福州市新型冠狀病毒全基因組測序和進化分析

陳智偉 姚栩 謝乃鴻 陳艷 張曉陽

摘要：目的 全基因組測序用于福州地區(qū)2019新冠病毒（nCov-2019）病原的基因組進化分析。方法 構(gòu)建捕獲法-病毒全基因組測序方法，利用Tn5酶能夠設(shè)別切割雙鏈DNA并掛上特定標簽的特性構(gòu)建SARS-cov2的測序文庫，使用MiSeq進行測序。結(jié)果 我們對5例CT值低于35的新冠核酸陽性標本進行建庫，獲得3株（FZ20LG957、FZ20LG1462和FZ20LG398）覆蓋率大于95%的病毒株序列。討論 課題數(shù)據(jù)可用于提高新型冠狀病毒監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)的監(jiān)測能力。

【中圖分類號】R563.1 【文獻標識碼】A 【文章編號】1673-9026（2021）07-409-01

介紹

2019年12月，中國湖北省武漢市出現(xiàn)了一種新型冠狀病毒[1]被指定為嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒2（SARS-CoV-2），該疾病被稱為冠狀病毒病2019（COVID-19）。世界衛(wèi)生組織宣布該疾病為國際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件[2]，該項研究中，我們進行全基因組測序，并應用于SARS-CoV-2的臨床標本。

方法

標本采集

標本的收集與前處理：收集福州地區(qū)新型冠狀病毒qPCR陽性的標本5份，進行RNA提取并采用Random引物進行反轉(zhuǎn)錄（去人基因組gRNA的試劑）。

構(gòu)建捕獲法-病毒全基因組測序方法

利用多重擴增方案快速擴增新冠病毒的全基因組序列，利用Tn5酶能夠設(shè)別切割雙鏈DNA并掛上特定標簽的特性構(gòu)建SARS-cov2的測序文庫，使用MiSeq進行測序，并對下機數(shù)據(jù)通過生物信息學方法進行分析獲得福州地區(qū)SARS-cov2的全基因組序列。將福州地區(qū)的序列信息與各地公開數(shù)據(jù)比對探索福州地區(qū)新冠肺炎病人的來源。

系統(tǒng)發(fā)育和序列分析

結(jié)果：

我們采集的5份新冠核酸陽性標本，進行測序建庫，其中覆蓋率高于95%的病毒有三株分別是FZ20LG957、FZ20LG1462和FZ20LG398。我們進一步下載了所有完整和高覆蓋率的基因組截至2020年3月14日來自GISAID的序列。一株參考菌株（登錄號MN908947.3）從GenBank（NCBI）下載。使用MAFFT對3個序列進行比對（版本7.427）進行進一步分析。系統(tǒng)發(fā)育系統(tǒng)進化樹顯示福州的SARS-CoV-2病毒基因組位于和武漢標準株進化枝中（圖1）。這三株的與武漢新冠標準株的同源性高達99.5%、99.2%和98.9%。最分散的應變3個福州病毒序列中有FZ20LG957，顯示9個核苷酸變化（與FZ20LG1462相比）（導致5個氨基酸變化）。值得注意的是，我們在基因組位置27，848-發(fā)現(xiàn)了32個核苷酸（nt）序列的缺失FZ20LG1462中的27，894-27，927。

圖1. FZ20LG957、FZ20LG1462和FZ20LG398三株新冠病毒株基因組進化分析

討論

這項研究完成了3株病毒株基因組測序。利用MAGE-X軟件中的Neighbor-Joining tree構(gòu)建溯源樹探究福州地區(qū)主要的病毒來源地區(qū)。通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明這些序列位于不同的進化枝，根據(jù)測序獲得的序列和已公開序列構(gòu)建fasta格式文件。3個基因組中觀察到更少的核苷酸差異。我們檢測到一個32 nt缺失，幾乎覆蓋了該序列的整個開放閱讀框。一個相似的據(jù)報道，新加坡有8名住院患者接受了觀察。在SARS冠狀病毒2003年爆發(fā)期間，觀察到ORF8缺失，這與減少人細胞中病毒復制的能力[3-4]?；蚪M這些病毒的變異被認為有助于成功適應環(huán)境。進一步的研究是需要調(diào)查SARS-CoV-2 nsp14在復制保真度中的功能[5]。從不同位置及時共享SASR-CoV-2的完整基因組對于監(jiān)測病毒的遺傳變化，這些變化可能與病毒傳播和臨床表現(xiàn)[6]。我們確定了福州不同地區(qū)的SARS-CoV-2序列進化枝。

參考文獻：

[1]Zhu N， Zhang D， Wang W， Li X， Yang B， Song J， et al. A Novel Coronavirus from Patients 219 with Pneumonia in China， 2019. N Engl J Med. 2020 Feb 20;382（8）：727-33. 220

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[6]Bankevich A， Nurk S， Antipov D， Gurevich AA， Dvorkin M， Kulikov AS， et al. SPAdes： a 229 new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. J Comput Biol. 230 2012 May;19（5）：455-77.

福州市科技局新冠肺炎項目 020-XG-026

作者簡介：陳智偉（1979-），男，博士研究生，主管技師，分子病毒學