葡萄酒中揮發(fā)性萜烯物質(zhì)的產(chǎn)生機制及影響因素研究進展

張慧敏，潘秋紅,*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部葡萄酒加工重點實驗室，北京 100083）

香氣是衡量釀酒葡萄和葡萄酒品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，優(yōu)質(zhì)葡萄酒的香氣通常有豐富、平衡、典型性突出的特點。目前已在葡萄酒中發(fā)現(xiàn)了800多種香氣成分[1-2]，其中直接來自釀酒葡萄果實的香氣物質(zhì)（品種香）是決定葡萄酒典型性和產(chǎn)地風(fēng)格的重要組分，主要有萜烯類、C13降異戊二烯類、甲氧基吡嗪等，分別貢獻(xiàn)花香和柑橘、熱帶水果和紫羅蘭、青椒等氣味，這些物質(zhì)共同構(gòu)成了優(yōu)質(zhì)葡萄酒復(fù)雜、優(yōu)雅的香氣。在釀酒葡萄果實中，萜烯類物質(zhì)從葡萄轉(zhuǎn)色開始大量積累，在接近成熟時含量達(dá)到峰值，隨后略有下降，萜烯類物質(zhì)的積累通常與果實中糖分積累同步。因此，在實際采收時通常通過糖酸比來確定是否達(dá)到適宜采收的程度。果實中的萜烯類物質(zhì)以游離態(tài)和糖苷結(jié)合態(tài)兩種形式存在于內(nèi)果皮中，極少量存在于果肉中，且糖苷結(jié)合態(tài)萜烯的含量遠(yuǎn)高于游離態(tài)[3]。據(jù)報道，果實中糖苷結(jié)合態(tài)萜烯含量可達(dá)到游離態(tài)的2～8 倍[4]。由于糖苷結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)不具備揮發(fā)性，對葡萄酒香氣的貢獻(xiàn)是間接的、潛在的，因此又被稱為香氣前體物[5]。葡萄酒釀造過程中，在酸性環(huán)境或相關(guān)酶的作用下，糖苷可以被水解，釋放出所結(jié)合的香氣物質(zhì)[6]，增加葡萄酒的風(fēng)味；同時，部分萜烯在酸性條件下還會發(fā)生分子重排，引起萜烯間的相互轉(zhuǎn)化，對葡萄酒的香氣品質(zhì)產(chǎn)生重要影響。本文將綜述葡萄酒釀酒過程中萜烯的轉(zhuǎn)化及其影響因素，為葡萄酒香氣化學(xué)的研究提供參考，也為優(yōu)質(zhì)葡萄酒香氣的精準(zhǔn)調(diào)控提供依據(jù)。

1 葡萄果實中的萜烯類物質(zhì)

萜烯是葡萄中一類重要的次生代謝產(chǎn)物，它們通過異戊二烯（C5）途徑合成，按照所含碳原子數(shù)目不同，可分為單萜（C10）、倍半萜（C15）、二萜（C20）、三萜（C30）等。從生物學(xué)功能上，萜烯可作為植保素，起到抵抗外界生物和非生物脅迫，增強葡萄抗逆性的作用[7]，更為關(guān)鍵的，萜烯是重要的香氣組成成分。目前，在釀酒葡萄果實中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了70多種萜烯類物質(zhì)[8]，其中對葡萄和葡萄酒香氣有重要貢獻(xiàn)的萜烯是單萜、倍半萜及其衍生物[9]。

1.1 單萜

單萜是釀酒葡萄中含量最高、種類最豐富的萜類物質(zhì)，對葡萄酒的香氣輪廓有重要影響。按照官能團劃分，單萜類化合物主要包括單萜醇類、單萜烯類和一些單萜氧化物。釀酒葡萄中常見的單萜有里那醇、香葉醇、香茅醇、橙花醇、α-萜品醇等。不同釀酒葡萄品種的單萜組分也有較大差異，根據(jù)果實中游離態(tài)單萜的總量，可將歐亞種釀酒葡萄劃分為麝香型（游離單萜總量高于6 mg/L）、非麝香芳香型（游離單萜總量介于1～4 mg/L之間）和非芳香型（游離單萜總量小于1 mg/L）[8]。常見的麝香型釀酒葡萄品種有‘小白粒麝香’（又稱‘小白玫瑰’）‘亞歷山大麝香’‘漢堡麝香’和‘奧托奈麝香’等，常見的非麝香芳香型釀酒葡萄品種主要有‘瓊瑤漿’‘雷司令’‘長相思’等，非芳香型品種如‘赤霞珠’‘西拉’‘美樂’‘霞多麗’等。單萜組分的感官閾值均較低，而在麝香型釀酒葡萄中其含量一般較高，因此，單萜類物質(zhì)在這類葡萄酒中通常具有較高的氣味活度值[10]（odor activity value，OAV，即組分濃度與其感官閾值之比，通常認(rèn)為OAV大于1的香氣物質(zhì)是有香氣貢獻(xiàn)的關(guān)鍵呈香組分）易被感知；在芳香型葡萄酒中單萜也是重要的香氣貢獻(xiàn)物，但在非芳香型葡萄酒中，更為重要的是同樣以花香和果香為主要氣味特征的C13降異戊二烯類物質(zhì)，單萜對該類型葡萄酒的香氣貢獻(xiàn)極其有限。

