(dá)或表達(dá)量極低外，其他14個(gè)CsZHDs基因在8個(gè)組織中呈差異性表達(dá);除CsZHD2、CsZHD12和CsZHD17基因外，其他15個(gè)CsZHDs基因在頂芽或花中表達(dá)量較高。在干旱脅迫和鹽脅迫處理下，除CsZHD1、CsZHD2、CsZHD5、CsZHD12、CsZHD14和CsZHD17基因的表達(dá)量始終處于較低水平外，其他CsZHDs基因均呈不同的變化趨勢(shì);在MeJA處理下，除CsZHD2、CsZHD5和CsZHD12基因表達(dá)量極低外，多數(shù)CsZHDs基因呈下調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)。【結(jié)論】從茶樹基因組中鑒定出17個(gè)ZH-HD基因家族成員，其編碼蛋白具有保守的鋅指結(jié)構(gòu)域和同源異型盒結(jié)構(gòu)域;茶樹與擬南芥ZH-HD基因家族相比缺少ZHD Ⅴ亞族;CsZHDs基因的表達(dá)具有組織特異性，且大多數(shù)成員的表達(dá)受非生物脅迫和MeJA的影響。

關(guān)鍵詞： 茶樹;ZF-HD基因家族;鑒定;生物信息學(xué);表達(dá)分析;非生物脅迫;茉莉酸甲酯（MeJA）

中圖分類號(hào)： S571.103.53? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）03-0632-09

Identification and expression analysis of ZF-HD transcription factor gene family in Camellia sinensis

PANG Dan-dan， LIU Yu-fei， TIAN Yi-ping， SUN Yun-nan， CHEN Lin-bo*

（Tea Research Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences/Yunnan Provincial Key Laboratory for Tea Science/Yunnan Technology Engineering Research Center of Tea Germplasm Innovation and Supporting

Cultivation， Menghai， Yunnan? 666201， China）

Abstract：【Objective】Identification and analysis of ZF-HD（zinc finger homeodomain） gene family members by bioinformatics methods and detection of their expression patterns under different tissues， abiotic stresses and hormone induction were conducted， which laid theoretical basis for the functional study of tea plant ZF-HD（ZFD） family gene and improvement of tea genetic traits. 【Method】ZF-HD gene family members of tea plant were identified from tea plant genome by HMMER program prediction and sequence alignment. A variety of bioinformatics analysis tools were used to analyze gene structure， promoter elements， and the physical and chemical properties，amino acid sequences，structural characteristics， evolutionary relationships， of the encoded protein. Based on RNA-Seq data，the expression patterns of members of the ZF-HD gene family in different tissues under drought stress， salt stress， and? methyl jasmonate（MeJA） were analyzed. 【Result】Seventeen ZF-HD gene family members（CsZHD1-CsZHD17） were identified from tea plant genome database.? Coding region sequence（CDS） length was 369-2187 bp， encoding 122-728 amino acid residues. CsZHD encoded proteins with molecular weights ranging from 13.51 to 80.42 kD and theoretical isoelectric points of 6.09 to 9.19， which were all hydrophilic and unstable proteins. The secondary structure consisted of beta-turn， extended strand， alpha-helix and random-coil state. The results of subcellular localization showed that except CsZHD2，CsZHD5，and CsZHD7 proteins were localized in the cytoplasmic and CsZHD9 was localized in the extracellular， all other CsZHD proteins were localized in the nuclears. Only CsZHD2， CsZHD7， CsZHD9， CsZHD10 and CsZHD12 contained exons and introns， and the other 12 CsZHDs had no introns. CsZHD7 protein had two ZF-HD_dimer domains and the other 16 proteins had one ZF-HD_dimer domain. CsZHD1-CsZHD17 had 2-5 conserved motifs， and motif 1 and motif 3 were shared conserved motifs in CsZHDs. Tea ZH-HD family proteins could be divided into 5 subfamilies （ZHD Ⅰ，ZHD Ⅱ，ZHD Ⅲ，ZHD Ⅳ and MIF）， but the tea plant lacked the ZHD Ⅴ subfamily compared to Arabidopsis thaliana. The expression profile of the ZHD genes using RNA-Seq data showed that except for CsZHD2，CsZHD12， and CsZHD17， which were not expressed in these eight tissues or the expression levels were low， other CsZHDs genes were differentially expressed in the 8 tissues. The expression levels of CsZHD1， CsZHD2， CsZHD5， CsZHD12， CsZHD14 and CsZHD17 were always at a low level， and other CsZHDs genes showed different expressional trends under drought and salt stresses. Under MeJA treatment， most CsZHDs genes showed a downward-regulated expression except for the extremely low expression of CsZHD2，CsZHD5 and CsZHD12. 【Conclusion】Seventeen members of the ZH-HD gene family were identified from the tea tree genome， and the encoded proteins have conserved zinc finger domain and homotype box domain. Tea trees lack ZHD Ⅴ subgroups compared to the A. thaliana ZH-HD gene family; the expression of the CsZHDs gene is tissue-specific， and most members are affected by ambiotic stress and MeJA.

