TLR9 基因及-1237T/C 位點(diǎn)多態(tài)性與心血管疾病關(guān)聯(lián)研究

李喜龍 周璐瑾 崔思瑤 劉俊杰 閆 珂 王瑾潔 王文棟 常曉彤

河北北方學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，張家口，075000，中國

心血管疾?。╟ardiovascular diseases，CVD）是心臟和腦血管疾病的統(tǒng)稱，是世界上發(fā)病率和死亡率最高的疾病［1］。CVD 主要包括了大多數(shù)心肌梗死、中風(fēng)以及致殘性外周動脈疾?。?］，其主要病狀是動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS），即動脈壁纖維化病變的形成。近年，人們對心血管疾病的研究不斷深入，但許多機(jī)制仍未闡明。挖掘CVD 生物標(biāo)記物，對于CVD 的預(yù)防、早期發(fā)現(xiàn)、提高治療效果和整體存活率方面具有重要意義［3］。Toll 樣受體（toll-like receptors，TLRs）屬于模式識別受體家族的一類跨膜信號受體，當(dāng)微生物突破機(jī)體的物理屏障（皮膚、黏膜等）時可被TLRs 識別，并激活機(jī)體產(chǎn)生免疫細(xì)胞應(yīng)答，是機(jī)體抵抗感染性疾病的第一道屏障［4-6］。另外，TLRs 與慢性低度炎癥反應(yīng)也密切相關(guān)［7］。TLR9 是TLRs 家族成員之一，通過識別病毒和細(xì)菌上未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鳥嘧啶（CpG DNA）基序，激活信號通路，引發(fā)先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答［8］。

近年來，以小鼠為研究對象的許多研究表明TLR9與心血管疾病有關(guān)聯(lián)。有研究表明，TLR9 是血栓后綜合征（post-thrombotic syndrome，PTS）潛在的細(xì)胞和介質(zhì)治療靶點(diǎn)之一［9］。高劑量CpG 寡脫氧核苷酸（oligodeoxynucleotide，ODN）全身性刺激TLR9 會損害載脂蛋白E 缺陷型小鼠急性血管損傷后的內(nèi)皮再形成，并增加動脈粥樣硬化斑塊的形成［10］。在不同類型的心力衰竭中，包括TLR9 在內(nèi)的TLR 和干擾素調(diào)節(jié)因子在強(qiáng)烈的炎癥過程起著重要作用［11］。TLR9 抑制性寡核苷酸作為潛在的新型凝血治療藥物，可用于預(yù)防急性冠狀動脈疾病和膿毒癥等可能大量存在細(xì)菌DNA的病理中的凝血現(xiàn)象［12］。

TLR9 在自身免疫和炎癥過程中有重要作用，其基因的多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡、肺癌和胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［13-15］。但TLR9 基因與心血管疾病發(fā)生的關(guān)聯(lián)機(jī)制尚不完全明確。因此本文利用生物信息學(xué)方法，對TLR9 基因的基本組成、理化性質(zhì)、單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)、蛋白質(zhì)互作和功能注釋進(jìn)行分析，研究了TLR9 基因SNP 位點(diǎn)-1237T/C 的多態(tài)性，以豐富TLR9 和心血管疾病的關(guān)聯(lián)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

從河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院收集189 份血漿標(biāo)本，其中健康對照組121 例，心血管疾病組68 例。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會同意，且所有納入者均知情同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 TLR9 的基本組成和理化性質(zhì)分析

利用DNAstar 軟件［16］分析從美國生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/）［17］中獲取的TLR9 的CDS（coding sequences）序列（DQ 019999.1），尋找開放閱讀框并翻譯成蛋白序列。使用Bioedit 軟件分析TLR9 蛋白的氨基酸組成；采用ExPASy 的Protparam 數(shù)據(jù)庫（https：//web.expasy.org/protparam/）［18］分析TLR9 蛋白的基本理化性質(zhì)；使用ExPASy 的ProtSale 數(shù)據(jù)庫（https：//web.expasy.org/protscale/）［19］分析TLR9 蛋白的親疏水性。

1.2.2 TLR9 蛋白的信號肽及線性B 細(xì)胞表位分析

使用SignalP-5.0 數(shù)據(jù)庫（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）尋找TLR9 信號肽區(qū)域；使用NetNES數(shù)據(jù)庫（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNES）尋找TLR9 核定位信號區(qū)域；使用Bepipred（http：//tools.immuneepitope.org/bcell）挖掘TLR9 的線性B 細(xì)胞表位。