多項研究表明參與單萜合成的酶，如1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶、糖基轉(zhuǎn)移酶等，均與單萜含量差異密切相關(guān)。Battilana等[11]通過對184 個葡萄品種進行QTL定位分析，發(fā)現(xiàn)位于5號染色體的VvDXS1基因與里那醇、橙花醇和香葉醇的含量均有較高相關(guān)性，并在隨后確定了該基因上的單核苷酸多態(tài)性（single-nucleotide polymorphism，SNP）位點P1822的堿基G被T取代時，第284位氨基酸由賴氨酸（K）突變?yōu)樘於彼幔∟），導(dǎo)致單萜類物質(zhì)的表達(dá)和積累顯著增加[12]。Yang Xiaoxu等[13]發(fā)現(xiàn)該基因上可能存在一個新的SNP位點——P1678位點，當(dāng)該位點堿基A被G取代時，第560位氨基酸由纈氨酸（V）突變?yōu)楫惲涟彼幔↖），使得具有A/A基因型的品種具有更高的單萜含量。此外，Li Xiangyi等[14]發(fā)現(xiàn)，不同類型的釀酒葡萄中糖苷態(tài)單萜含量也有較大差異，麝香型品種‘小白玫瑰’中的OAV最高的糖苷態(tài)單萜依次是里那醇、香葉醇和cis-玫瑰醚，而芳香型的‘瓊瑤漿’中OAV最高的糖苷態(tài)單萜則依次為香葉醇、月桂烯、cis-玫瑰醚和檸檬烯，且糖基轉(zhuǎn)移酶基因VvGT14的表達(dá)在兩種類型的釀酒葡萄品種中糖苷態(tài)單萜的積累均發(fā)揮了重要作用。該基因在‘小白玫瑰’轉(zhuǎn)色直至成熟時期均有較高表達(dá)，在‘瓊瑤漿’中則在花后42～57 d和100～106 d兩個時段出現(xiàn)較高表達(dá)。另一個糖基轉(zhuǎn)移酶基因VvGT7則僅在‘瓊瑤漿’發(fā)育過程早期（花后30～72 d）呈現(xiàn)高表達(dá)，在‘小白玫瑰’成熟全程中未見高表達(dá)。推測VvGT14和VvGT7在兩個品種間的表達(dá)差異可能是導(dǎo)致糖苷態(tài)單萜含量差異的原因之一。

1.2 倍半萜

與單萜類物質(zhì)相比，葡萄果實和葡萄酒中倍半萜的含量都非常低[15]，但同時大多數(shù)倍半萜在葡萄酒中的感官閾值均較低，可以在葡萄酒的發(fā)酵和貯藏過程中穩(wěn)定地保留，因此，它們對葡萄酒香氣也有一定貢獻(xiàn)。與單萜的變化模式不同，倍半萜含量隨著果實的成熟呈下降趨勢[16]，常規(guī)的氣相色譜-質(zhì)譜檢測條件下一般較難檢出，通常需要同時借助同位素標(biāo)記和特征離子掃描才能檢出部分倍半萜。目前關(guān)于倍半萜的合成路徑、相互轉(zhuǎn)化及含量研究報道相對較少[17-18]，有些倍半萜甚至尚未被鑒定和命名。大多數(shù)倍半萜的氣味特征被描述為花香和木材的香味，少數(shù)具有柑橘等水果類香氣。

