日糧纖維水平對蘇禽3號肉雞盲腸纖維素酶活性、腸道組織形態(tài)及生長相關基因表達的影響

黃正洋，黃華云，李春苗，王錢保，段 煉，穆春宇，黎壽豐，趙振華

（中國農業(yè)科學院家禽研究所，江蘇揚州225125）

日糧纖維是飼料的重要組成成分，主要由纖維素構成。纖維素在肉雞日糧中能夠提供能量[1-2]。目前，日糧纖維在奶牛[3]、羊[4-5]、豬[6-8]和兔子[9]等哺乳動物中的研究較為充分，在家禽中研究主要集中在食草的水禽上。日糧纖維能夠提高畜禽生產(chǎn)性能，促進腸道蠕動，改善腸道微生物區(qū)系，提高抗病力和免疫力。我國養(yǎng)殖行業(yè)蛋白類飼料原料大量依賴進口，尚不能自足?！掇r業(yè)農村部畜牧獸醫(yī)局飼料中玉米豆粕減量替代工作方案》[10]重點要求推進用谷物和雜粕對飼料中玉米豆粕實現(xiàn)減量替代，通過增加畜禽日糧纖維素含量、降低蛋白含量、提高飼料轉化率來保障養(yǎng)殖業(yè)安全、穩(wěn)定發(fā)展。探索及開發(fā)玉米豆粕低含量日糧，對畜禽養(yǎng)殖業(yè)以及我國糧食安全，均有著重要的意義。本試驗研究不同纖維素水平日糧對蘇禽3號肉雞盲腸內容物纖維素酶活性、小腸組織形態(tài)和相關基因表達的影響，旨在探究日糧中纖維水平對雞腸道組織發(fā)育的影響，探索適宜添加比例，為肉雞生產(chǎn)中低玉米-豆粕型日糧開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

本試驗在中國農業(yè)科學院家禽科學研究所邵伯試驗基地進行，以中國農業(yè)科學院家禽科學研究所選育的蘇禽3號系為試驗對象。試驗選取體重1.2 kg左右、10周齡的母雞360只，采用單因素完全隨機試驗設計，隨機分成3組，每組4個重復，每個重復30只雞。對照組飼喂纖維素含量2%基礎日糧、試驗1組飼喂纖維素含量4%試驗日糧、試驗2組飼喂纖維素含量6%試驗日糧。試驗日糧按照試驗要求由江蘇鹽城源耀飼料有限公司配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗雞在相同的管理條件下飼養(yǎng)，自由采食、飲水，試驗期為11～21周齡。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 盲腸內容物纖維素酶活性

將雞屠宰后，迅速切開腹腔，用繩子將盲腸開口一端系住后切除，迅速轉移至凍存管液氮保存。采用蒽酮比色法測定CL催化纖維素降解產(chǎn)生的還原糖的含量。單位的定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg葡萄糖定義為1個酶活力單位。

1.3.2 小腸組織切片觀察

分離各組試驗雞腸道組織，采取十二指腸、空腸、回腸及盲腸中段約1 cm，放入10%中性福爾馬林溶液中固定24 h，換液修整樣品繼續(xù)固定備用。所有腸道樣品經(jīng)處理，用萊卡切片機沿腸管長軸垂直方向切片，每腸段切3片，HE染色，中性樹膠封片觀察。

采用Image-ProPlus 5.0圖像分析軟件系統(tǒng)測量十二指腸、空腸、回腸和盲腸的絨毛高度、隱窩深度、黏膜成厚度，并計算絨毛高度/隱窩深度的比值。絨毛高度以絨毛頂端至絨毛基部為準；隱窩深度為腸腺底部至兩絨毛之間基部開口處的距離。選取多點后取平均值，然后進行整理及統(tǒng)計分析。

表1 試驗日糧組成及營養(yǎng)水平（風干基礎）Tab.1 Composition and nutrient levelsof diets(air-dry basis)

1.3.3 基因組織表達分析

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中雞GADPH基因、BMP4基因、SMAD4基因和GATA3基因序列，利用Primer 6.0和Oligo 7.0設qRT-PCR引物。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，相關引物信息見表2。

采用Trizol Reagent提取十二指腸、空腸、回腸和盲腸組織總RNA，加入DNA酶去除基因組DNA，NanoDrop濃度儀測定其濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，待分析表明符合要求后，可進行下一步試驗。取2μg總RNA，根據(jù)采用Fermentas反轉錄試劑盒說明以Oligo dT為引物合成cDNA第一鏈。

分別對BMP4基因、SMAD4基因、GATA3基因等基因進行qRT-PCR。qRT-PCR擴增體系和程序參照定量試劑盒推薦。PCR反應在Applied Biosystems 7500熒光定量PCR系統(tǒng)中進行，GAPDH作為內參，每個樣本重復3次，采用2-ΔΔCt計算mRNA相對表達量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0的一般線性模型GLM過程的One-way ANOVA進行單因素方差分析，鄧肯氏法進行多重比較。P＜0.05表示差異顯著，結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 日糧纖維素水平對蘇禽3號肉雞盲腸纖維素酶活性的影響（見圖1）

由圖1可知，與對照組相比，日糧纖維水平從2%提高到6%，盲腸內容物纖維素酶的活性提高；試驗2組的纖維素酶活性顯著高于對照組和試驗1組（P＜0.05）。

圖1 日糧纖維素水平對蘇禽3號肉雞盲腸纖維素酶活性的影響Fig.1 Effect of dietary fiber level on cecal cellulase activity of Suqin No.3 Broiler