Key words： tea plant（Camellia sinensis）;? ZF-HD gene family; identification; bioinformatics; expression analysis; abiotic stress; methyl jasmonate（MeJA）

Foundation item： National Key Research and Development Program of China（2019YFD1001601）; National Tea Industry Technology System Construction Project （CARS-19）

0 引言

【研究意義】轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factors，TFs）在植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用（Riechmann et al.，2000），如WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與植物抗逆性反應(yīng)（丁忠杰，2014），ZF-HD（Zinc finger homedomain）轉(zhuǎn)錄因子參與生長(zhǎng)發(fā)育、非生物脅迫和植物激素響應(yīng)等多種生物學(xué)過(guò)程（張晉玉等，2017），MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控果實(shí)和芽葉顏色（Wei et al.，2018），MADS-box轉(zhuǎn)錄因子參與花器官的發(fā)育（楊方慧等，2019）等。茶樹（Camellia sinensis）是一種多年生的常綠葉用經(jīng)濟(jì)作物，在其生長(zhǎng)發(fā)育和逆境適應(yīng)等過(guò)程中均有多種轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控。因此，對(duì)茶樹ZF-HD基因家族進(jìn)行全基因組分析，以探討該家族蛋白在器官發(fā)育和脅迫響應(yīng)中的潛在作用，對(duì)揭示茶樹ZF-HD蛋白的重要生物學(xué)功能具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】同源異形盒基因（Homeobox gene，HB）是一類廣泛存在于動(dòng)植物中的轉(zhuǎn)錄因子基因，其編碼的轉(zhuǎn)錄因子具有一個(gè)約由60個(gè)氨基酸殘基組成的特征性結(jié)構(gòu)域，即同源異型域（Homeodomain，HD），在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用（Gehring et al.，1990）。植物中HB是一個(gè)龐大的家族，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sativa subsp. japonica）中均含100個(gè)以上的HB基因家族成員。根據(jù)HD序列、位置及其他結(jié)構(gòu)域可將HB分成6個(gè)亞家族：ZF-HD（Zinc finger motif-associated HD/Homeobox）、HD-Zip（Leucine zipper-associated HD）、WOX（WUSCHEL-related homeo-box）、Bell（Bell type HD）、PHD finger（Finger domain associated to a HD）和KNOX（Knotted-related homeobox）（Ariel et al.，2007）。其中，ZF-HD家族蛋白不僅含HD結(jié)構(gòu)域，還含有一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域（Zinc-finger domain），廣泛存在于陸生植物中（Hu et al.，2008）。自ZF-HD轉(zhuǎn)錄因子首次在黃花菊（Flaveria trinervia）中被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，陸續(xù)從擬南芥（Tan and Irish，2006）、葡萄（Wang et al.，2014）、白菜（Wang et al.，2016）和番茄（胡靖康，2018）等多種植物中分離鑒定出ZF-HD家族成員。其中，已對(duì)葡萄（Wang et al.，2014）、陸地棉（倪萬(wàn)潮等，2016）和白菜（Wang et al.，2016）等多種植物ZF-HD家族成員進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定及功能分析。研究證明，ZF-HD轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與到植物花和葉片的器官發(fā)育及逆境脅迫響應(yīng)中（張晉玉等，2017;Shalmani et al.，2019）。其中，有關(guān)ZF-HD在花發(fā)育中的作用研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥ZF-HD基因家族包括14個(gè)AtZHD基因和3個(gè)AtMIF基因，其中MIF與ZF-HD高度同源，也劃分為ZF-HD家族，但缺乏HD結(jié)構(gòu)域，且在擬南芥花組織中高表達(dá)，推測(cè)其參與花的發(fā)育（Tan and Irish，2006）;大白菜和大麥的ZF-HD家族成員也參與花發(fā)育（Wang et al.，2016;Abu-Romman and Al-Hadid，2017）。有關(guān)ZF-HD在響應(yīng)逆境中的作用研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中AtZHD1基因可被干旱、脫落酸（ABA）及鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，可與快速應(yīng)答干旱響應(yīng)的脫水誘導(dǎo)早期應(yīng)答基因（ERD1）的啟動(dòng)子特異性結(jié)合（Tran et al.，2007）;大豆ZF-HD基因家族成員GmZHD1和GmZHD2可與病原菌脅迫的鈣調(diào)蛋白家族成員GmCAM4的啟動(dòng)子結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控其表達(dá)水平，影響病原菌脅迫響應(yīng)（Park et al.，2007）;從水稻中鑒定獲得4個(gè)ZF-HD轉(zhuǎn)錄因子，其在低溫、干旱和機(jī)械損傷等抗逆中發(fā)揮重要作用（Figueiredo et al.，2012）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來(lái)茶樹基因組已測(cè)序完成（Xia et al.，2019），為研究茶樹ZF-HD基因家族打下基礎(chǔ)，但至今鮮見有關(guān)茶樹ZF-HD基因家族鑒定及表達(dá)分析的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)隱馬爾可夫模型預(yù)測(cè)和序列比對(duì)從茶樹基因組中篩選鑒定出茶樹ZF-HD基因家族成員，利用生物信息學(xué)分析軟件對(duì)其基因結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)子元件，以及編碼蛋白的理化性質(zhì)、氨基酸序列、結(jié)構(gòu)特征和進(jìn)化關(guān)系等進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，并基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq）數(shù)據(jù)分析其在不同組織及在干旱脅迫、鹽脅迫和茉莉酸甲酯（MeJA）處理下的表達(dá)模式，為茶樹ZF-HD基因家族的功能研究及茶樹遺傳性狀改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 茶樹ZF-HD基因家族鑒定