葡萄果實中，最重要、也是目前研究最多的倍半萜是具有特殊“黑胡椒”氣味的莎草奧酮，其最早在澳洲‘西拉’葡萄中被發(fā)現(xiàn)，是該品種及其所釀造葡萄酒的特征香氣組分。Wood等[19]采用氣相色譜-質(zhì)譜-嗅聞技術(shù)和以d5-莎草奧酮為內(nèi)標(biāo)進行穩(wěn)定同位素稀釋分析，結(jié)合固相微萃取氣相色譜-質(zhì)譜法，首次確定了莎草奧酮是‘西拉’葡萄酒中黑胡椒氣味的來源，并確定了莎草奧酮在紅葡萄酒和水中的感官閾值分別為16 ng/L和8 ng/L，低于葡萄酒中常見萜烯類物質(zhì)和其他倍半萜感官閾值10 倍以上。目前已有的研究表明，果實中的莎草奧酮是由前體法尼基焦磷酸在萜烯合成酶的催化下形成α-愈創(chuàng)木烯，α-愈創(chuàng)木烯進一步氧化形成的。萜烯合成酶基因VvTPS24的等位基因——倍半萜烯合酶基因VvGuaS的表達(dá)差異可能是導(dǎo)致不同品種間莎草奧酮含量差異的根本原因[20]。此外，葡萄果實中莎草奧酮的含量也受到環(huán)境因素，尤其是溫度和光照的影響[21]。

1.3 糖苷態(tài)萜烯

上世紀(jì)80年代初期，葡萄果實中首次發(fā)現(xiàn)了以糖苷結(jié)合態(tài)存在的萜烯物質(zhì)[22]。糖苷結(jié)合態(tài)萜烯是由萜烯苷元和葡萄糖苷配基通過β-葡萄糖苷鍵連接組成的。葡萄果實中萜烯類物質(zhì)的萜烯苷元主要是單萜醇（例如里那醇、橙花醇、香茅醇、香葉醇及里那醇的氧化物）、單萜二醇和單萜三醇[23]，而糖苷配基的主要形式是雙糖苷，約占總糖苷的80%以上，其次是單糖苷，約占10%左右[23-24]，三糖苷含量最低，僅有少量報道[25-26]。目前葡萄中發(fā)現(xiàn)的所有萜烯單糖苷都是β-D-吡喃葡萄糖苷[27]，若β-D-吡喃葡萄糖苷后再連接另一個糖基，則形成雙糖苷，根據(jù)末端糖基的含碳數(shù)，可分為己糖基-葡萄糖苷和戊糖基-葡萄糖苷兩大類，其中己糖基-葡萄糖苷主要是6-O-α-L-吡喃鼠李糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷（又稱蕓香糖苷）、6-O-β-D-葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷，戊糖基-葡萄糖苷則包括6-O-α-L-呋喃阿拉伯糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷、6-O-α-呋喃芹菜糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷以及6-O-β-D-吡喃木糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷等[15,28-29]，而三糖苷則是在β-D-吡喃葡萄糖苷后連接兩個糖基，迄今在葡萄中發(fā)現(xiàn)的唯一萜烯三糖苷是單萜醇己糖-戊糖-戊糖[4]。Song Hongcong等[30]利用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜在非芳香型釀酒葡萄品種‘愛格麗’‘蛇龍珠’和常見的麝香型品種‘漢堡麝香’中共檢測出15 種萜烯糖苷，其中包括12 種雙糖苷和3 種單糖苷，發(fā)現(xiàn)其中1,2-二羥基里那醇-β-D-吡喃葡萄糖苷/6,7-二羥基里那醇-β-D-吡喃葡萄糖苷、八羥基里那醇-β-D-吡喃葡萄糖苷、呋喃型氧化里那醇-α-L-呋喃阿拉伯糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷和橙花醇-α-呋喃芹菜糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷4 種糖苷在3 個品種中均存在。

此外，Song Hongcong等[30]還收集了有關(guān)葡萄萜烯糖苷的液相色譜-質(zhì)譜裂解模式的信息以及糖苷的化學(xué)信息，利用UNIFI軟件建立了包含萜烯苷元信息的糖苷數(shù)據(jù)庫，其中單糖苷（即β-D-吡喃葡萄糖苷）10 種、α-L-呋喃阿拉伯糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷9 種、α-呋喃芹菜糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷12 種、α-L-吡喃鼠李糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷7 種，β-D-吡喃木糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷2 種。由于葡萄果實中的倍半萜難以檢測到，該數(shù)據(jù)庫中所收錄的萜烯糖苷中配基均為單萜及其衍生物，尚無倍半萜的糖苷，這為開展糖苷態(tài)單萜的研究奠定了基礎(chǔ)。表1總結(jié)了文獻(xiàn)報道的釀酒葡萄果實中主要萜烯類物質(zhì)的氣味特征及含量范圍。

表1 釀酒葡萄果實中主要萜烯的含量及氣味特點Table 1 Content and odor characteristics of terpenes in wine grapes

