針刀干預(yù)對膝骨關(guān)節(jié)炎兔股二頭肌細(xì)胞凋亡的影響*

謝汶姍，王 彤，陳烯琳，付昕怡，郭長青

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA)是引起人類關(guān)節(jié)紊亂的常見原因。中國膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率很高,接近20%,男女均可患病,尤以女性更易患病[1-2]。膝關(guān)節(jié)的運(yùn)動(dòng)穩(wěn)定性對于人的走、跑、跳等基本動(dòng)作均十分重要,而且保護(hù)膝關(guān)節(jié)周圍的肌肉群對于膝關(guān)節(jié)保持其運(yùn)動(dòng)穩(wěn)定性也具有重大意義。通過共同的肌肉收縮作用主動(dòng)地控制著整個(gè)膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定運(yùn)動(dòng)狀態(tài),從而有效預(yù)防膝關(guān)節(jié)因運(yùn)動(dòng)而造成的損傷[3]。骨骼肌細(xì)胞的凋亡是人體維持骨骼肌正常的生理功能與其生長發(fā)育成熟過程中不可缺少的組成部分,在膝關(guān)節(jié)肌肉的損傷和軟組織的修復(fù)中發(fā)揮作用[4-5]。由于膝關(guān)節(jié)主要行使具有屈曲收縮功能的膝關(guān)節(jié)肌肉,對比于股四頭肌而言研究文獻(xiàn)較少。針刀療法直接治療的對象大多為膝關(guān)節(jié)的肌肉和軟組織,在臨床上治療KOA療效也得到了肯定。本研究從針刀干預(yù)影響股二頭肌細(xì)胞凋亡的角度探討針刀治療KOA可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

穴位刺激儀(LH202H,北京華為產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司)；FS/FAS5030石蠟切片機(jī)(德國LETIZ公司)；光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司);凝膠成像系統(tǒng)(Gel Doc 2000,美國Bio-Rad公司);紫外分光光度儀(Biophotometer,德國eppendorf公司);Fresco低溫冷凍離心機(jī)(美國Thereto公司);液氮及便攜式標(biāo)本貯藏罐(北京中醫(yī)藥大學(xué))；水平脫色搖床(其林貝爾);酸度計(jì)pH211(意大利Hanna公司);電動(dòng)組織勻漿器(上海源葉生物科技有限公司)。

1.2 主要試劑

TUNEL試劑盒(德國羅氏公司)?？禐槭兰o(jì)兔/鼠通用型Streptavidin-HRP試劑盒(帶DAB顯色液,貨號:CW2069,批號:1403030031),內(nèi)含:①內(nèi)源性過氧化物酶封閉液(試劑1);②封閉用正常羊血清工作液(試劑2);③生物素標(biāo)記羊抗兔/鼠二抗工作液(試劑3);④HRP標(biāo)記的鏈霉親和素(試劑4，紅色液體)。檸檬酸抗原修復(fù)沖液(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。PBS磷酸鹽緩沖液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,貨號:ZLI-9062)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新西蘭雄兔48只(scxk京2018-0100,北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖研究中心),飼養(yǎng)于附近的北京中醫(yī)藥大學(xué)良鄉(xiāng)大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)房,平均體質(zhì)量大約(3.20±0.2)kg。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，將試驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為正常組(N組)、模型組(M組)、電針組(EA組)和針刀組(A組)。其中每組3只用于補(bǔ)充在造模過程中可能的缺失和造模成功的病理檢測。