從TPIA數(shù)據(jù)庫(kù)（茶樹基因組數(shù)據(jù)庫(kù)）（http：//teaplant.org/index.html）（Xia et al.，2019）下載茶樹基因組數(shù)據(jù)，然后通過(guò)以下2種方法鑒定茶樹ZF-HD基因家族成員：（1）從擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.arabidopsis.org/）下載ZF-HD家族蛋白的氨基酸序列，利用本地BLASTp程序（E<10-5）搜索茶樹總蛋白序列，從中鑒定出茶樹ZF-HD家族成員;（2）從Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//pfam.xfam.org/）下載PF04770（ZF-HD_dimer結(jié)構(gòu)域）的隱馬爾可夫模型，搜索鑒定出茶樹ZF-HD家族蛋白（E<10-20）。最后利用CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）分析茶樹ZF-HD家族蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，篩選出具有ZF-HD_dimer結(jié)構(gòu)域的ZF-HD家族蛋白（CsZHDs）。

1. 2 茶樹ZF-HD家族蛋白生物信息學(xué)分析

分別使用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）、CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）、MEME（http：//meme-suite.org/）、PSORT（https：//wolf-psort.hgc.jp/）及SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）等在線生物信息學(xué)分析軟件對(duì)茶樹ZF-HD家族蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、保守基序、亞細(xì)胞定位和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。利用TBtools（https：//github.com/CJ-Chen/TBtools）進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域和基序的可視化作圖（Chen et al.，2020）。