2 葡萄酒釀造過程中萜烯的轉(zhuǎn)化

釀酒葡萄果實發(fā)育過程中合成的萜烯類物質(zhì)在葡萄酒發(fā)酵和陳釀過程中會發(fā)生一些變化——游離態(tài)萜烯會從果實中轉(zhuǎn)移至葡萄醪和葡萄酒中，糖苷結(jié)合態(tài)萜烯會因為釀造過程酵母和乳酸菌中糖苷水解酶的作用以及陳釀過程中酒體較低pH值（2.9～3.8）而發(fā)生酸水解，釋放出揮發(fā)性苷元；同時，在葡萄酒的pH值條件下（2.9～3.8），一些單萜組分會發(fā)生酸催化的重排，轉(zhuǎn)化形成新的香氣物質(zhì)，使葡萄酒的風(fēng)味更加豐富。非揮發(fā)性糖苷前體的水解以及某些揮發(fā)性化合物的化學(xué)重排被認(rèn)為是促成陳年葡萄酒香氣形成的兩個關(guān)鍵現(xiàn)象[39]。

2.1 酶催化的糖苷結(jié)合態(tài)萜烯水解

對于與單糖苷結(jié)合的萜烯，β-葡萄糖苷酶可以直接斷裂β-葡萄糖苷鍵從而釋放萜烯配基，雙糖苷和三糖苷的水解則更加復(fù)雜，還需要另一種糖基對應(yīng)的糖苷酶的參與，如α-L-鼠李糖苷酶、α-L-芹菜糖苷酶和α-L-阿拉伯糖苷酶（圖1）。果實中也存在一種β-葡萄糖內(nèi)切酶，可以一步斷開雙糖苷釋放萜烯[40]，但在葡萄壓榨成汁后形成的低pH值（pH 3.5左右）和高糖環(huán)境下，酶活性很低。糖苷酶水解可以增加葡萄酒中萜烯香氣早在1996年就有報道，Gueguen等[41]研究發(fā)現(xiàn)，莫氏假絲酵母35M5N（Candida molischiana35M5N）能夠大量產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶，且可以在較低的pH值（最適pH值3.5）和較高乙醇濃度條件下保持高活性，利用該酵母產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶處理pH 3.8、乙醇體積分?jǐn)?shù)15%的麝香型葡萄酒時，可增加酒中橙花醇、里那醇、香葉醇、γ-萜品醇的濃度。

圖1 酶催化的糖苷態(tài)萜烯水解Fig. 1 Enzymatic hydrolysis of glycoside terpenes

干型葡萄酒的釀造工藝通常包含除梗破碎、壓榨、乙醇發(fā)酵、蘋果酸-乳酸發(fā)酵、浸漬、皮渣分離、倒罐等步驟，其中乙醇發(fā)酵和蘋果酸-乳酸發(fā)酵過程中發(fā)揮作用的微生物——釀酒酵母、乳酸菌、細(xì)菌及一些非釀酒酵母大多數(shù)都具有糖苷酶活性[42-43]，可以水解糖苷態(tài)萜烯。

2.1.1 乙醇發(fā)酵中相關(guān)酶對糖苷結(jié)合態(tài)萜烯的水解

許多釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）本身具有內(nèi)源糖苷酶，可以在發(fā)酵條件下表現(xiàn)出β-葡萄糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶和α-鼠李糖苷酶的活性，水解糖苷結(jié)合態(tài)的萜烯，增加葡萄酒中萜烯含量。但釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)糖苷酶活性的最佳環(huán)境條件是pH 5.0～6.0、溫度40～50 ℃[44]。在實際的葡萄酒發(fā)酵環(huán)境下，初期較高的糖濃度、整體上較低的pH值（2.9～3.8）和溫度、乙醇發(fā)酵過程不斷增加的乙醇濃度等均導(dǎo)致釀酒酵母中糖苷酶的活性受到強烈抑制，活性僅為原來的5%～15%[45-46]，因此，釀酒酵母中的糖苷酶對糖苷態(tài)萜烯的水解作用十分有限。

