天冬糖苷散對南美白對蝦的安全性研究

謝小東，孫鈺博，季 露，謝映紅，肖 琦，韋英益，覃志彪，胡庭俊

（廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530005）

中藥制劑具有天然、安全、藥效溫和等優(yōu)點[1]，且能夠有效提高機體免疫力[2]、抑制病原微生物活性[3]。因為中草藥的低毒性、低耐藥性[4]、低刺激性等特性，近年來中草藥制劑的應(yīng)用一直是養(yǎng)殖業(yè)關(guān)注的熱點。天冬糖苷散是通過中獸醫(yī)辯證論治，并結(jié)合現(xiàn)代藥理學(xué)研究而配伍成的組方，研制出的中獸藥復(fù)方制劑。方中天冬有養(yǎng)陰潤燥、清肺生津之功效，常用于肺燥干咳、內(nèi)熱消渴[5]；三七有止血化瘀、活血定痛之功效[6]。從天冬和三七中提取的有效成分對試驗動物均有良好的免疫增強功效[7]。前期研究結(jié)果表明，天冬糖苷散具有提高動物免疫功能的作用，可用于因環(huán)境應(yīng)激導(dǎo)致的免疫力低下的南美白對蝦養(yǎng)殖中。文章旨在觀察飼喂不同劑量天冬糖苷散對南美白對蝦的安全性，從而提出受試藥物的不良反應(yīng)及臨床應(yīng)用時的注意事項，為天冬糖苷散臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

天冬糖苷散由廣西大學(xué)基礎(chǔ)藥理學(xué)實驗室研發(fā)，廣西普大動物保健品有限公司中試生產(chǎn)，產(chǎn)品批號20190724，100 g/包。

1.2 試驗動物

南美白對蝦450尾，體重（1.69±0.17）g，體長（4.84±0.22）cm，來自廣西南美白對蝦良種基地。南美白對蝦臨床表現(xiàn)健康、采食正常、蝦線正常，暫養(yǎng)于室內(nèi)直徑300 L透明收納箱內(nèi)。水溫（28±1）℃、pH值8、24 h充氧，養(yǎng)殖用水為海水配制，鹽度為25.0‰，每天換水1次，換水量1/4。試驗開始時放于300 L塑料箱中進行分組飼養(yǎng)；每天投喂4次（7：30、12：00、17：00、21：30)，每天投喂量為蝦體重的3%～5%，投喂1 h時后，清除剩余餌料。

1.3 給藥方式

采用與臨床應(yīng)用相同的給藥途徑，拌餌投喂：將餌料粉碎，加入一定劑量的藥物，混勻，再重新制粒，烘干（或者將藥物和拌藥劑一起溶解以后和餌料拌勻，烘干）。按照要求拌餌料，連用35 d，從喂藥開始連續(xù)觀察35 d。

1.4 試驗設(shè)計

450尾試驗蝦隨機分為5組。設(shè)置1個空白對照組和4個試驗劑量組，用藥劑量分別為臨床推薦劑量的1、3、5、10倍量。試驗設(shè)計見表1.

表1 試驗設(shè)計Tab.1 Test design

1.5 臨床體征

試驗期間觀察南美白對蝦是否出現(xiàn)與藥物相關(guān)的不良反應(yīng)，如體色、游動狀態(tài)等情況變化。從給藥開始連續(xù)觀察35 d，記錄南美白對蝦是否出現(xiàn)死亡。若出現(xiàn)死亡，將死亡蝦肝胰腺使用4%甲醛固定，用于石蠟固定，HE染色切片觀察。

1.6 樣品采集及前處理

分別在給藥第17 d、第35 d，每組取40尾蝦，5%檸檬酸三鈉無菌抗凝采集血淋巴，每2尾蝦合成一個血液樣品，2 000 r/min離心5 min，取上層血清，-20℃保存，用于血液生化指標(biāo)分析；同時，采集肝胰腺，置于4%福爾馬林固定，用于組織學(xué)觀察。

1.7 測定指標(biāo)及方法

1.7.1 生長性能

分別于試驗前、試驗第17 d、第35 d對受試蝦稱體重、肝胰腺重量，量體長，計算其肝體比、體長增長率、體重增長率。

1.7.2 血液生化指標(biāo)

取抗凝血用于檢測肌酐（CRE）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、總蛋白（TP）、甘油三酯（TG）等指標(biāo)，具體方法參考南京建成生物工程研究所相關(guān)試劑盒說明書。