1.4 造模方法

采用維德曼左膝伸直制動(dòng)法和固定右膝制動(dòng)法確定了膝骨軟性關(guān)節(jié)炎模型。兩名工作人員將1只兔子固定在操作臺上，操作者抓住實(shí)驗(yàn)兔的左下肢使其完全筆直(膝蓋關(guān)節(jié)180°伸直，踝關(guān)節(jié)60°向后彎)。吸收性棉被包裹在膝關(guān)節(jié)周圍。樹脂繃帶固定兔子的膝蓋和踝關(guān)節(jié)。自上而下的聚合物繃帶用于從大腿根到肚臍外側(cè)螺旋纏繞兩層。整形后，將防疤繃帶從指尖纏繞到腹股溝，并用醫(yī)用綁帶固定。始終保持腳趾裸露，以便隨時(shí)監(jiān)控趾尖的血液流動(dòng)。如果被測動(dòng)物的趾尖嚴(yán)重腫脹或有出血，請立即制作模型并取下模型的內(nèi)部和外部繃帶以松開固定制動(dòng)器。及時(shí)提醒并使用松散的內(nèi)外繃帶包扎8周。確認(rèn)模型成功后，拆下用于成型的內(nèi)部和外部繃帶以釋放制動(dòng)器。

1.5 干預(yù)方法

1.5.1 N組 正常飼養(yǎng)，無需建模，無需干預(yù)。

1.5.2 M組 成功建模后同期進(jìn)行常規(guī)掃盲，無需干預(yù)。

1.5.3 EA組 造模成功1周后開始對穴位進(jìn)行治療,穴位分別選擇:曲泉、委陽、內(nèi)膝眼和外膝眼，取穴參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[6]并結(jié)合動(dòng)物比較學(xué)方法，根據(jù)比較解剖取穴法結(jié)合模擬骨度取穴法，選取膝關(guān)節(jié)上述腧穴進(jìn)行治療。操作方法:將兔固定后,對選取的穴位用常規(guī)毫針進(jìn)行針刺,刺入深度約為5 mm，將曲泉與委陽,內(nèi)膝眼與外膝眼用電子刺針儀分別進(jìn)行連接。然后進(jìn)行頻率2/100 Hz、強(qiáng)度3 mA的疏密波刺激,每次疏密波刺激持續(xù)時(shí)間20 min左右,2 d反復(fù)治療1次,共連續(xù)治療3周。

1.5.4 A組 施術(shù)者在造模成功1周后,先用龍膽紫將穴位按壓處的軟組織進(jìn)行標(biāo)記,然后按照常規(guī)方法備皮、消毒和進(jìn)針,松解2～3下左右出針,用1個(gè)干棉球進(jìn)針點(diǎn)按壓片刻,防止松解和止血。具體操作步驟和方法:①半腱肌、半膜肌肌腱止點(diǎn)進(jìn)針點(diǎn)的操作:手術(shù)者首先以左手的大拇指用力將進(jìn)針點(diǎn)按壓穴位的軟組織處,使肌腱的軟組織緊貼于肌腱骨面上,右手拇指握持針刀,刀刃平行于肌腱,刀體垂直于肌腱的皮膚,緊貼左手進(jìn)針點(diǎn)按壓片刻處防止針刀刺入,然后反復(fù)松解2～3刀后出針,用干棉球按壓片刻防止松解和止血;②股二頭肌肌腱止點(diǎn)進(jìn)針點(diǎn)的操作:同上;③條索結(jié)節(jié)點(diǎn)進(jìn)針點(diǎn)的操作:同上。每次反復(fù)治療15 min,每周1次,共3周。

1.6 取材與樣本處理

治療結(jié)束1周后,采用空氣栓塞法迅速處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,迅速取兔左側(cè)脛骨及膝關(guān)節(jié)下方的股二頭肌,取下左側(cè)股二頭肌上5 mm×5 mm×8 mm的一塊局部方塊組織標(biāo)本,然后置于4%的多聚馬林苯甲酸溶液進(jìn)行方塊組織固定,常規(guī)方塊組織固定切片脫蠟至水,行HE染色。將方塊標(biāo)本取下的左側(cè)股二頭肌進(jìn)行局部方塊組織固定標(biāo)本分兩個(gè)大部分,一部分立即投入10%的福爾馬林苯甲酸溶液進(jìn)行組織固定1周,經(jīng)常規(guī)組織固定步驟處理、石蠟包埋和切片,片厚6 μm，用于TUNEL檢測;一部分置于塑料試管內(nèi)，封蓋，-80 ℃冷凍，用于Western blot檢測。