1.2.3 TLR9 基因的SNP 位點(diǎn)分析

利用NCBI 的SNP 數(shù)據(jù)庫［20］（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/）分析TLR9 的SNP 位點(diǎn)多態(tài)性。

1.2.4 TLR9 蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測以及功能域分析

使用SOPMA［21］預(yù)測TLR9 編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)；使用SWISS-MODEL（https：//www.swissmodel.expasy.org/）［22］預(yù)測TLR9 蛋白的三級結(jié)構(gòu)；用Pfam（https：//pfam.xfam.org/）［23］尋找TLR9 蛋白的功能域。

1.2.5 TLR9 的關(guān)聯(lián)蛋白互作及其功能注釋

以TLR9 蛋白作為中心節(jié)點(diǎn)，聯(lián)合使用STRING在線分析工具（https：//string-db.org/）［24］和Cytoscape 3.6.1 軟件［25］篩選與TLR9 互作的蛋白并構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。使用DAVID 數(shù)據(jù)庫（www.david.abcc.ncifcrf.gov/）［26］對TLR9 及與其發(fā)生互作的蛋白基因進(jìn)行功能注釋。

1.2.6 提取基因組DNA 并鑒定濃度和純度

采用IANGEN BIOTECH 公司DNA 提取試劑盒，使用離心柱法提取外周血DNA；采用SAM4000UV-Vis超微量紫外分光光度計(jì)測定提取的DNA 含量和濃度。

1.2.7 針對SNP 位點(diǎn)（rs5743836）設(shè)計(jì)引物

本研究選定TLR9 基因SNP 位點(diǎn)rs5743836（-1237T/C），設(shè)計(jì)上、下游引物為：正向：5′-GTTTGTAAG AAGGCTGGATGGC-3′；反向：5′-GGACCTGCCACCC GCTGT-3′，理論擴(kuò)增片段長度為221 bp。

1.2.8 RFLP-PCR 擴(kuò)增目的基因

用PCR 儀對基因進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系（50 μL）為：10×PCR Buffer 5 μL（10 mmol·L-1）、dNTP Mixture 4 μL（2.5 mmol·L-1）、上游引物（10 μmol·L-1）2 μL、下游引物（10 μmol·L-1）2 μL、Taq酶（5 U·μL-1）0.25 μL、模板DNA（400 ng/DNA 的濃度）、滅菌蒸餾水補(bǔ)足至50 μL。PCR 條件：95 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 min，72 ℃延伸 1 min，共進(jìn)行35 個循環(huán)；72 ℃補(bǔ)平10 min。目的條帶為221 bp，1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測擴(kuò)增結(jié)果是否為目的條帶。

1.2.9 酶切目的條帶

酶切體系（20 μL）為：PCR 產(chǎn)物12 μL、10×buffer 2 μL、滅菌蒸餾水5 μL、BstNI 酶（10 U·μL-1）1 μL，放到37 ℃恒溫金屬浴中3 h 后，行3.5%的瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)所得結(jié)果進(jìn)行基因分型。將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測序，電泳結(jié)果比對測序結(jié)果，確定最終分型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS23.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P＜0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 TLR9 蛋白的氨基酸組成

應(yīng)用Bioedit 軟件對TLR9 蛋白的氨基酸組成進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，TLR9 蛋白由859 個氨基酸殘基組成，其中Leu（157 個，18.3%）、Ser（68 個，7.9%）、Ala（62 個，7.2%）和Arg（59 個，6.9%）含量較多；所含堿性氨基酸和酸性氨基酸總數(shù)分別為83 和74，分別占總氨基酸數(shù)的9.7%和8.6%。

2.2 TLR9 蛋白理化性質(zhì)分析

利用ProtParam 工具分析TLR9 蛋白的基本理化參數(shù)，該蛋白殘基總數(shù)為859 個，原子總數(shù)為13 622個，分子總質(zhì)量理論為 96 844.50 Da，總分子式為C4355H6795N1225O1211S36，其中占比最高的殘基為Leu（18.3%），占比最低的殘基為Ile（1.5%）。TLR9蛋白的理論等電點(diǎn)為8.58，為堿性蛋白質(zhì)。TLR9 蛋白的不穩(wěn)定性指數(shù)（instability index，II）為41.73，是不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。親水性的平均值（grand average of hydropathicity，GRAVY）為-0.071，推斷TLR9 蛋白為親水性蛋白質(zhì)。