1.7.3 病理組織學(xué)檢查

取4%甲醛固定后的肝胰腺，石蠟包埋切片、HE染色，鏡檢，拍照，觀察肝胰腺中各細胞形態(tài)的變化。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0進行單因素方差分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 天冬糖苷散靶對南美白對蝦體指數(shù)的影響（見表2）

表2 天冬糖苷散對南美白對蝦體指數(shù)的影響Tab.2 Effect of TianDongTangGan powder on Litopenaeusvannamei body index(n=40)

由表2可知，連續(xù)飼喂不同劑量天冬糖苷散17 d時，1倍劑量組南美白對蝦體重、增重率、肝胰腺重量均顯著高于對照組（P＜0.05）；3倍劑量組南美白對蝦體長、增長率、肝胰腺重量均顯著低于對照組（P＜0.05），10倍劑量組體長、增長率、體重、增重率均顯著低于對照組（P＜0.05），但是其肝體比顯著高于對照組（P＜0.05），體重顯著低于其余各組（P＜0.05），但是肝體比顯著高于其余各組（P＜0.05）。

連續(xù)飼喂不同劑量天冬糖苷散35 d時，1倍劑量組南美白對蝦體長、增長率、體重、增重率顯著高于對照組（P＜0.05）；各給藥組肝胰腺重量、肝體比均顯著高于對照組（P＜0.05）；10倍劑量組體長、增長率、體重、增重率均顯著低于對照組（P＜0.05）。結(jié)果表明，連續(xù)飼喂35 d推薦劑量1、3、5倍的天冬糖苷散，可以不同程度地提高南美白對蝦的體重、肝胰腺重量以及肝體比，促進其生長，1倍劑量效果最好，但10倍天冬糖苷散推薦劑量對南美白對蝦生長有一定的影響。

2.2 天冬糖苷散靶對南美白對蝦血液生化指標(biāo)的影響（見表3）

表3 天冬糖苷散靶對蝦血液生化指標(biāo)的影響Tab.3 Effect of TianDongTangGan powder on Litopenaeus vannamei blood biochemical indexes（n=20）

由表3可知，連續(xù)飼喂不同劑量天冬糖苷散17 d時，與空白對照相比，各給藥組南美白對蝦的血淋巴中肌酐、甘油三酯、總蛋白含量及谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性差異不顯著（P＞0.05），5倍、10倍劑量組南美白對蝦的血液中谷草轉(zhuǎn)氨酶活性顯著高于對照組（P＜0.05），1倍劑量組谷草轉(zhuǎn)氨酶活性顯著低于對照組（P＜0.05）；1倍、3倍、5倍、10倍劑量組尿素氮含量顯著高于對照組（P＜0.05）。

連續(xù)飼喂不同劑量天冬糖苷散35 d時，只有5倍、10倍劑量組南美白對蝦血液中的尿素氮含量顯著高于對照組（P＜0.05）；在連續(xù)給藥35 d時，3倍、10倍劑量組肌酐含量顯著低于對照組（P＜0.05）。結(jié)果表明，在連續(xù)飼喂正常劑量不同倍數(shù)的天冬糖苷散35 d，5倍、10倍劑量對南美白對蝦有一定的影響。

2.3 肝胰腺組織病理切片結(jié)果（見圖1）

由圖1可知，在連續(xù)飼喂正常劑量不同倍數(shù)的天冬糖苷散后，各組肝胰腺形態(tài)于空白對照組相比，形態(tài)正常，僅10倍劑量組肝胰腺細胞與底膜分離間距增大，但其形態(tài)完整。

圖1 第35 d肝胰腺病理切片圖（HE，400 x）Fig.35 d hepatopancreas pathological section(HE,400 x)

3 討論

天冬糖苷散是由天門冬多糖和三七總皂苷按照一定比例混合而成。方中天冬是一味具有治療肺部疾病的常用中藥，味苦、平，入肺腎經(jīng)，主治陰虛發(fā)熱、咳嗽吐血、肺癰、咽喉腫痛、便秘、小便不利等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，天冬中含有甾體皂苷、多糖、氨基酸等有效成分，天門冬多糖是主要有效活性成分之一。