1.7 HE染色光鏡觀察

固定樣品并進(jìn)行常規(guī)脫水，透明處理，蠟浸，包埋，組織切片，脫蠟，再水化，核染色，曙紅染色，脫水處理和透明蓋玻片。使用光學(xué)顯微鏡觀察骨骼肌和肌肉組織樣品，并在1個(gè)光學(xué)成像顯微鏡下仔細(xì)拍照觀察每組的6個(gè)骨骼肌樣品并對其進(jìn)行拍照。

1.8 TUNEL法檢測頸肌凋亡細(xì)胞核數(shù)

將股二頭肌組織切片脫蠟脫水;內(nèi)源性過氧化物酶阻斷;消化處理;待玻片干燥后分別在玻片上加入50 AITUNEL反應(yīng)混合液和50陰性對照稀釋液。37 ℃于暗處避光孵育1 h。0.01MPBS清洗，2 min×3次。在玻片上滴加PBS液，于515～565 nm處用綠光激發(fā)在熒光顯微鏡下拍照并觀察細(xì)胞，陽性細(xì)胞核呈綠色熒光。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍光學(xué)顯微鏡視野，避免將內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞凋亡陽性細(xì)胞核計(jì)算在內(nèi)，只有陽性細(xì)胞核位于肌細(xì)胞膜以內(nèi)的才計(jì)算為肌細(xì)胞凋亡核，因骨骼肌屬多核細(xì)胞，凋亡肌細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)際為凋亡肌細(xì)胞核計(jì)數(shù)。每張肌肉切片以計(jì)算5次計(jì)數(shù)結(jié)果的平均值作為計(jì)算股二頭肌凋亡陽性細(xì)胞核數(shù)的最后計(jì)算結(jié)果。

1.9 Western blot法檢測兔左側(cè)股二頭肌Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)

細(xì)胞裂解法提取兔股直肌組織總蛋白，BCA法測蛋白濃度，經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉；孵育一抗，孵育1 h或過夜；孵育二抗1 h；洗膜；孵育底物；顯色的過程。用UAPDH做內(nèi)參重復(fù)以上步驟。采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析圖像，以Bax/UAPDH、Caspase-3/UAPDH比值分別表示目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 HE染色光鏡觀察

光學(xué)顯微鏡顯示，經(jīng)HE染色后，細(xì)胞胞漿呈粉紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色。N組中肌肉纖維的大小是均勻分布的，細(xì)胞之間的間隔均勻，并且在基質(zhì)中沒有觀察到明顯的水腫和炎性肌細(xì)胞的浸潤。M組中在細(xì)胞外物質(zhì)中可以觀察到許多肌纖維萎縮，水腫和炎性肌細(xì)胞浸潤。EA組中可見少量的肌纖維被溶解，細(xì)胞核和間質(zhì)組織的水腫、炎性肌細(xì)胞與M組相比有所改善。A組中肌纖維較完整，細(xì)胞核和間質(zhì)組織的水腫、炎性肌細(xì)胞與M組相比顯著改善，改善程度優(yōu)于EA組。見圖1。

注：1-A:正常組;1-B:模型組;1-C:電針組;1-D:針刀組。圖1 各組股二頭肌HE染色光鏡觀察結(jié)果

2.2 針刀干預(yù)對KOA兔股二頭肌陽性細(xì)胞核計(jì)數(shù)的影響

光鏡下觀察結(jié)果，N組切面陽性熒光凋亡核數(shù)較少。M組切面可見大量陽性熒光凋亡細(xì)胞核，分布集中呈串珠狀排布在骨骼肌細(xì)胞膜下。EA組切面陽性熒光凋亡細(xì)胞核數(shù)較M組有所減少。A組較M組切面陽性熒光凋亡細(xì)胞核數(shù)減少明顯。見圖2。