2.3 TLR9 蛋白親/疏水性、信號區(qū)域和線性B 細(xì)胞表位分析

運(yùn)用ProtScale 中Kyte-Doolittle 法預(yù)測TLR9 蛋白親水性/疏水性結(jié)果表明，在整個肽鏈中，親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，TLR9 為親水性蛋白（Fig.1A），與理化性質(zhì)分析結(jié)果一致；應(yīng)用SignalP-5.0 對TLR9蛋白進(jìn)行信號肽分析，預(yù)測值為0.001 5，遠(yuǎn)小于cutoff值0.5，顯示TLR9 為非分泌性蛋白。用NetNES 進(jìn)行核定位信號分析，有4 個分?jǐn)?shù)值超過閾值（Fig.1B），提示該蛋白可能含有4 個核定位信號；運(yùn)用Bepipred 法預(yù)測B 細(xì)胞線性表位，結(jié)果顯示TLR9 蛋白平均抗原性指數(shù)為-0.349，分子內(nèi)共有多個可能的抗原表位區(qū)域（Fig.1C）。其中，分值最高的表位區(qū)域?yàn)榈?78～295 位氨基酸殘基區(qū)段，分值高達(dá)2.156（閾值0.350）；其次為第853～859、684～696、824～831、252～275、521～527 位氨基酸區(qū)段。

2.4 TLR9 的SNP 位點(diǎn)分析

SNP 位點(diǎn)分析結(jié)果顯示，rs5743836 位于3 號染色體的52226766 位置，屬于TLR9 基因上游的點(diǎn)突變（Fig.2）。

2.5 TLR9 的二、三級結(jié)構(gòu)特征及功能域分析

SOPMA 結(jié)果顯示（Fig.3A），TLR9 的二級結(jié)構(gòu)主要為α螺旋（48.89%）、無規(guī)則卷曲（33.99%）、延伸鏈（12.22%）、β轉(zhuǎn)角（4.89%）；采用SWISS-MODEL 在線預(yù)測工具同源建模法預(yù)測了TLR9 的三級結(jié)構(gòu)。亞基預(yù)測結(jié)果得到了以PDBID 5y3m 為模板的較高質(zhì)量預(yù)測模型（Fig.3B），相似度為76.9%，是預(yù)測模型中相似度最高的。全局模型質(zhì)量評估得分為0.65，明顯高于其他預(yù)測模型。另外，QMEAN 得分為-2.34，比其他預(yù)測模型更接近0；用Pfam 預(yù)測TLR9 的功能域，共有14 個功能域，其中8 個重要功能域（Fig.3C），6 個為不重要的功能域。在8 個重要的功能域中，第27 到82位氨基酸的功能域、第111 到172 位氨基酸的功能域、第303 到342 位氨基酸的功能域、第336 到383 位氨基酸的功能域、第445 到492 位氨基酸的功能域和第528 到589 位氨基酸的功能域?qū)儆贚RR8 家族，第220到249 位氨基酸的功能域?qū)儆贚RR12 家族，第697 到857 位氨基酸的功能域?qū)儆赥IR 域。

Fig.3 Secondary structure prediction，tertiary structure prediction and functional domain prediction of TLR9

2.6 TLR9 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)編碼基因功能注釋

以TLR9 蛋白作為中心節(jié)點(diǎn)，利用STRING 在線分析工具和Cytoscape3.7.2 構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)。與TLR9 互作的蛋白分別為腫瘤壞死因子受體超家族成員5（tumor necrosis factor receptor superfamily member 5，CD40）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白細(xì)胞介素10（interleukin 10，IL10）、IL6、脾相關(guān)酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，SYK）、天然免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)適配器（MYD88）、白細(xì)胞介素1 受體相關(guān)激酶1（interleukin 1 receptor associated kinase，IRAK1）、UNC9（innexin，UNC-9）、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6）和TANK 結(jié)合激酶1（TANK binding kinase 1，TBK1）（Fig.4A）。在互作網(wǎng)絡(luò)圖中，TLR9、MYD88、TBK1 屬于中心蛋白，發(fā)揮重要作用。

Fig.4 Interaction network and functional annotation diagram of TLR9 and its associated genes

