食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)中致瀉性大腸埃希氏菌PFGE 的應(yīng)用價(jià)值分析

何旭鑫，次仁卓瑪，史二麗，陳洲斯，楊 洋，吉 拉，巴桑拉姆

（1 承德市疾病預(yù)防控制中心 河北 承德 067000）

（2 阿里疾病預(yù)防控制中心 西藏 阿里 859000）

大腸埃希氏菌又叫大腸桿菌（Escherichia coli），是Escherich 在1885 年人類和動(dòng)物的腸道里發(fā)現(xiàn)的，其生存條件廣泛。生活在腸道里的大腸埃希氏菌屬于正常寄居性菌群，而且還能合成V i t B 和K 產(chǎn)生大腸菌素，是不可缺少單細(xì)胞生物體。當(dāng)機(jī)體抵抗力下降或侵入腸外組織或器官時(shí)，可作為條件致病菌而引起腸道外的感染[1]。主要表現(xiàn)為人體和多種動(dòng)物的胃腸道感染、尿路炎癥、敗血癥、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎等多種局部器官組織發(fā)生病變，常見疑似引起發(fā)生食源性食物中毒的食品包括熟肉制品、蛋制品、涼菜、牛乳、蔬菜、水果等，因此加強(qiáng)對(duì)大腸埃希氏菌的致病性及檢測(cè)方法的研究，加強(qiáng)食品中致瀉性大腸埃希氏的監(jiān)測(cè)對(duì)食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)及防控具有重要意義。

脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）是一種基于分子水平的分型方法，是一種分離大分子DNA 或者染色體的方法。在普通的凝膠電泳中，大的DNA 分子（＞10kb）移動(dòng)速度接近，很難分離形成足以區(qū)分的條帶。在脈沖場(chǎng)凝膠電泳中，電場(chǎng)不斷在兩種方向（有一定夾角，而不是相反的兩個(gè)方向）變動(dòng)。DNA 分子帶有負(fù)電荷，會(huì)朝正極移動(dòng)。相對(duì)較小的分子在電場(chǎng)轉(zhuǎn)換后可以較快轉(zhuǎn)變移動(dòng)方向，而較大的分子在凝膠中轉(zhuǎn)向較為困難。因此小分子向前移動(dòng)的速度比大分子快。脈沖場(chǎng)凝膠電泳可以用來分離大小從10 kb 到10 Mb 的DNA 分子。近年來被廣泛應(yīng)用于疾病預(yù)防控制現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)分析調(diào)查研究[2-3]。PFGE 具有效果性好，敏感力強(qiáng)，被譽(yù)為細(xì)菌分子生物學(xué)分型技術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，已廣泛應(yīng)用于分子流行病學(xué)研究，用于分析菌株之間的相關(guān)性，協(xié)助追蹤傳染源，在疫情控制方面發(fā)揮著重要的作用。本文主要對(duì)近年在食品中分離的致瀉性大腸埃希氏菌進(jìn)行基因分型和流行病分析。通過對(duì)致瀉性大腸埃希氏菌的毒力基因和PFGE 的基因分析，以達(dá)到對(duì)食品中致瀉性大腸埃希氏菌的流行狀況及傳染源的追蹤進(jìn)行判斷，對(duì)防治和減弱致瀉性大腸埃希菌的爆發(fā)提供有效數(shù)據(jù)。

1.材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1監(jiān)測(cè)依據(jù) 根據(jù)《中華人民共和國(guó)食品安全法》（以下簡(jiǎn)稱《食品安全法》）和《河北省衛(wèi)生部門食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)方案》的要求，掌握我市市售食品中主要污染物及有害因素的污染指標(biāo)和方向，明確導(dǎo)致危害因素的分布和疑似來源，收集和分析主要食源性疾病的發(fā)病及流行趨勢(shì)，為開展食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和標(biāo)準(zhǔn)制定、修訂及跟蹤評(píng)價(jià)等工作提供有效保障。發(fā)現(xiàn)食源性疾病安全隱患，及時(shí)通報(bào)食品安全相關(guān)監(jiān)管部門，采取適當(dāng)?shù)娘L(fēng)險(xiǎn)預(yù)警和監(jiān)管嚴(yán)查[4]。