見表1。M組兔股二頭肌陽性細(xì)胞核數(shù)較N組明顯升高(P<0.01)；EA組較N組陽性細(xì)胞核數(shù)明顯升高(P<0.01)；EA組較M組陽性細(xì)胞核數(shù)有所降低(P<0.05)；A組較N組陽性細(xì)胞核數(shù)明顯升高(P<0.01)；A組較M組明顯降低(P<0.01)；A組較EA組明顯降低(P<0.05)。

表1 各組兔股二頭肌陽性細(xì)胞核數(shù)比較

2.3 針刀干預(yù)對KOA兔股二頭肌Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

2.3.1 針刀干預(yù)對KOA兔股二頭肌Bax蛋白表達(dá)的影響 見表2、圖3。造模后，M組兔股二頭肌Bax蛋白表達(dá)水平較N組升高(P<0.05)；其余各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 股二頭肌Bax蛋白Western blot條帶圖

2.3.2 針刀干預(yù)對KOA兔股二頭肌Caspase-3蛋白表達(dá)的影響 見表2、圖4。造模后，M組兔股二頭肌Caspase-3蛋白表達(dá)水平較N組明顯升高(P<0.01)；EA組與N組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；A組與N組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；EA組較M組有所降低(P<0.05)；A組較M組明顯降低(P<0.01)；A組與EA組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組兔股二頭肌Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較

圖4 股二頭肌Caspase-3蛋白Western blot條帶圖

3 討論

KOA多發(fā)于中老年人,且會(huì)導(dǎo)致患者生活質(zhì)量嚴(yán)重下降,如果不及時(shí)治療可能導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)變形,甚至殘疾。因此,如何提高KOA患者的治療效果成為急需研究的課題之一。針刀的物理治療是通過對經(jīng)筋病變的整個(gè)經(jīng)筋局部進(jìn)行手術(shù)切割和分離達(dá)到活血舒筋的治療作用,恢復(fù)經(jīng)筋病變局部經(jīng)筋的正常組織功能和生理狀態(tài),針刀本著“針至病所”的傳統(tǒng)針灸物理治療基本原則,即用“解結(jié)”的針灸方法直接有效松解經(jīng)筋病變的局部筋結(jié),以利于治療骨疥深邪氣的遠(yuǎn)癖,而不同于采用傳統(tǒng)中醫(yī)針灸的“氣至病所”。

經(jīng)筋與肌肉KOA關(guān)系的理論實(shí)質(zhì)主要為經(jīng)筋肌肉與其他骨骼關(guān)節(jié)病變的相互關(guān)系。曹月龍等[7]的總結(jié)研究提出經(jīng)筋肌肉軟弱、肌力調(diào)節(jié)功能下降及其他肌肉的功能調(diào)節(jié)狀態(tài)的改變與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的機(jī)制、臨床表現(xiàn)和治療方法都有著深刻的密切關(guān)系,提示了經(jīng)筋與肌肉因素是慢性骨關(guān)節(jié)炎診斷和治療的有效方法和靶標(biāo)之一,從調(diào)控經(jīng)筋與肌肉因素的病理學(xué)角度利用經(jīng)筋對研究慢性骨關(guān)節(jié)炎的病理發(fā)生機(jī)制及對研發(fā)有效的治療骨關(guān)節(jié)炎藥物具有重要的意義。

Kerr等[8]在上世紀(jì)70年代就通過觀察蝌蚪異常生長的細(xì)胞凋亡過程發(fā)現(xiàn)了其中的骨骼肌細(xì)胞在身體中進(jìn)行明顯的異常生長凋亡和活動(dòng)過程,骨骼肌細(xì)胞凋亡在骨骼肌肉的損傷和修復(fù)中發(fā)揮的作用意義重大[4-5],多項(xiàng)臨床研究證明大量的骨骼肌細(xì)胞病變都與蝌蚪骨骼肌細(xì)胞的異常生長凋亡和活動(dòng)相關(guān)聯(lián)[9-10]。