李夢鈺等[8]通過掃描電鏡和原子力顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)天門冬多糖構(gòu)象為球形聚集狀、結(jié)構(gòu)緊實；熱學(xué)特性結(jié)果顯示，天門冬多糖具有較高的熱穩(wěn)定性，為其多領(lǐng)域的開發(fā)提供參考依據(jù)。藥效學(xué)研究表明，天門冬多糖可以活化巨噬細胞、顯著增加單核-巨噬細胞的百分?jǐn)?shù)、增強單核-巨噬細胞的吞噬能力、誘導(dǎo)分泌多種細胞因子促進炎癥反應(yīng)、增強機體的免疫應(yīng)答[9]。趙怡等[10]研究發(fā)現(xiàn)，天門冬多糖能顯著提高環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠血液中細胞因子IFN-γ的水平和脾臟指數(shù)，表明天門冬多糖具有增強小鼠免疫功能的作用。張文勝[11]研究表明，天門冬多糖對骨髓來源的抑制性細胞（MDSCs）和細胞系（MSC-2）均有明顯的抑制作用；而對原代淋巴細胞卻有促進作用。胡國明等[12]研究發(fā)現(xiàn)，天門冬多糖注射液能夠明顯增加試驗雞的平均日增重，促進雞的生長發(fā)育，是一種有效、安全的免疫增強劑。

三七總皂苷也是三七中發(fā)揮主要藥效作用的活性物質(zhì)，具有清除自由基、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用。研究表明，三七總皂苷可以直接抑制線粒體中活性氧的生成與累積，從而提高抗氧化應(yīng)激能力[13]。姜輝等[14]研究發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷能顯著抑制促炎因子的分泌，減輕大鼠肝纖維化程度，保護大鼠的免疫器官。馮曉異等[15]也發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷可有效降低非酒精性脂肪肝大鼠轉(zhuǎn)氨酶活性及血脂指標(biāo)，同時可以抑制NO/iNOS/NF-κB信號通路，減少肝損傷。陳毓等[16]研究表明，三七總皂苷具有較好的安全性，且在體外具有一定的細胞免疫活性和誘生細胞因子的能力，為三七作為免疫調(diào)節(jié)劑的開發(fā)提供新的參考依據(jù)。

以上研究均表明，天冬和三七總皂苷具有一定的抗炎和調(diào)節(jié)免疫能力的作用。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，天冬糖苷散具有提高南美白對蝦免疫能力，并具有提高其抗急性氨氮應(yīng)激的作用。

靶動物安全性試驗是新獸藥臨床試驗研究的重要部分。采用不同劑量的天冬糖苷散飼喂南美白對蝦，觀察其精神狀態(tài)等，檢測生理、生化及體重等相關(guān)指標(biāo)的變化，如肌酐、尿素氮、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶等指標(biāo)數(shù)值的變化，評價天冬糖苷散對南美白對蝦的生理、生化系統(tǒng)的影響，研究不同劑量天冬糖苷散對南美白對蝦的不良反應(yīng)，為提供天冬糖苷散的臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。在本試驗中，將不同劑量的天冬糖苷散連續(xù)飼喂南美白對蝦35 d后，1、3、5倍劑量組在一定程度上能促進南美白對蝦的生長和肝胰腺發(fā)育水平；血液生化指標(biāo)結(jié)果顯示，1、3倍劑量組對南美白對蝦血液生化指標(biāo)及肝胰腺無顯著影響。3、5倍劑量組尿素氮、肌酐數(shù)值偏高，而總蛋白數(shù)值平穩(wěn)，說明天冬糖苷散對肝胰腺有一定的影響。此外，病理組織學(xué)切片結(jié)果顯示，除10倍劑量組，各給藥組與空白對照組無明顯差別，肝胰腺細胞結(jié)構(gòu)完整，無明顯損傷；10倍劑量組蝦肝胰腺細胞與底膜有明顯分離，但仍結(jié)構(gòu)完整、無破裂、壞死等現(xiàn)象。表明1～5倍劑量天冬糖苷散連續(xù)飼喂南美白對蝦35 d，對肝胰腺無不良影響，安全性較好。

4 結(jié)論

南美白對蝦連續(xù)飼喂1、3、5倍臨床推薦劑量的天冬糖苷散35 d后，可以提高南美白對蝦的體長、增長率、體重、增重率和肝胰腺重量以及肝體比；10倍推薦劑量對南美白對蝦生化及肝胰腺有一定的影響；但病理組織學(xué)切片結(jié)果顯示，10倍劑量組肝胰腺無實質(zhì)性的損傷。研究表明，天冬糖苷散在1～5倍臨床推薦劑量下使用安全可靠。