利用DAVID 數(shù)據(jù)庫對TLR9 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)基因進(jìn)行功能注釋（Fig.4B）。結(jié)果顯示顯著（P＜0.05，Count≥4）的生物學(xué)過程包括：TLRs 信號通路（toll-like receptor signaling pathway），含IRAK1、MYD88、TRAF6、TLR9 四個基因；TLR9 信號通路（toll-like receptor 9 signaling pathway），含IRAK1、MYD88、TRAF6、TLR9 四個基因；免疫球蛋白分泌的調(diào)節(jié)（regulation of immunoglobulin secretion），含TNF、CD40、TRAF6 三個基因；Ⅰ型干擾素生產(chǎn)的正調(diào)控（positive regulation of type I interferon production），含IRAK1、MYD88、TBK1、SYK 四個基因；RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控（positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter），含IL6、TNF、TBK1、CD40、TRAF6、IL10、TLR9 七個基因；平滑肌細(xì)胞增殖的正調(diào)控（positive regulation of smooth muscle cell proliferation），含IRAK1、IL6、TNF、MYD88、TRAF6 五個基因；NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子活性的正調(diào)控（positive regulation of NF-kappa B transcription factor activity），含IRAK1、IL6、TNF、MYD88、CD40、TRAF6、TLR9 七個基因；IL6 產(chǎn)生的正調(diào)控（positive regulation of interleukin-6 production），含IL6、TNF、MYD88、TLR9 四個基因；I-kappa B 激酶/NF-kappa B信號的正調(diào)控（positive regulation of I-kappa B kinase/NF-kappa B signaling），含IRAK1、TNF、MYD88、TBK1、CD40、TRAF6、TLR9 七個基因；MyD88 依賴的TLRs 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（MyD88-dependent tolllike receptor signaling pathway），含IRAK1、MYD88、TRAF6、TLR9 四個基因；JNK 級聯(lián)（JNK cascade），含IRAK1、TNF、MYD88、TRAF6 四個基因；炎癥反應(yīng)（inflammatory response），含IL6、TNF、MYD88、TBK1、CD40、IL10、SYK、TLR9 八個基因；對革蘭氏陽性細(xì)菌的防御反應(yīng)（defense response to Grampositive bacterium），含IL6、TNF、MYD88、TBK1 四個基因；細(xì)胞對脂多糖的反應(yīng)（cellular response to lipopolysaccharide），含IL6、TNF、CD40、TRAF6、IL10 五個基因；顯著的細(xì)胞組成為內(nèi)體膜（endosome membrane，含IRAK1、MYD88、TBK1、TRAF6、TLR9五個基因）。

2.7 PCR、酶切和測序結(jié)果

對121 個正常體檢標(biāo)本和68 個患病標(biāo)本進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后，酶切，確定基因分型。PCR 擴(kuò)增片段長度為135 bp。189 份PCR 產(chǎn)物酶切并電泳后結(jié)果如Fig.5A。BstNI 酶切識別位點(diǎn)序列為C↓CA（T）GG，rs5743836 位點(diǎn)突變后為BstNI 酶切序列；另外，PCR目的片段中本身還存在一個穩(wěn)定的此酶切序列，因此，當(dāng)該rs5743836 位點(diǎn)發(fā)生突變時，目的片段中便有兩個酶切識別位點(diǎn)，而未突變時則只存在一個酶切位點(diǎn)，因此，理論基因分型為三種，即野生基因型TT（147 bp、74 bp）出現(xiàn)兩條帶、突變雜合型TC（147 bp 和99 bp、48 bp、74 bp）出現(xiàn)四條帶、突變純合型CC（99 bp、48 bp、74 bp）出現(xiàn)三條帶。189 份標(biāo)本的電泳圖中都有147 bp條帶，可判斷調(diào)查人群中無CC 型，存在TC 型和TT 型兩種基因型。將PCR 產(chǎn)物送往測序公司測序，進(jìn)一步鑒定。Fig.5B 和Fig.5C 所示為PCR 產(chǎn)物上游引物測序結(jié)果峰圖，與電泳判斷結(jié)果一致。

Fig.5 TLR9 gene PCR product analysis，digestion result analysis and PCR product sequencing results

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)合189 份標(biāo)本的酶切電泳結(jié)果，應(yīng)用χ2 檢驗(yàn)分析患病組和正常對照組等位基因頻率及基因型有無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異以及是否符合Hardy-Weinberg 平衡。對照組和患病組TLR9 T/C（rs5743836）基因多態(tài)性分布頻率符合 Hardy-Weinberg 平衡。Tab.1 為TLR9 各個基因型的出現(xiàn)頻率。TT 基因型分布頻率在患病組（47.06%）和正常對照組（71.90%）之間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