1. 3 茶樹ZF-HD家族基因結(jié)構(gòu)和進(jìn)化關(guān)系分析

從茶樹基因組數(shù)據(jù)中查找ZF-HD基因家族外顯子和內(nèi)含子分布的相關(guān)數(shù)據(jù)，利用TBtools繪制其基因結(jié)構(gòu)圖（Chen et al.，2020）。使用ClustalW對(duì)茶樹ZF-HD家族蛋白與擬南芥ZF-HD家族蛋白進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，然后利用MEGA 7.0的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（Bootstrap設(shè)為1000）（Hall，2013）。

1. 4 茶樹ZH-HD家族基因啟動(dòng)子分析

從茶樹基因組數(shù)據(jù)中提取ZF-HD基因家族啟動(dòng)子序列，即起始密碼子（ATG）上游2000 bp，然后提交到PlantCARE數(shù)據(jù)庫(kù)（Lescot，2002），預(yù)測(cè)啟動(dòng)子上的順式作用元件，并借助TBtools對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行可視化（Chen et al.，2020）。

1. 5 茶樹ZH-HD家族基因表達(dá)分析

從TPIA數(shù)據(jù)庫(kù)下載茶樹不同組織（根、莖、頂芽、嫩葉、成熟葉、老葉、花和果）及脅迫處理[干旱脅（25% PEG）、鹽脅迫（200 mmol/L NaCl）和MeJA（0.25%）]的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（Xia et al.，2019）。利用HemI 1.0制作基因表達(dá)熱圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 茶樹ZF-HD基因家族成員的鑒定及其理化性質(zhì)分析結(jié)果

通過(guò)序列篩選分析，去除相似性低的序列和重復(fù)序列，最終獲得17個(gè)茶樹ZF-HD基因家族成員。根據(jù)基因ID大小進(jìn)行排序，依次命名為CsZHD1～ CsZHD17（表1）。CsZHD1～CsZHD17基因編碼區(qū)（CDS）序列長(zhǎng)度為369～2187 bp，編碼122～728個(gè)氨基酸殘基，蛋白分子量為13.51～80.42 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為6.09～9.19，均屬于親水性蛋白（GRAVY<0），不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，為不穩(wěn)定蛋白。亞細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示，除CsZHD2、CsZHD5和CsZHD7定位于細(xì)胞質(zhì)，CsZHD9定位于細(xì)胞外，其他13個(gè)蛋白均定位于細(xì)胞核。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果（表2）顯示，茶樹ZHD蛋白均由β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈、α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，且均以無(wú)規(guī)則卷曲占比最大，其次是α-螺旋和延伸鏈，β-轉(zhuǎn)角占比最小。

2. 2 茶樹ZF-HD家族蛋白結(jié)構(gòu)域組成及保守基序分析結(jié)果

基于茶樹基因組中ZF-HD基因家族成員的注釋信息，繪制其基因結(jié)構(gòu)圖譜（圖1-A）。CsZHD1～CsZHD17基因序列全長(zhǎng)為377～15287 bp，其中以CsZHD5基因全長(zhǎng)序列最短，以CsZHD9基因全長(zhǎng)序列最長(zhǎng);僅CsZHD2、CsZHD7、CsZHD9、CsZHD10和CsZHD12基因含外顯子和內(nèi)含子，其他12個(gè)CsZHDs基因均無(wú)內(nèi)含子。

利用CDD（Conerved domain database）對(duì)17個(gè)茶樹ZF-HD家族蛋白的保守結(jié)構(gòu)域ZF-HD_dimer進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除CsZHD7具有2個(gè)ZF-HD_dimer結(jié)構(gòu)域外，其他16個(gè)蛋白均只有1個(gè)ZF-HD_dimer結(jié)構(gòu)域（表1）。17個(gè)茶樹ZF-HD家族蛋白的氨基酸殘基數(shù)目不同，且其ZF-HD_dimer結(jié)構(gòu)域位置也各不相同（表1），基因內(nèi)含子和外顯子存在間隔，致使ZF-HD_dimer結(jié)構(gòu)域的編碼序列在基因序列上被分開（圖1-A）。