1.1.2 采樣要求 常規(guī)監(jiān)測(cè)。以獲得連續(xù)性、代表性數(shù)據(jù)為目的，了解大宗食品中食源性疾病有害因素的污染情況、污染趨勢(shì)和地域分布，并為食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、標(biāo)準(zhǔn)制定、修訂及跟蹤評(píng)價(jià)提供數(shù)據(jù)。風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)包含食品中重金屬元素、生物毒素、農(nóng)藥殘留等，監(jiān)測(cè)產(chǎn)品包含水產(chǎn)及其加工品、蔬菜及其制品、肉與肉制品等。專項(xiàng)監(jiān)測(cè)。以發(fā)現(xiàn)食品安全隱患及線索、對(duì)發(fā)現(xiàn)的食品安全問題進(jìn)行溯源為目的，包括兩種類型，一是針對(duì)特定食品的探索性、針對(duì)性監(jiān)測(cè)，對(duì)可疑存在的食品安全風(fēng)險(xiǎn)問題并給食品安全監(jiān)督管理提供可靠證據(jù)；二是針對(duì)生產(chǎn)加工過程的監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)可能存在的污染源，為標(biāo)準(zhǔn)（生產(chǎn)加工規(guī)范）的制定、修訂及跟蹤評(píng)價(jià)提供數(shù)據(jù)。本市及各縣區(qū)采集本地產(chǎn)樣品的數(shù)量應(yīng)不低于方案任務(wù)量90%，盡可能全包含市售所有定性包裝和散裝食品，優(yōu)先考慮本地生產(chǎn)的品類。要綜合判斷承德市食品生產(chǎn)加工和居民消費(fèi)等實(shí)際原因，規(guī)范合理的研究采樣程序方案，避免集中采樣，樣品采集應(yīng)覆蓋我市八縣三區(qū)超市、市場(chǎng)及鄉(xiāng)村零售店、點(diǎn)，采樣點(diǎn)和采樣時(shí)間要保持相對(duì)固定。要嚴(yán)格按照監(jiān)測(cè)方案開展監(jiān)測(cè)，不得擅自變更監(jiān)測(cè)食品類別、監(jiān)測(cè)時(shí)間、采樣地點(diǎn)等，做好質(zhì)量控制，保證監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)真實(shí)、準(zhǔn)確，按時(shí)上報(bào)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)。

1.1.3 菌株來源 2018 年3 月—2019 年12 月食品污染物監(jiān)測(cè)中分離并保存的19 株致瀉性大腸埃希氏菌株。致瀉性大腸埃希氏菌株由河北省疾控中心細(xì)菌病防治與消毒所提供。