Tab.1 TLR9 gene genotypes in normal control group and diseased group

3 討論

近年來，隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，使用生物信息學(xué)方法和工具分析、預(yù)測蛋白質(zhì)序列已經(jīng)成為重要的分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的手段［27］。本研究利用多種生物信息學(xué)的工具分析了TLR9 基因及其編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)、空間結(jié)構(gòu)、功能域、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作及基因功能注釋。研究發(fā)現(xiàn)TLR9 屬于堿性蛋白質(zhì)，具有親水性，是非分泌蛋白，有68 個磷酸化位點(diǎn)、10 個糖基化位點(diǎn)、4 個核定位信號；此外，TLR9 有多個潛在的線性B 細(xì)胞抗原表位，而有研究證明B 細(xì)胞相關(guān)基因在冠心病患者中的表達(dá)多少與患者的患病程度有關(guān)［28］。TLR9的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示它的二級結(jié)構(gòu)以α螺旋居多，而Ernest 等的研究指出，LL-37 是一種α螺旋抗菌肽，它與dsDNA 形成的復(fù)合物通過TLR9 增強(qiáng)促炎因子的產(chǎn)生，且在小鼠動脈粥樣硬化的模型中發(fā)現(xiàn)此復(fù)合物在血漿和動脈粥樣硬化斑塊中富集［29］。TLR9 的功能域分析顯示，有6 個重要的功能域?qū)儆贚RR8 家族，1 個屬于LRR12 家族，LRR 即為富含亮氨酸的重復(fù)序列，1個屬于TIR 域。有研究表明NLRP3 炎性小體（其中包含LRR）是一種先天的免疫信號復(fù)合物，它的激活有助于血管炎性反應(yīng)，從而驅(qū)動動脈粥樣硬化的發(fā)展和進(jìn)程［30］。LL-37 可分泌到細(xì)胞外，并與IL-18 Ra 鏈結(jié)合，招募Toll/IL-1R（TIR）-8 用于傳遞抗炎信號。

TLR9 互作蛋白編碼基因功能注釋的結(jié)果顯示：TLR9 參與的一個顯著生物學(xué)過程為TLRs 信號通路，而有研究證明TLRs 信號通路通過介導(dǎo)炎癥發(fā)生在心血管疾病中起到重要作用，可作為心血管疾病潛在治療靶點(diǎn)的研究［32-33］。有研究顯示，中性粒細(xì)胞完好無損的TLR9 信號通路可調(diào)節(jié)小鼠正常的血栓形成［34］，推斷TLR9 信號通路可能參與心血管疾病的形成。有研究證明槲皮素通過抑制炎癥細(xì)胞因子表達(dá)、NF-κB 磷酸化和caspase 活性，在體內(nèi)發(fā)揮心血管保護(hù)作用［35］；IL6 與內(nèi)皮功能障礙和亞臨床動脈粥樣硬化密切相關(guān)［36］；TLR 4/MyD 88/NF-κB 信號通路參與了冠狀動脈微栓塞所致心肌損傷［37］。由此可見，炎癥在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中具有關(guān)鍵作用，TLR9 可能通過參與NF-κB、IL6 等促炎因子的正調(diào)控與心血管疾病相關(guān)聯(lián)。

SNP 是人類基因組中最常見的變異類型，它是單個堿基的突變，突變類型包括轉(zhuǎn)換、顛倒、插入和缺失［38］。TLR9 基因SNP 位點(diǎn)分析結(jié)果顯示，rs5743836位于3 號染色體的52226766 位置，屬于TLR9 基因上游的點(diǎn)突變，即-1237T/C，該突變位于TLR9 基因的啟動子區(qū)。有研究表明，TLR9-1237T/C 多態(tài)性與瘧疾易感性［39］、胃癌的發(fā)生［40］、乙型肝炎病毒的自發(fā)免疫控制［41］等有關(guān)。此外TLR9 基因該位點(diǎn)多態(tài)性也是女性靜脈血栓栓塞復(fù)發(fā)的潛在指標(biāo)［42］。本研究結(jié)果顯示心血管疾病患者與正常組TLR9 基因rs5743836 的TT 和TC 分布頻率比對，心血管疾病患者TC 基因型分布頻率增高。

綜上，TLR9 基因的-1237T/C 多態(tài)性與心血管疾病發(fā)生密切有關(guān)，且TLR9 的LRR 和TIR 功能域異常，可能激活炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展。