利用MEME對(duì)茶樹ZF-HD家族蛋白的保守基序進(jìn)行分析，結(jié)果（圖1-B）顯示，17個(gè)茶樹ZF-HD家族蛋白具有2～5個(gè)保守基序（motif），其中motif 1和motif 3為共有的保守基序，CsZHD2、CsZHD4、CsZHD5、CsZHD7和CsZHD12僅含有motif 1和motif 3，CsZHD3含有motif 1、motif 2和motif 3，其他蛋白均具有motif 1、motif 2、motif 3和motif 4，其中CsZHD9、CsZHD10、CsZHD13和CsZHD16還含有motif 5。

2. 3 茶樹ZF-HD家族蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果

依據(jù)植物ZF-HD家族進(jìn)化關(guān)系及其在擬南芥中的分組方法，利用MEGA 7.0構(gòu)建茶樹和擬南芥ZF-HD家族蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，如圖2所示。17個(gè)茶樹ZF-HD家族蛋白可分成5個(gè)亞族，其中CsZHD3、CsZHD4和CsZHD15屬于ZF-HD Ⅰ亞族;CsZHD8、CsZHD11和CsZHD17屬于ZF-HD Ⅱ亞族;CsZHD1、CsZHD6和CsZHD14屬于ZF-HD Ⅲ亞族;CsZHD9、CsZHD10、CsZHD12、CsZHD13和CsZHD16屬于ZF-HD Ⅳ亞族;CsZHD2、CsZHD5和CsZHD7屬于MIF亞族。未發(fā)現(xiàn)與擬南芥AtZHD13和AtZHD14同屬于ZHD Ⅴ亞族的茶樹ZF-HD家族蛋白。

2. 4 茶樹ZF-HD家族基因啟動(dòng)子順式作用元件分析結(jié)果

由圖3可知，茶樹ZF-HD家族基因啟動(dòng)子上除具有多個(gè)TATA-box和CAAT-box類的基礎(chǔ)順式作用元件外，還存在大量與光響應(yīng)相關(guān)的元件如ACE、ATC-motif、Box 4、GATA-motif、GT1-motif、MRE、TCCC-motif、TCT-motif、ATCT-motif、G-box、Sp1、3-AF1 binding site、AE-box和I-box等，以及多種激素響應(yīng)的相關(guān)元件如生長(zhǎng)素響應(yīng)元件（AuxRR-core和TGA-element）、赤霉素響應(yīng)元件（GARE-motif、P-box和TATC-box）、脫落酸響應(yīng)元件（ABRE）、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（CGTCA-motif和TGACG-motif）和水楊酸（TCA-element）。此外，茶樹ZF-HD家族基因啟動(dòng)子序列上存在多個(gè)脅迫誘導(dǎo)相關(guān)的元件如厭氧脅迫響應(yīng)元件（ARE和GC-motif）、干旱脅迫響應(yīng)元件（MBS）、低溫脅迫響應(yīng)元件（LTR）、機(jī)械損傷脅迫響應(yīng)元件（WUN-motif）和TC-rich repeats，以及多種與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的順式作用元件如參與柵欄葉肉細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)元件（HD-Zip 1）、胚乳表達(dá)的調(diào)節(jié)元件（GCN4_motif）和分生組織表達(dá)的調(diào)控元件（CAT-box）?？梢?，CsZHD1～CsZHD17基因可能參與茶樹的生長(zhǎng)發(fā)育、脅迫反應(yīng)和激素應(yīng)答。

2. 5 茶樹ZF-HD家族基因不同組織的表達(dá)分析結(jié)果

基于TPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中茶樹8個(gè)代表性組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)CsZHD1～CsZHD17基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果（圖4）表明，CsZHD12基因在8個(gè)組織中均未檢測(cè)到表達(dá)量，CsZHD2和CsZHD17基因在8個(gè)組織中的表達(dá)量均很低或不表達(dá)，其他基因在8個(gè)組織中基本均有表達(dá)，但在不同組織中的表達(dá)量不同。整體來(lái)看，除CsZHD2、CsZHD5、CsZHD12和CsZHD17基因外，其他13個(gè)CsZHDs基因在頂芽中有較高的表達(dá)水平，而在根中的表達(dá)量較低;在莖、頂芽、嫩葉、成熟葉和老葉中CsZHD1～CsZHD17基因表達(dá)模式相近，尤其在莖、頂芽和嫩葉中更相似，表達(dá)水平均處于中等水平，CsZHD5在花中表達(dá)量極高。綜上所述，除CsZHD2、CsZHD12和CsZHD17基因之外，其他15個(gè)CsZHDs基因可能在茶樹頂芽和花的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