相反，一些非釀酒酵母（non-Saccharomyces），如美極梅奇酵母（Metschnikowiapulcherrima）、德爾布有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）、畢赤酵母（Pichia pastoris）、有孢漢遜酵母（Hanseniaspora）等中的糖苷酶，表現(xiàn)出對高糖、低pH值和較高濃度乙醇的耐受性，可以在葡萄酒發(fā)酵過程中保持中等以上水平的β-葡萄糖苷酶活性，在水解糖苷態(tài)萜烯方面顯示出比釀酒酵母更高的效率[47–51]。一些非釀酒酵母菌株甚至具有多種糖苷酶活性，且能耐受一定的葡萄酒環(huán)境脅迫。Sabel等[52]對90 株從葡萄、葡萄醪或葡萄酒中分離出來的野生型酵母菌株（包括55 株釀酒酵母和35 株非釀酒酵母）進行分離和酶學(xué)測定，發(fā)現(xiàn)所檢測的55 株釀酒酵母均未顯示出β-葡萄糖苷酶活性，而非釀酒酵母中有23 株具有β-葡萄糖苷酶活性，其中從白色品種葡萄醪中分離得到的一株異常威克漢姆酵母AS1（Wickerhamomyces anomalusAS1）不僅能夠產(chǎn)生β-D-葡萄糖苷酶，而且還能夠產(chǎn)生高活性的β-D-吡喃木糖苷酶和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，可同時水解單糖苷萜烯和雙糖苷萜烯；更為重要的是，相對商業(yè)糖苷酶酶制劑，該菌株中的糖苷酶在干型葡萄酒中仍可保持較高的活性，在葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%條件下仍有較低活性，對乙醇和糖均有較好的耐受能力，但更高的葡萄糖濃度下該菌株中糖苷酶活性也會受到抑制。非釀酒酵母雖然無法單獨啟動葡萄酒的乙醇發(fā)酵，但多項研究發(fā)現(xiàn)，在實際釀酒條件中利用具有糖苷酶活性的非釀酒酵母與釀酒酵母進行混合發(fā)酵，可以在保證發(fā)酵正常進行的同時增加葡萄酒中萜烯類香氣物質(zhì)的含量[53–56]。由于游離態(tài)萜烯在葡萄酒發(fā)酵過程中含量相對穩(wěn)定，因此，可以利用發(fā)酵條件下非釀酒酵母中糖苷酶的理化性質(zhì)相對于釀酒酵母糖苷酶更加穩(wěn)定這一特點，促進糖苷態(tài)萜烯的酶水解釋放，增強香氣[57]。

2.1.2 蘋果酸-乳酸發(fā)酵中相關(guān)酶對糖苷結(jié)合態(tài)萜烯的水解

蘋果酸-乳酸發(fā)酵發(fā)生在乙醇發(fā)酵之后，相比釀酒酵母和非釀酒酵母，進行蘋果酸-乳酸發(fā)酵的菌種在水解糖苷結(jié)合態(tài)萜烯方面不受到糖濃度的抑制，但需對較高的乙醇含量有很好的耐受性。參與蘋果酸-乳酸發(fā)酵的乳酸菌主要包括酒酒球菌（Oenococcus oeni）、片球菌（Pediococcus damnosus）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）等[58]，其中酒酒球菌和植物乳桿菌均被報道具有糖苷酶活性[59-60]。

酒酒球菌作為葡萄酒蘋果酸-乳酸發(fā)酵階段的傳統(tǒng)啟動菌種，對高乙醇體積分?jǐn)?shù)、低pH值和高二氧化硫環(huán)境都有較高的耐受性[61]，研究發(fā)現(xiàn)，酒酒球菌中的糖苷酶在底物特異性上比其他來源的糖苷酶更加廣泛，與真菌糖苷酶優(yōu)先釋放伯醇萜烯（如香葉醇和橙花醇）相比，酒酒球菌可同時釋放出伯醇和叔醇類（如里那醇、氧化里那醇和α-萜品醇）萜烯苷元[62-63]。Pérez-Martín等[64]的研究也驗證了這一結(jié)論，以酒酒球菌CECT 7621為陰性對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)另外兩株酒酒球菌Ab11和Da32對多種萜烯糖苷有更高的水解效率，蘋果酸-乳酸發(fā)酵結(jié)束時橙花醇的濃度分別高出陰性對照組75%和77%，cis-呋喃型氧化里那醇的濃度分別提升了66%和144%，trans-吡喃型氧化里那醇的濃度分別增加了76%和150%，在釋放糖苷結(jié)合態(tài)萜烯方面顯示出很高的應(yīng)用潛力。

近10 年來，植物乳桿菌受到越來越多的關(guān)注，已有研究表明，植物乳桿菌可作為酒酒球菌的替代者被用于啟動葡萄酒的蘋果酸-乳酸發(fā)酵，且可以表現(xiàn)出更加多樣化的酶學(xué)特征[65–67]，除具有多種糖苷酶活性外，還具有多種與感官品質(zhì)相關(guān)的酶活性，如檸檬酸裂解酶、鞣酸酶、酯酶等，在葡萄酒香氣、顏色等特征的改變中起重要作用[67]。Iorizzo等[68]對從葡萄酒中篩選出的11 株植物乳桿菌進行了鑒定，發(fā)現(xiàn)所有菌株都能夠水解糖苷態(tài)萜烯，且在酒廠工業(yè)化生產(chǎn)條件下仍表現(xiàn)出很強的β-葡萄糖苷酶和α-葡萄糖苷酶活性，能夠釋放出檸檬烯、里那醇、氧化里那醇等萜烯苷元。

