亞硫酸氫鈉甲萘醌粉（維生素K3）的含量測定方法研究

◆作者：鄧秉釗 潘綺雯 肖田安 林海丹

◆單位：廣東省農產品質量安全中心

亞硫酸氫鈉甲奈醌粉是一種維生素類藥物，常用于飼料添加劑領域，其止血功能可縮短凝血時間，減少動物的死亡率，用于輔助治療水產動物的出血及敗血癥，并有利于畜禽胚胎的形成，從而提高幼崽的存活率。目前收載于《獸藥質量標準》（2017年版）化學藥品卷中。原標準中含量測定項的檢測方法比較繁瑣，供試品需用三氯甲烷萃取三次后，再采用紫外分光光度法測定，容易導致實驗結果誤差較大，且三氯甲烷毒性較強。本方法優(yōu)化考察將采用高效液相法測定，分離效能和靈敏度都比較高，重現性好，能夠有效反映測定方法對待測成分的專屬性，簡化提取處理，供試品只需用水溶解稀釋處理后再進樣上機測定即可。本法能為亞硫酸氫鈉甲萘醌粉（維生素K3）的質量控制提供可靠檢測依據。

1 材料與儀器

1.1 材料

甲醇（HPLC）、磷酸二氫鈉（AR）、亞硫酸氫鈉（AR）；亞硫酸氫鈉甲萘醌原料（湖北振華化學股份有限公司，98.0%）、淀粉輔料(秦皇島驪驊淀粉有限公司)、1%亞硫酸氫鈉甲萘醌粉（廣州白云山寶神動物保健品有限公司，批次180903），甲萘醌對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100029-201811，99.7%）。

1.2 儀器

高效液相色譜儀Agilent1260、高效液相色譜儀Waters e2695、紫外分光光度計-島津UV2700、電子天平Sartorius SECVRA225D-1CN SQP精度0.01 mg。

2 實驗方法

2.1 色譜條件

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.015 mol/L磷酸二氫鈉溶液（用磷酸調節(jié)pH至4.8）（30∶70）為流動相；檢測波長為230 nm；進樣量為20μL；按外標法以峰面積計算，其結果乘以1.918，即得。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備

甲萘醌對照品10 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，用5 mL甲醇溶解，加入10%亞硫酸氫鈉溶液5 mL，振搖1 min，加水稀釋至刻度，精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備

取亞硫酸氫鈉甲萘醌粉適量（約相當于亞硫酸氫鈉甲萘醌5 mg），精密稱定，置250 mL量瓶中，加水適量，振搖使亞硫酸氫鈉甲萘醌溶解，加入10%亞硫酸氫鈉溶液1 mL，并用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 專屬性與系統(tǒng)適用性試驗

取甲萘醌對照品溶液、空白試劑、1%亞硫酸氫鈉溶液，按2.1的色譜條件進行分析，空白試劑和亞硫酸氫鈉均對測定結果無影響。理論塔板數按甲萘醌峰計算為8600（見圖1至圖3）。

圖1 空白試劑色譜圖

圖3 甲萘醌對照品溶液色譜圖

2.4 峰純度和波長的確定

取對照品溶液，按2.1的色譜條件進行分析，以DAD檢測器在200至400 nm波長處記錄色譜圖，其純度因子在計算出的閾值限值內，說明其為單一物質，未包裹共流出物；另外，在230 nm的波長處有最大吸收，故選擇230 nm為檢測波長，檢測靈敏度較高（見圖4）。

圖4 對照品溶液甲萘醌峰的純度及光譜數據圖

2.5 回收率試驗

按處方比例配制1%的亞硫酸氫鈉甲萘醌粉，取1.1中已知含量的原料約16mg、20mg、24mg及各約2 g的輔料分別置200 mL量瓶中，制成制劑標示量的80%、100%、120%三個濃度的樣品，各3份，按含量測定項下的色譜條件和方法(進樣量為5 μL)，進行測定。結果表明，回收率限度符合要求（限度要求為92%~105%），并與原標準UV法測定回收率結果對比（見表1）。

表1 回收率試驗結果

2.6 線性關系

取6個濃度的甲萘醌對照品溶液，按2.1的色譜條件進行分析，記錄色譜圖，以對照品溶液濃度的對數值與相應的峰面積對數值計算線性回歸方程。結果表明，在0.001～0.100mg/mL范圍內，峰面積的常用對數與進樣量濃度的常用對數呈良好的線性關系，回歸方程。（見表2和圖5）?；貧w方程為:

圖5 甲萘醌標準曲線

表2 線性試驗結果

圖2 1%亞硫酸氫鈉溶液色譜圖

2.7 重復性試驗

取1%亞硫酸氫鈉甲萘醌粉，按2.2.2制備6份供試品溶液，再按2.1的色譜條件進行分析，各測定一次，計算含量［本次試驗使用的高效液相色譜儀：Waters e2695（色譜柱：Waters C18 5μm 4.6×150 mm Columu）］。結果表明，本法的重復性良好（見表3）。

2.8 中間精密度試驗

取1%亞硫酸氫鈉甲萘醌粉，按2.2.2制備6份供試品溶液，再按2.1的色譜條件進行分析，各測定一次，計算含量，然后與2.7比較，本次試驗另選時間，使用高效液相色譜儀Agilent 1260（色譜柱：Gemini 5u-C18-110A 150×4.60 mm5 micron）。結果表明，本法的中間精密度良好（見表3）。

表3 重復性試驗結果及中間精密度試驗結果比較

2.9 穩(wěn)定性試驗

取1%亞硫酸氫鈉甲萘醌粉（廣州白云山寶神動物保健品有限公司，批次180903），按2.1的色譜條件進行分析，供試品溶液分別放置0、1、2、4、8、24 h后，再分別測定峰面積。結果表明，柱溫設置為25℃時，在24 h內穩(wěn)定（見表4）。

表4 穩(wěn)定性試驗結果

2.10 耐用性

試驗條件按2.1的色譜條件進行分析（色譜柱為Waters C18 5μm 4.6×150 mm Columu；柱溫為35℃；流動相為甲醇-pH 4.8的0.015 mol/L磷酸二氫鈉溶液（30∶70）。

2.10.1 柱溫

將柱溫調節(jié)為15℃、20℃、25℃、30℃、35℃，結果顯示，甲萘醌的峰隨柱溫的升高，保留時間減少，柱溫為25℃時的出峰時間為3.7 min比較合適。

2.10.2 流動相比例

將流動相磷酸二氫鈉溶液和甲醇的比例調節(jié)為21∶79、30∶70、39∶61，結果顯示，甲萘醌的峰隨甲醇比例升高，保留時間減少，而流動相中甲醇比例越低，峰寬越大，出峰時間越長，導致峰型越差，以甲醇：磷酸二氫鈉溶液（30∶70）為流動相時的出峰時間為3.7 min比較合適。

2.10.3 流動相pH值

將流動相中磷酸二氫鈉溶液的pH調節(jié)為4.0、4.8、5.6，結果顯示，鹽溶液組分的pH值越低，出峰時間增長，而pH值在4.8~5.6范圍內，出峰時間變化不大。

2.10.4 不同色譜柱

考察不同C-18柱，（Waters C18 5μm4.6×150 mm Columu；Gemini 5u-C18-110A 150×4.60 mm5 micron）的影響。結果顯示，不同色譜柱，甲萘醌峰的拖尾因子基本相同。

3 討論

3.1 本方法具有簡便、安全、快捷特點，極大提高工作效率，節(jié)約人力物力。經試驗，靈敏度、穩(wěn)定性及重現性高，回收率合理，各參數結果符合規(guī)定，方法可行，可為其質量控制提供依據。

3.2 甲萘醌具有高度的疏水性，無法用水溶解，所以配制對照品溶液時需要先用5 mL的甲醇溶解；亞硫酸氫鈉甲萘醌易溶于水，所以可以直接用水溶解處理；但二者均遇光不穩(wěn)定，所以需要加入少量亞硫酸氫鈉溶液，及避光操作。

3.3 亞硫酸氫鈉甲萘醌在水溶液中存在如下化學平衡：亞硫酸氫鈉可促使平衡向左移動，在供試液中，加有少量的亞硫酸氫鈉，可保證測定結果的穩(wěn)定可靠（見圖6）。

圖6 亞硫酸氫鈉甲萘醌化學平衡

3.4 亞硫酸氫鈉甲萘醌與甲萘醌之間的轉換系數為：1 mg的甲萘醌相當于1.918 mg的亞硫酸氫鈉甲萘醌。