2. 6 茶樹ZF-HD家族基因在不同非生物脅迫和激素處理下的表達(dá)分析結(jié)果

基于TPIA數(shù)據(jù)庫(kù)收集茶樹在干旱脅迫、鹽脅迫和MeJA脅迫處理不同時(shí)間的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)CsZHD1～CsZHD17基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果（圖5）顯示，CsZHD1、CsZHD2、CsZHD5、CsZHD12、CsZHD14和CsZHD17基因在干旱脅迫和鹽脅迫處理下的表達(dá)量始終處于較低水平，推測(cè)這些基因?qū)Ω珊得{迫和鹽脅迫無(wú)響應(yīng);CsZHD7和CsZHD13基因隨干旱脅迫和鹽脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后降低的變化趨勢(shì);CsZHD10基因在鹽脅迫下呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，但在干旱脅迫下表現(xiàn)為先降低后升高;其他CsZHDs基因均隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)其表達(dá)量不斷下降。在MeJA處理下，除表達(dá)量極低的CsZHD2、CsZHD5和CsZHD12外，其他CsZHDs基因均呈下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。綜上所述，大多數(shù)CsZHDs基因可能參與茶樹非生物脅迫及MeJA處理下的調(diào)控。

3 討論

茶樹起源于我國(guó)西南部，是常綠葉用經(jīng)濟(jì)林木，由于其嫩梢加工而成的茶葉富含茶多酚（尤其兒茶素）、茶氨酸、茶多糖和咖啡堿等多種對(duì)人體有益的生理活性成分。隨著人們對(duì)茶葉保健功能認(rèn)識(shí)的不斷加深，使得茶葉市場(chǎng)需求量不斷增長(zhǎng)。茶樹生長(zhǎng)發(fā)育和響應(yīng)脅迫受多種基因調(diào)控，其中轉(zhuǎn)錄因子基因是重要的調(diào)控基因（Riechmann et al.，2000）。經(jīng)大量研究證實(shí)，植物ZF-HD轉(zhuǎn)錄因子參與生長(zhǎng)發(fā)育、非生物脅迫和植物激素反應(yīng)等多種生物學(xué)過(guò)程（張晉玉等，2017）。本研究從茶樹全基因組中鑒定出17個(gè)ZF-HD基因家族成員（CsZHD1～CsZHD17），與擬南芥（Tan and Irish，2006）ZF-HD基因家族成員數(shù)量相同，高于葡萄（13個(gè)）（Wang et al.，2014）、水稻（15個(gè)）（Xu et al.，2014）和卷柏（7個(gè)）（Khatun et al.，2017），低于番茄（22個(gè)）（胡靖康，2018）和甘藍(lán)型油菜（62個(gè)）（宋敏等，2019）的ZF-HD基因家族成員數(shù)量;但從植物基因組大小相比，茶樹基因組較大，約3.1 Gb，遠(yuǎn)高于擬南芥（164 Mb）、水稻（441 Mb）、甘藍(lán)型油菜（283.8 Mb）、卷柏（212.5 Mb）和葡萄（490 Mb）等的基因組?？梢?，植物ZF-HD家族基因數(shù)量與基因組大小無(wú)明顯相關(guān)性，究其原因可能是基因組較小的植物中發(fā)生了基因組復(fù)制事件，從而引起ZF-HD基因家族擴(kuò)展（Khatun et al.，2017）。