因此，在葡萄酒生產(chǎn)中，可以充分利用非釀酒酵母和植物乳桿菌中糖苷酶獨有的特性，改善葡萄酒香氣質(zhì)量。

2.2 酸催化的糖苷態(tài)萜烯水解

在葡萄酒乙醇發(fā)酵過程中，整個發(fā)酵體系的pH值會不斷降低，而在蘋果酸-乳酸發(fā)酵階段略有上升，最終發(fā)酵完成的葡萄酒pH值會穩(wěn)定在2.9～3.8之間[69]，這個pH值范圍為水解糖苷提供了酸性環(huán)境。相較于酶促水解，酸水解不受葡萄糖和乙醇濃度等條件的抑制，理論上對于萜烯糖苷的釋放比酶水解更有優(yōu)勢，但實際上，葡萄酒發(fā)酵過程中糖苷態(tài)萜烯的酸水解僅占總水解的很小一部分[70]。酸水解程度與pH值、溫度、反應(yīng)時間和糖苷配基的結(jié)構(gòu)都有關(guān)系[71]，酸水解實驗表明，叔醇類（如里那醇、氧化里那醇和α-萜品醇）的糖苷比伯醇類（如香葉醇和橙花醇）的糖苷更易水解，這與在葡萄酒長時間儲藏后觀察到的現(xiàn)象類似[71]。在接近葡萄酒的pH值范圍（2.9～3.8）內(nèi)，當(dāng)酸解溫度為100 ℃，1～2 h內(nèi)95%以上的萜烯糖苷可以被水解；當(dāng)溫度下降至40 ℃，酸解16～24 h才能達(dá)到25%左右的水解率；但同樣溫度下糖苷酶酶解24 h，幾乎全部萜烯糖苷均可完全水解[38]。在實際生產(chǎn)中，紅葡萄酒的發(fā)酵溫度一般在20～32 ℃之間，白葡萄酒的發(fā)酵溫度較低，一般在12～22 ℃之間，由于葡萄酒釀造和陳釀過程中的溫度遠(yuǎn)低于上述實驗中酸水解的溫度，所以，葡萄酒中真實發(fā)生的酸水解是非常緩慢的。Loscos等[72]對比了AR 2000果膠酶水解（40 ℃、pH 5條件下水解16 h）、酸水解（100 ℃、pH 2.5條件下水解1 h）與進行乙醇發(fā)酵后酒中萜烯含量的變化，發(fā)現(xiàn)乙醇發(fā)酵后僅釋放出少量萜烯香氣，遠(yuǎn)少于酸水解和酶水解處理后的萜烯釋放量。但對于一些陳釀潛力較好的葡萄酒而言，陳釀過程中發(fā)生的緩慢酸水解對提升香氣品質(zhì)依然有著十分重要的意義[9]。

2.3 酸催化的萜烯類物質(zhì)單分子重排

有研究表明，用體積分?jǐn)?shù)85%磷酸溶液處理香葉醇、橙花醇和里那醇時，會生成檸檬烯、α-萜品烯、異萜品油烯、γ-萜品烯和對傘花烴這4 種環(huán)狀萜烯類物質(zhì)[73]；在其他低pH值的介質(zhì)中，香葉醇、橙花醇也可以相應(yīng)地轉(zhuǎn)化為α-萜品醇和里那醇[38,74]，這表明確實存在酸作用下的分子重排反應(yīng)，使得萜烯物質(zhì)之間發(fā)生相互轉(zhuǎn)化。在葡萄汁中，不同的pH值和溫度下經(jīng)分子重排產(chǎn)生的單萜種類和組分比例是不同的[8]，而在葡萄酒中，分子重排更多發(fā)生在pH值和溫度相對穩(wěn)定的陳釀期間，重排產(chǎn)物也相對穩(wěn)定。

