響應(yīng)曲面法優(yōu)化羅伊氏乳桿菌冷凍干燥保護(hù)劑的配比

秦鵬　謝鵬　劉廣宇　梁宏基　梁淑娃

摘要[目的]提高羅伊氏乳桿菌在冷凍干燥過程中的存活率。[方法]采用響應(yīng)曲面法，對(duì)羅伊氏乳桿菌凍干保護(hù)劑中低聚果糖、脫脂乳粉和海藻糖這3種主要成分進(jìn)行了研究，探討羅伊氏乳桿菌最優(yōu)化的凍干保護(hù)劑配方。[結(jié)果]建立的回歸模型達(dá)到極顯著水平，無失擬因素存在。優(yōu)化的保護(hù)劑配方為：低聚果糖 2.66%、脫脂乳粉10.11%、海藻糖5.90%，凍干存活率達(dá)到89.43%，較優(yōu)化前提高了13.76%。[結(jié)論]響應(yīng)曲面法可用于羅伊氏乳桿菌冷凍干燥保護(hù)劑的工藝參數(shù)配比優(yōu)化，為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 羅伊氏乳桿菌；凍干保護(hù)劑；響應(yīng)曲面法；存活率

中圖分類號(hào) TS201.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2016）05-006-02

Abstract[Objective]To increase the survival rate of Lactobacillus reuteri after lyophilization.[Method]Response surface methodology was used to investigate the three main components， such as fructooligosaccharide， dried skim milk and trehalose. The optimum formula of lyophilizing protectants for L. reuteri was obtained.[Result]The regression model reached extremely significant level with no factor of lack of fit. The optimized formula was 2.66% fructooligosaccharide， 10.11% dried skim milk and 5.90% trehalose. The survival rate of L. reuteri after lyophilization was 89.43% ， which increased by 13.76%.[Conclusion]Response Surface Method can be used for the optimization of formula of lyophilizing protectants of L. reuteri， which lays foundation for the industrialized production.

Key words Lactobacillus reuteri； Lyophilizing protectants； Response surface method； Survival rate

羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）是普遍存在于人類和大部分動(dòng)物腸道中的益生菌。它可以代謝產(chǎn)生有機(jī)酸、雙乙酰、過氧化氫、細(xì)菌素及類細(xì)菌素等物質(zhì)[1-2]，能夠有效抑制病原菌和腐敗菌，維持體內(nèi)道微生態(tài)平衡，且安全無毒副作用，具有耐酸、耐膽鹽和腸道定殖等特性。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明羅氏乳桿菌沒有安全性方面的問題[3]。目前，羅伊氏乳桿菌已被世界各國批準(zhǔn)使用，是國際上公認(rèn)的新型益生乳酸菌，具有很高的理論研究和生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值[4]。我國衛(wèi)生部于 2003 年批準(zhǔn)了羅伊氏乳桿菌作為人類保健品的微生物菌種。

目前，商品化的羅伊氏乳桿菌制劑，具有較高的細(xì)胞存活數(shù)量和較高的細(xì)胞活力，能更充分地發(fā)揮乳酸菌的功能性質(zhì)[5]，通常使用冷凍干燥的方法來制備。但是，目前對(duì)人用羅伊乳桿菌的冷凍干燥技術(shù)研究的報(bào)道少之又少。使用適宜的凍干保護(hù)劑[6-8]是提高凍干過程菌體存活率的關(guān)鍵之一，也是制備高活性凍干菌劑的重要一環(huán)。

響應(yīng)面分析法試驗(yàn)次數(shù)少、周期短，求得的回歸方程精確度高，可以研究幾個(gè)因素的交互作用，是降低生產(chǎn)成本，優(yōu)化生產(chǎn)工藝條件的一種有效方法。近年來，響應(yīng)面分析法受到越來越多的重視，并成功應(yīng)用到農(nóng)業(yè)、生物、食品等領(lǐng)域[9]。筆者采用響應(yīng)曲面法對(duì)羅伊氏乳桿菌冷凍干燥保護(hù)劑進(jìn)行了研究，探索最優(yōu)化的保護(hù)劑組分，以提高凍干過程的菌體存活率。

1 材料與方法

1.1 菌種

羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri），由廣州市微生物研究所保藏。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 活化培養(yǎng)基。蛋白胨 1%、牛肉膏 1%、酵母浸粉0.5%、葡萄糖 2%、磷酸氫二鉀 0.2%、檸檬酸氫二銨 0.2%、乙酸鈉 0.5%、硫酸鎂 0.05%、瓊脂2%、pH 6.2～6.4。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基。蛋白胨 1%、牛肉膏 1%、酵母浸粉1%、葡萄糖 2.5%、磷酸氫二鉀 0.2%、檸檬酸氫二銨 0.2%、乙酸鈉 0.5%、硫酸鎂 0.05%、吐溫80 0.1%、pH 6.2～6.4。

1.3 主要試劑

低聚果糖和海藻糖為生化試劑，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；脫脂乳粉為食品級(jí)，購自新西蘭恒天然集團(tuán)。

1.4 羅伊氏乳桿菌的培養(yǎng)及凍干

取羅伊氏乳桿菌凍存管，接種于活化培養(yǎng)基，37 ℃下厭氧靜置培養(yǎng) 12～24 h。挑取具有典型形態(tài)的菌落，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃下厭氧培養(yǎng) 24 h ，5 000 r/min條件下離心10 min，收集菌泥；加入適量生理鹽水重新懸浮。在上述菌懸液中，加入不同組別的凍干保護(hù)劑，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，取樣檢測(cè)活菌數(shù)；然后，分裝于西林瓶中，每瓶2 mL，每組5個(gè)重復(fù)。將各組樣品置于-40 ℃冰箱中預(yù)冷4 h，然后置于預(yù)冷的冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥16～18 h。凍干過程中觀察不同凍干劑組水分升華快慢情況，待全部樣品冷凍干燥充分后取出樣品，取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.5 檢測(cè)方法