線粒體途徑作為細(xì)胞凋亡過程中最主要的途徑主要由Bcl-2家族來進(jìn)行調(diào)節(jié)[11-13]，Bcl-2家族包括抑制凋亡的Bcl-2組蛋白和促凋亡的Bax組蛋白。多項(xiàng)研究[14-15]表明Bcl-2的表達(dá)變化不明顯,而Bcl-2/Bax比值是細(xì)胞凋亡更好的預(yù)測物，若該比值上調(diào),則細(xì)胞凋亡進(jìn)程減慢,反之細(xì)胞凋亡進(jìn)程加速。凋亡途徑的最終目標(biāo)是激活胱天蛋白酶家族，以刺激細(xì)胞凋亡，胱天蛋白酶-3是細(xì)胞凋亡激活的主執(zhí)行者之一，提示進(jìn)入了不可逆階段[15]的細(xì)胞凋亡。

在電針激光鏡下可以同時(shí)觀察得到不同類型和程度的股二頭肌凋亡細(xì)胞損傷與再生細(xì)胞修復(fù)的現(xiàn)象,電針和針刀皆可以有效改善股二頭肌細(xì)胞核和間質(zhì)股二頭肌組織的再生細(xì)胞水腫并有效減輕炎性肌細(xì)胞的浸潤,并且A組效果明顯優(yōu)于EA組。股二頭肌tunel法模型檢測的兩組陽性股二頭肌凋亡細(xì)胞核數(shù)比較在一定的程度上與股二頭肌凋亡細(xì)胞因子的陽性蛋白表達(dá)和凋亡水平的趨勢一致,說明筆者采用了改良后的維德曼左膝伸直制動(dòng)法技術(shù)造成的損傷使KOA模型檢測中的陽性股二頭肌的凋亡細(xì)胞顯著減少和增多。其中針刀的凋亡細(xì)胞干預(yù)結(jié)果明顯降低了陽性股二頭肌細(xì)胞陽性凋亡的細(xì)胞核數(shù)和caspase-3的蛋白表達(dá)和凋亡水平,且其效果明顯優(yōu)于EA組。這一干預(yù)的結(jié)果恰好與崔成埈[16]實(shí)驗(yàn)中所觀察得到的針刀松解可以有效減少檢測中的KOA股直肌凋亡細(xì)胞的陽性凋亡數(shù)量、影響caspase-3的蛋白表達(dá)從而有效抑制KOA股直肌凋亡細(xì)胞的陽性凋亡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致,這也許可以有依據(jù)地說明針刀進(jìn)行干預(yù)的KOA無論是對于屈肌群還是伸肌群,都可以直接影響骨骼肌細(xì)胞的凋亡表達(dá)。而在實(shí)驗(yàn)中對于Bax蛋白表達(dá)的觀察中可以發(fā)現(xiàn)A組與EA組的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Korsmeyer等[17]的觀察和研究中曾提出Bcl-2/Bax的比率是調(diào)控細(xì)胞凋亡的可變電阻器的理論;在學(xué)習(xí)郭長青等[18]用針刀松解術(shù)觀察其對于頸椎病兔頸肌群的細(xì)胞凋亡表達(dá)的影響時(shí),發(fā)現(xiàn)其結(jié)果中針刀組與電針組的比較中兔頸肌群表達(dá)與Bax蛋白的表達(dá)比較中差異幾乎無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而針刀組Bcl-2/Bax的比值較電針組明顯升高。這些可能說明單一的比較Bcl-2或Bax均不能作為判斷肌細(xì)胞凋亡水平的標(biāo)準(zhǔn)，只有兩者的比值——Bcl-2/Bax才具有判斷意義。

本研究提示針刀和電針治療均可以對屈肌群有一定的治療作用，其中針刀干預(yù)對于抑制股二頭肌肌細(xì)胞凋亡從而治療制動(dòng)性膝關(guān)節(jié)損傷有更明顯的效果，或許說明抑制骨骼肌肌細(xì)胞的凋亡可能是針刀治療骨關(guān)節(jié)損傷的機(jī)制之一，這與電針治療骨關(guān)節(jié)損傷的機(jī)制有所不同。