分子重排的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是形成碳正離子中間體，進而經(jīng)過水合、環(huán)化脫水、氫化物轉(zhuǎn)移等反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)椴煌姆磻?yīng)產(chǎn)物，Wedler等[75]利用量子計算化學(xué)得出，酸性條件下，萜品基碳正離子中間體去質(zhì)子化可形成檸檬烯，或通過水合作用形成α-萜品醇，再通過C＝C雙鍵的水合作用形成1,8-桉樹腦的反應(yīng)過程，與Fari?a等[76]對‘丹娜’葡萄及葡萄酒進行氘標(biāo)記實驗確定的重排反應(yīng)步驟一致。Waterhouse等[9]更加詳細(xì)地描述了從里那醇轉(zhuǎn)變?yōu)檩破坊颊x子中間體，進一步以相同機制重排形成1,8-桉樹腦的過程（圖2）。Yang Yu等[36]整合了前人的研究結(jié)果并結(jié)合‘媚麗’葡萄酒中萜烯的變化規(guī)律，提出了里那醇的分子重排機制，闡明了里那醇、香葉醇、α-萜品醇等單萜之間也存在相互轉(zhuǎn)化，具體如下：里那醇可以通過親核的1,3-轉(zhuǎn)移（烯丙基）轉(zhuǎn)化為香葉醇和橙花醇，而香葉醇也可以通過相同的方式逆向轉(zhuǎn)化為里那醇；橙花醇可通過環(huán)化脫水生成α-萜品醇，再脫水可生成檸檬烯。此外，de Meireles等[77]發(fā)現(xiàn)倍半萜在酸性條件下也會發(fā)生重排反應(yīng)，橙花叔醇可以通過形成橙花叔基碳正離子中間體轉(zhuǎn)化為法尼醇（圖3）。

圖2 里那醇在酸性條件下通過水解和環(huán)化生成1,8-桉樹腦[9]Fig. 2 Formation of 1,8-cineole from linalool through hydrolysis and intramolecular cyclization[9]

圖3 酸催化橙花醇分子重排生成法尼醇[77]Fig. 3 Schematic diagram of acid-catalyzed conversion of nerol and farnesol[77]

3 葡萄酒釀造過程中影響萜烯組分轉(zhuǎn)化的因素

3.1 皮渣接觸

由于釀酒葡萄果實中香氣物質(zhì)主要位于果皮中，在果肉中的含量非常少，發(fā)酵過程中皮渣接觸（也稱為浸漬）有利于果皮中香氣物質(zhì)浸出，從而增加葡萄酒中游離態(tài)萜烯和部分結(jié)合態(tài)萜烯的含量，且接觸時間越長，酒中萜烯的含量增加越明顯[78-79]。Baron等[78]研究表明，葡萄酒中萜烯含量與浸漬時間長短成正比，14 ℃下經(jīng)過24 h皮渣接觸后，葡萄醪中萜烯物質(zhì)含量均上升，其中里那醇質(zhì)量濃度從600 μg/L增加至1 014 μg/L，橙花醇和香葉醇含量均增至原來的兩倍，其他萜烯類物質(zhì)的含量也都在浸漬后有不同幅度增加。皮渣接觸的溫度也會影響酒中萜烯含量，葡萄酒生產(chǎn)過程中常用的浸漬方式有熱浸漬（70 ℃以上）、冷浸漬（5～10 ℃）和常溫浸漬（25～30 ℃）等[80]，相比熱浸漬和常溫浸漬，冷浸漬工藝更有利于果實中萜烯的提取[81]和葡萄酒香氣品質(zhì)的提升，這可能是由于低溫減少了香氣物質(zhì)的揮發(fā)散失，同時也避免了酵母菌、醋酸菌等微生物帶來的不良風(fēng)味[82-83]。因此，在皮渣接觸過程中適當(dāng)?shù)匮娱L浸漬時間、控制浸漬溫度，有利于增加葡萄酒中萜烯含量，使葡萄酒具有更加濃郁的花果香氣；也可以在發(fā)酵開始前采取壓榨、添加果膠酶等方法促進釀酒葡萄果皮的裂解，使皮渣接觸更加充分[9]。

3.2 外源糖苷酶的添加

糖苷酶可以水解無味的糖苷態(tài)萜烯，釋放出萜烯，但通常情況下，發(fā)酵過程中使用的釀酒酵母和酒酒球菌、植物乳桿菌最主要的目的是完成乙醇發(fā)酵和蘋果酸-乳酸發(fā)酵，實際生產(chǎn)中使用的菌種提供的內(nèi)源糖苷酶對葡萄酒香氣改善作用是較為微弱的，因此，葡萄酒生產(chǎn)中也常通過直接添加外源糖苷酶來增香，已經(jīng)有一些比較成熟的商業(yè)糖苷酶制劑，例如，從黑曲霉（Aspergillus niger）中獲得的AR2000糖苷酶[84]已廣泛應(yīng)用于葡萄酒的增香發(fā)酵中，也常用于糖苷態(tài)香氣物質(zhì)的檢測[14,85-86]。但需要注意的是，在不同pH值、乙醇濃度和糖濃度下，不同糖苷酶制劑活性受到的影響不同[87]。因此，添加糖苷酶的時機也會影響對糖苷結(jié)合態(tài)萜烯的水解效果，鑒于葡萄糖對糖苷酶的抑制作用，通常認(rèn)為在乙醇發(fā)酵后添加效果最佳[88]。