采用稀釋倒平板法測(cè)定乳酸菌菌落總數(shù)，具體原理和步驟參考《GB 4789-2010》[10]中乳酸菌菌落總數(shù)的測(cè)定方法，按照以下公式計(jì)算：

Rc（%）=CtC0×100

式中，Rc為冷凍干燥后羅伊氏乳桿菌的存活率，Ct為冷凍干燥后的活菌數(shù)，C0為冷凍干燥前的活菌數(shù)。

1.6 冷凍干燥保護(hù)劑的優(yōu)化

根據(jù)前期的研究結(jié)果，選取低聚果糖、脫脂乳粉和海藻糖這3個(gè)因子作為研究對(duì)象，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，以存活率（Rc）作為試驗(yàn)的響應(yīng)值，使用Design expert 7.5進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析。中心組合試驗(yàn)實(shí)際的因素與水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表2 。對(duì)表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析。方差分析表明，所選模型的F=100.255 9，P<0.000 1說明因變量Rc與全體變量之間的回歸關(guān)系顯著，也即模型回歸顯著。R2=0.989，說明因變量Rc與全體變量之間的線性關(guān)系顯著。失擬項(xiàng)F=4.443，P=0.063 7>0.01，差異不顯著，說明試驗(yàn)預(yù)測(cè)值和實(shí)際值相吻合，試驗(yàn)擬合性好，試驗(yàn)誤差小。該研究中的變異系數(shù)為1.52%，而變異系數(shù)反映模型的置信度，其越低模型的置信度越高，說明模型方程能很好地反映真實(shí)的試驗(yàn)值，可用于預(yù)測(cè)酵素發(fā)酵過程中發(fā)酵液活菌數(shù)。根據(jù)模型得到的回歸方程為 Rc=85.154+4.110×A+3.859×B+5.547×C-2.05×A×B-1.3×A×C-2.15×B×C-2.125×A2-4.282×B2-2.532×C2。

對(duì)回歸方程的方差分析表明，因素A（低聚果糖）和B（脫脂乳粉）的交互作用（P=0.000 7<0.01）及因素B（脫脂乳粉）和C（海藻糖）的交互作用（P=0.000 5<0.01）對(duì)冷凍干燥后羅伊氏乳桿菌的存活率的影響顯著。

從圖1～3可以看出，響應(yīng)曲面呈傘形，中心凸起，說明2因素之間的影響基本呈拋物線型關(guān)系，均有一個(gè)極大值點(diǎn)，呈先增大后減小的趨勢(shì)。如果體系中保護(hù)劑的添加量過低，會(huì)有大量細(xì)胞裸露在介質(zhì)中，在凍干時(shí)就可能改變細(xì)胞通透性，不能起到保護(hù)菌體的作用；反之，體系中保護(hù)劑太多，細(xì)胞的滲透壓和通透性也會(huì)受影響，進(jìn)而導(dǎo)致存活率下降。

以上分析表明，存在適宜的低聚果糖、脫脂乳粉和海藻糖濃度使得冷凍干燥過程中菌存活率Rc最高。最優(yōu)化條件為：低聚果糖 2.66%、脫脂乳粉10.11%、海藻糖5.90%，在此條件下預(yù)測(cè)的響應(yīng)值（Rc）可達(dá)89.13%。

2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證預(yù)測(cè)值與真實(shí)值之間的擬合程度，使用上述優(yōu)化條件在搖瓶水平上進(jìn)行了重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)：低聚 果糖 2.66%、脫脂乳粉10.11%、 海藻糖5.90%。試驗(yàn)按優(yōu)化前和優(yōu)化后的配方進(jìn)行，3次重復(fù)。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，優(yōu)化前羅伊爾乳桿菌的存活率分別為75.8%、77.3%和73.9%（平均值為75.7%）；優(yōu)化后羅伊爾乳桿菌的存活率為89.4%、88.7%和90.2%（平均89.4%），較優(yōu)化前提高了13.76%，說明試驗(yàn)值與軟件預(yù)測(cè)值的擬合性良好。

3 討論與結(jié)論

國內(nèi)對(duì)羅伊氏乳桿菌凍干保護(hù)劑的研究較少。朱戰(zhàn)波等[11]使用二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)法對(duì)1株豬源羅伊氏乳桿菌進(jìn)行了凍干保護(hù)劑的優(yōu)化研究，凍干存活率達(dá)到71.6%。

筆者以乳桿菌制劑的冷凍干燥工藝中的凍干存活率為研究對(duì)象，通過響應(yīng)曲面法建立了凍干保護(hù)劑低聚果糖、低脂乳粉和海藻糖與存活率Rc的關(guān)系，并實(shí)現(xiàn)條件優(yōu)化。最優(yōu)條件如下：低聚果糖 2.66%、脫脂乳粉10.11%、 海藻糖5.90%，存活率預(yù)測(cè)值為89.13%。通過驗(yàn)證試驗(yàn)證實(shí)該設(shè)計(jì)方法是切實(shí)可行的，優(yōu)化后羅伊爾乳桿菌的存活率達(dá)到89.43%，且與模型預(yù)測(cè)值非常接近；羅伊爾乳桿菌的存活率較優(yōu)化前提高了13.76%，優(yōu)于朱戰(zhàn)波等[11]的試驗(yàn)結(jié)果，為羅伊氏乳桿菌冷凍干燥工藝的開發(fā)與優(yōu)化提供了研究基礎(chǔ)。

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