2.2 日糧纖維素水平對蘇禽3號投機腸道組織形態(tài)的影響（見表3）

表3 日糧纖維素水平對蘇禽3號投機腸道組織形態(tài)的影響Tab.3 Effect of different dietary fiber level on intestinal morphology of Suqin No.3 broiler

由表3可知，隨著日糧纖維水平的提高，十二指腸絨毛高度無顯著變化（P＞0.05），隱窩深度顯著增加（P＜0.05）；回腸、空腸和盲腸組織中，腸絨毛高度和隱窩深度逐漸增加，當達到纖維日糧水平達到6%時，這兩項指標變化均顯著（P＜0.05）。絨毛高度/隱窩深度比值在腸道各個組織都隨著日糧纖維水平的升高，與對照組相比變化顯著（P＜0.05）?；啬c、空腸和盲腸黏膜層厚度也隨著日糧纖維水平提高顯著增加（P＜0.05），十二指腸黏膜層厚度無顯著變化（P＞0.05）。

2.3 日糧纖維素水平對蘇禽3號肉雞生長相關基因表達的影響（見圖2～圖4）

圖2 日糧纖維素水平對蘇禽3號肉雞BMP4基因表達量的影響Fig.2 Effect of dietary fiber level on BMP4 geneexpression in Suqin No.3 broiler

圖3 日糧纖維素水平對蘇禽3號肉雞SMAD4基因表達量的影響Fig.3 Effect of dietary fiber level on SMAD4 geneexpression in Suqin No.3 broiler

圖4 日糧纖維素水平對蘇禽3號肉雞GATA3基因表達量的影響Fig.4 Effect of dietary fiber level on GATA3 geneexpression in Suqin No.3 broiler

由圖2～圖4可知，BMP4基因、SMAD4基因和GATA3基因在回腸和盲腸中，表達量均高于十二指腸的表達量（P＜0.05）。隨著日糧纖維水平的提高，各基因的表達量均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。其中，日糧纖維水平在4%時，BMP4基因、SMAD4基因和GATA3基因在小腸各段中表達量最高，且在回腸組織中表達量最高。

3 討論

曹向陽等[11]以固始雞為研究對象，探究其耐粗飼性，對比使用纖維水平為3%和5%的日糧，發(fā)現(xiàn)5%日糧纖維組固始雞盲腸內容物纖維素酶活性顯著高于3%組，日糧纖維水平會影響盲腸內容物纖維素酶活性。雞腸道并不產(chǎn)生纖維素酶，而在盲腸內容物中發(fā)現(xiàn)纖維素酶活性的變化，推測是作為家禽腸道微生物庫的盲腸，含有大量共生的產(chǎn)纖維素酶的微生物，即日糧成分的變化，重塑雞的腸道微生物群落，形成適宜雞生長發(fā)育的腸道消化吸收環(huán)境，雞對一定水平的日糧纖維可以耐受。朱曉春等[12]研究不同纖維來源的日糧對1～4周齡揚州鵝生長性能的影響，發(fā)現(xiàn)飼喂苜蓿草粉日糧和稻殼粉日糧均不會抑制揚州鵝的生長發(fā)育，日增重和料重比無顯著差異，但是會對腸道的發(fā)育產(chǎn)生一定的影響，與本文的研究結果一致。陶大鵬[13]選取吉林白鵝為研究對象，以玉米秸稈為試驗日糧纖維來源，分別設置6%、8%和10%粗纖維含量的日糧，飼養(yǎng)42 d，發(fā)現(xiàn)吉林白鵝在6～10周適合添加的日糧纖維水平為8%。在本研究前期試驗中，發(fā)現(xiàn)添加4%的日糧纖維水平，蘇禽3號生長性能提高，飼養(yǎng)成本降低，肉品質和屠宰性能無顯著變化。

Tejeda等[14]探討不同纖維來源對科寶肉雞生長性能、器官生長、腸組織形態(tài)和養(yǎng)分消化率的影響，設置4%、6%和8%日糧纖維水平，選取的纖維來源有純纖維素和大豆殼膳食纖維，發(fā)現(xiàn)纖維水平在4%時科寶肉雞回腸絨毛高度最高。本研究結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，回腸絨毛高度在各組中最高，說明回腸在雞消化吸收中發(fā)揮著重要作用。隨著日糧纖維水平的提高，各段基因的表達量也呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，表明在適宜的纖維水平，可以促進肉雞的生長發(fā)育，但是超過試驗肉雞的耐受量后，由于日糧纖維本身的抗營養(yǎng)性，相關基因的表達就會被抑制，表現(xiàn)為肉雞生長性能的下降。

我國養(yǎng)殖業(yè)飼料需要旺盛，蛋白原料供不應求。發(fā)展中國養(yǎng)禽業(yè)要充分挖掘利用現(xiàn)有飼料資源，建立精準的營養(yǎng)水平參數(shù)，優(yōu)化調整飼料配方結構，構建具有中國特色的多元化料配方體系，降低料中玉米、豆粕占比，為保障飼料糧供需平衡、穩(wěn)定糧食安全大局提供有力技術支撐。

4 結論

本試驗研究表明，日糧纖維水平由2%提高到6%，可以增強蘇禽3號肉雞盲腸內容物纖維素酶活性，改善腸道組織形態(tài)，促進相關生長發(fā)育基因的表達。