3.3 pH值

pH值與糖苷態(tài)萜烯的酸水解及隨后發(fā)生的分子重排反應(yīng)都有關(guān)系，較低的pH值下，酸水解效率提高[68]，同時引發(fā)更廣泛的分子重排，使得萜烯物質(zhì)的種類和含量比例都發(fā)生改變。而且在葡萄酒pH值范圍內(nèi)，酸水解和分子重排更多地偏向于產(chǎn)生里那醇、橙花醇等對葡萄酒香氣貢獻(xiàn)有較重要作用的萜烯[8]，而在更低的pH值情況下，產(chǎn)物更多地向1,4-桉樹腦/1,8-桉樹腦、羅勒烯醇等對香氣貢獻(xiàn)較小的萜烯物質(zhì)轉(zhuǎn)化?？梢哉J(rèn)為，隨葡萄酒陳釀時間延長，糖苷態(tài)萜烯發(fā)生酸解和重排，使葡萄酒香氣更加豐富。

3.4 溫度

發(fā)酵和陳釀溫度對葡萄酒中糖苷態(tài)萜烯的酶解和酸解均有重要的影響，從而間接影響著萜烯的釋放和轉(zhuǎn)化，不同發(fā)酵溫度下，葡萄酒的香氣特征也不同，例如，為了獲得平衡的新鮮的果香，白葡萄酒的發(fā)酵溫度通常低于紅葡萄酒，浸漬時也更多采用冷浸漬的方式[89]。相比正常的陳釀條件（18 ℃持續(xù)1 年），在一些高溫加速老化實驗中，發(fā)現(xiàn)白葡萄酒中的花香果香會減弱，一些單萜在高溫下可能會轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌N類的新物質(zhì)而沒有被檢出[90]。Luki?等[91]發(fā)現(xiàn)，18～22 ℃長時間的浸漬和陳釀通常有利于單萜從果皮浸提和糖苷結(jié)合態(tài)萜烯的水解，但較低溫度下酵母糖苷酶活性會受到抑制，不利于糖苷結(jié)合態(tài)萜烯的水解，因此在發(fā)酵過程中需要將溫度維持在適宜水平。

4 結(jié) 語

萜烯類物質(zhì)主要來自于釀酒葡萄果實，是葡萄酒花果香的重要來源。在葡萄酒釀造過程中，糖苷結(jié)合態(tài)萜烯會在酸性環(huán)境以及乙醇發(fā)酵和蘋果酸乳酸發(fā)酵的相關(guān)菌種（如非釀酒酵母、釀酒酵母、酒酒球菌、植物乳桿菌等）中多種糖苷酶的作用下水解出揮發(fā)性萜烯，釋放到葡萄酒中。在葡萄酒中，萜烯物質(zhì)還會發(fā)生酸催化的分子重排，改變其在葡萄酒中的含量和相對比例。上述反應(yīng)都會對葡萄酒的香氣品質(zhì)產(chǎn)生較大影響，因此，探明葡萄酒釀造過程中萜烯類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化及其調(diào)控因素具有重要的生產(chǎn)實踐意義。

目前關(guān)于發(fā)酵微生物對糖苷態(tài)萜烯香氣釋放的研究有很多報道，但應(yīng)用于實際生產(chǎn)的并不多，非釀酒酵母、酒酒球菌等菌種或菌株差異都可以影響糖苷態(tài)香氣的水解釋放，對乙醇發(fā)酵和蘋果酸-乳酸發(fā)酵后葡萄酒的香氣特性有積極影響；因此，篩選合適的菌種或菌株，可以有針對性的改善葡萄酒香氣品質(zhì)。針對現(xiàn)有菌種產(chǎn)生的內(nèi)源性糖苷酶在釀酒條件下活性不高的問題，未來的研究可以從多方面入手：一方面可以繼續(xù)篩選在葡萄酒釀造環(huán)境中具有較高糖苷酶活性的釀酒酵母；另一方面應(yīng)從解決酶活性本身出發(fā)，研究適合葡萄酒實際生產(chǎn)使用的固定化酶技術(shù)、細(xì)胞表面展示技術(shù)；另外，還需開展多菌種混合釀造對葡萄酒香氣、顏色影響的理論研究和技術(shù)研發(fā)。

關(guān)于葡萄酒陳釀過程發(fā)生中的萜烯類物質(zhì)分子重排雖然已經(jīng)有較多報道，但現(xiàn)有研究中的陳釀時間往往較短，在更長的陳釀時間中，葡萄酒中萜烯類物質(zhì)是否會發(fā)生更加豐富、復(fù)雜的變化，具體的影響因素有哪些，更詳細(xì)、全面的反應(yīng)機理等還有待進一步深入研究。