依據(jù)植物ZF-HD家族基因進(jìn)化關(guān)系及擬南芥ZF-HD家族基因的分組方法（Hu et al.，2008;Wang et al.，2016），本研究將茶樹的17個(gè)ZF-HD家族蛋白分為5個(gè)亞族：MIF、ZHD Ⅰ、ZHD Ⅱ、ZHD Ⅲ和ZHD Ⅳ，與擬南芥ZF-HD家族相比，茶樹缺少ZHD Ⅴ亞族，其原因可能是在進(jìn)化過(guò)程中遺失。據(jù)報(bào)道，ZF-HD亞族丟失現(xiàn)象在水稻和玉米中均有發(fā)生（李春艷，2018）。本研究的茶樹ZF-HD家族基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，僅CsZHD2、CsZHD7、CsZHD9、CsZHD10和CsZHD12基因含有外顯子和內(nèi)含子，其他12個(gè)CsZHDs基因僅含外顯子，無(wú)內(nèi)含子，說(shuō)明僅含外顯子的基因所占比例較高，約70.59%。該結(jié)論與其他植物ZF-HD家族基因結(jié)構(gòu)相似，如擬南芥（Tan and Irish，2006）、番茄（胡靖康，2018）和椰子（孫熹微等，2020）的ZF-HD家族基因也僅含外顯子。內(nèi)含子的缺失會(huì)導(dǎo)致ZF-HD家族基因無(wú)法進(jìn)行可變剪切，從而使ZF-HD家族蛋白具有較高的保守性（胡靖康，2018）。此外，本研究發(fā)現(xiàn)有3個(gè)茶樹ZF-HD家族蛋白（CsZHD2、CsZHD5和CsZHD7）屬于MIF亞族，與擬南芥MIF亞族一樣均缺少HD結(jié)構(gòu)域（Tan and Irish，2006;Wang et al.，2016）;除CsZHD2、CsZHD5和CsZHD7外，CsZHD4和CsZHD12也缺少HD結(jié)構(gòu)域，但在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹上未聚在MIF亞族，而是分別聚在ZHD Ⅰ和ZHD Ⅳ亞族。在其他植物中未見類似的研究報(bào)道，其原因可能是CsZHD4和CsZHD12基因發(fā)生變異或重組，使得HD結(jié)構(gòu)域缺失，具體原因有待進(jìn)一步研究。

CsZHD1～CsZHD17基因啟動(dòng)子上除含有多個(gè)TATA-box和CAAT-box類的基礎(chǔ)順式作用元件外，還存在大量與光響應(yīng)、激素響應(yīng)、脅迫響應(yīng)及生長(zhǎng)發(fā)育等相關(guān)的順式作用元件，故推測(cè)其可能參與生長(zhǎng)發(fā)育、脅迫響應(yīng)和激素應(yīng)答。經(jīng)表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，除CsZHD2、CsZHD12和CsZHD17基因外，其他14個(gè)CsZHDs基因在不同組織中均呈差異表達(dá)，由于基因的差異表達(dá)與其功能密切相關(guān)，故推測(cè)這些基因的生物學(xué)功能存在差異，如CsZHD4、CsZHD9、CsZHD10和CsZHD11基因等在頂芽和嫩葉中高表達(dá)，其可能參與茶樹新梢芽葉的發(fā)育;CsZHD5、CsZHD9和CsZHD10在花中高表達(dá)，尤其CsZHD5基因在花中表達(dá)量極高，其可能與茶樹花器官的發(fā)育密切相關(guān)。在擬南芥（Tan and Irish，2006）、水稻（Xu et al.，2014）和白菜（Wang et al.，2016）中，ZF-HD轉(zhuǎn)錄因子基因參與葉和花等組織發(fā)育。

經(jīng)前人研究證實(shí)，植物ZF-HD家族基因參與非生物脅迫響應(yīng)和激素應(yīng)答（Tran et al.，2007;Figueiredo et al.，2012）。本研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)CsZHDs基因參與茶樹非生物脅迫及MeJA處理的響應(yīng)調(diào)控，多數(shù)基因表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，與Tran等（2007）研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫和鹽脅迫誘導(dǎo)AtZHD1基因上調(diào)表達(dá)的結(jié)果不一致。因此，CsZHDs基因的生物學(xué)功能仍需深入研究。

4 結(jié)論

從茶樹基因組中鑒定出17個(gè)ZF-HD基因家族成員，其編碼蛋白具有保守的鋅指結(jié)構(gòu)域和同源異型盒結(jié)構(gòu)域;茶樹與擬南芥ZF-HD基因家族相比缺少ZHD Ⅴ亞族;CsZHDs基因的表達(dá)具有組織特異性，且大多數(shù)成員的表達(dá)受非生物脅迫和MeJA的影響。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）