1.2 檢驗(yàn)項(xiàng)目

致瀉性大腸埃希氏菌、五種（EPEC、ETEC、EIEC、EAEC、EHEC）致瀉性大腸埃希氏菌毒力基因檢測(cè)、PFGE。

1.2.1 主要儀器 恒溫培養(yǎng)箱、核酸提取儀、ABI7500 熒光定量PCR 儀、電泳儀、凝膠成像儀。

1.2.2 主要試劑 江蘇碩世五種致瀉大腸埃希氏菌反應(yīng)體系試劑盒、血平板、PFGE 專用瓊脂糖（Seakem Gold Agarose）為美國(guó) Lonza 公司產(chǎn)品；細(xì)胞懸浮液（CSB）和細(xì)胞裂解液（CLB）均為新鮮配制。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)好的細(xì)菌包埋于瓊脂塊中，用適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶在原位對(duì)整個(gè)細(xì)菌染色體進(jìn)行酶切，酶切片段在特定的電泳系統(tǒng)中通過電場(chǎng)方向不斷交替變換及合適的脈沖時(shí)間等條件下而得到良好的分離。PFGE 中內(nèi)切酶的選用是非常關(guān)鍵的一步，所采用的內(nèi)切酶常為寡切點(diǎn)酶（low frequency cleavagerestric-tionendoucleases），酶切后的片段少而大，適合于作PFGE 電泳。所試驗(yàn)的19 個(gè)細(xì)菌的染色體中，被1 個(gè)或多個(gè)可識(shí)別CTAG 位點(diǎn)的內(nèi)切酶酶切，每100000bps 中不到一次，所產(chǎn)生酶的識(shí)別序列分別為：Xba Ⅰ（TCTAGA），Sep Ⅰ（ACTAGT），Avr Ⅱ（CCTAGG）和Nhe Ⅰ（GCTAGC）。同樣地，在許多含G+C<45% 的基因組，CCG 和CGG 更 少。這樣用Sma Ⅰ（CCCGGGG）、R sr Ⅱ（CGGWCGG）、Nae Ⅰ（GCCGGC）和Sac Ⅱ（CCGCGG）進(jìn)行酶切，產(chǎn)生平均超過100000bps 片段.

1.3.2 毒力基因檢測(cè) 依據(jù)江蘇碩世的試劑盒對(duì)五種致瀉進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 PFGE 分型 PFGE 的操作方法按照中國(guó)疾病預(yù)防控制中心提供的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行[8]，PFGE 電泳圖譜用Bio Numerics 進(jìn)行軟件分析。

2.結(jié)果

2.1 毒力基因結(jié)果

19 株致瀉性大腸埃希氏菌結(jié)果為4 株ETEC、7 株EPEC、8 株EAEC。

2.2 PFGE 結(jié)果

從圖1 中可以看出 CD109、CD113，CD145、CD197，CD042、CD136 等相似數(shù)均＞90%。結(jié)合樣品的采集地點(diǎn)和采集種類分析、以上樣品均為一個(gè)品種、來源于一個(gè)采集地點(diǎn)。

圖1 PFGE 結(jié)果圖

3.討論與分析

傳統(tǒng)的細(xì)菌表型分型易受環(huán)境因素和菌株變異的影響，且實(shí)驗(yàn)室重復(fù)性和靈敏度等指標(biāo)也不能滿足現(xiàn)代疾病預(yù)防控制的要求[5]。隨著分子分型生物科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PFGE 在菌株鑒定分型、同源性追蹤、傳染病病原溯源及流行病調(diào)查等方面發(fā)揮著越來越重的作用[6]。

本次實(shí)驗(yàn)中19 株致瀉性大腸埃希氏菌，經(jīng)五種致瀉大腸埃希氏菌熒光PCR 檢測(cè)，檢驗(yàn)結(jié)果為4 株ETEC、7株EPEC、8 株EAEC。PFGE 溯源檢測(cè)分析CD109、CD113，CD145、CD197，CD042、CD136 等相似數(shù)均＞90%，屬同一克隆體系。結(jié)合食品樣品的采集地點(diǎn)、與采集種類分析。以上樣品均來自同一采集地點(diǎn)和同一品種。說明致瀉性大腸埃希氏菌的優(yōu)勢(shì)株已存在于本地區(qū)、在食品加工、銷售、運(yùn)輸環(huán)節(jié)存在紕漏、使某一地點(diǎn)和相鄰地點(diǎn)的同一品種增加了致瀉性大腸埃希氏菌的感染機(jī)會(huì)[7]。因此，衛(wèi)生監(jiān)督管理機(jī)構(gòu)應(yīng)該注重平時(shí)執(zhí)法監(jiān)督、加強(qiáng)對(duì)從業(yè)人員的健康宣傳教育、從源頭上減少或杜絕食品安全問題的發(fā)生。通過此項(xiàng)目的開展可以證實(shí)PFGE 可實(shí)現(xiàn)菌株有效鑒別和溯源、對(duì)已檢測(cè)出的疫情暴發(fā)原因進(jìn)行傳染源跟蹤調(diào)查、預(yù)防同源性食源性疾病的再次發(fā)生等工作中具有重要的意義[8]。