甘氨酸甜菜堿處理對(duì)桃果實(shí)冷害及抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)代謝的影響

王 懿，侯媛媛，馬鈺晴，朱 璇，鄭永華，金 鵬,*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

桃（Prunus persica(L.) Batsch）屬于呼吸躍變型果實(shí)，一般在高溫多雨的夏季成熟，桃果實(shí)皮薄質(zhì)軟，采后極易受到機(jī)械損傷，在常溫下易軟化腐敗，不耐貯藏[1]。低溫能有效抑制桃果實(shí)后熟軟化，延長(zhǎng)桃果實(shí)采后貯藏壽命[2]。但桃果實(shí)屬于冷敏性果實(shí)，長(zhǎng)期低溫貯藏會(huì)導(dǎo)致桃果實(shí)發(fā)生冷害，其主要癥狀包括果肉褐變、木質(zhì)化或絮敗、不能正常后熟、固有風(fēng)味變淡甚至喪失等[3]，降低了桃果實(shí)的商品價(jià)值。因此，研究桃果實(shí)冷害發(fā)生機(jī)理并提高冷藏桃果實(shí)的貯藏品質(zhì)是目前解決桃果實(shí)采后貯藏保鮮的關(guān)鍵課題。

低溫脅迫會(huì)誘導(dǎo)植物體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）大量積累，導(dǎo)致膜脂過氧化、蛋白質(zhì)和核苷酸等一系列氧化損傷，從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[4-5]。植物體內(nèi)存在由酶促防御系統(tǒng)和非酶促抗氧化劑防御系統(tǒng)共同組成的活性氧清除系統(tǒng)[5]?？箟难?谷胱甘肽（ascorbic acid-glutathione，AsA-GSH）循環(huán)是非酶促抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分。AsA-GSH循環(huán)一方面可以通過抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）、單脫氫抗壞血酸還原酶（monodehydroascorbate reductase，MDHAR）、脫氫抗壞血酸還原酶（dehydroascorbate reductase，DHAR）、谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）的催化作用直接清除植物體內(nèi)產(chǎn)生的過氧化氫（H2O2）；另一方面，AsA-GSH循環(huán)能夠促進(jìn)兩種非酶類抗氧化劑（AsA和GSH）的生成，從而維持植物體內(nèi)氧化還原物質(zhì)的平衡[6-7]。果實(shí)抗冷性的增強(qiáng)與調(diào)節(jié)AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)有關(guān)這一結(jié)論已經(jīng)在枇杷[8]、甜椒[9]、番茄[10]、桃[11]果實(shí)中得到證實(shí)。因此，促進(jìn)AsA-GSH循環(huán)對(duì)減輕低溫誘導(dǎo)的果實(shí)氧化損傷具有重要的作用。

甘氨酸甜菜堿（glycine betaine，GB）是一種季胺化合物，是保持植物正常生理功能的重要滲透保護(hù)劑，其可以作為兩性離子與蛋白質(zhì)復(fù)合物和膜的親水性和疏水性域相互作用，從而有助于穩(wěn)定蛋白質(zhì)，以保護(hù)脅迫植物的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)[12]。近年來，GB處理在果蔬采后中的應(yīng)用越來越受到關(guān)注。已有大量研究表明，GB處理在緩解梨[13]、枇杷[14]、香蕉[15]和西葫蘆[16]等果實(shí)冷害中發(fā)揮著重要作用。本課題組先前的研究發(fā)現(xiàn)，在采后桃果實(shí)中，GB處理可以通過調(diào)控能量代謝[17]、糖代謝和酚類代謝[18]，增強(qiáng)桃果實(shí)的抗冷性。但外源GB處理通過調(diào)控AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)清除過量的ROS來減輕桃果實(shí)冷害的研究還鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以桃果實(shí)為實(shí)驗(yàn)材料，研究10 mmol/L GB處理對(duì)桃果實(shí)AsA-GSH循環(huán)中相關(guān)代謝產(chǎn)物的含量、關(guān)鍵酶活性及相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用，以及對(duì)桃果實(shí)H2O2含量和膜脂過氧化程度的影響，以期從AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)清除ROS的角度探討GB處理提高采后桃果實(shí)抗冷性的作用機(jī)理，為GB處理在桃果實(shí)采后冷藏中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)選取的‘湖景蜜露’桃果實(shí)于2019年7月采收于江蘇省農(nóng)科院，選擇大小均勻、成熟度一致，無任何機(jī)械損傷和病蟲害的桃果實(shí)作為實(shí)驗(yàn)樣品（單果質(zhì)量約為170～210 g）。

GB、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、AsA、氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）、氯化鐵（FeCl3） 北京索萊寶科技有限公司；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；A061-1谷胱甘肽試劑盒南京建成生物工程研究所；乙二胺四乙酸、聚乙烯吡咯烷酮、磷酸吡哆醛、還原型輔酶II（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）、2,2-聯(lián)吡啶溶液 上海瑞永生物科技有限公司；Hifair?III 1st strand cDNA Stnthesis SuperMix（gDNA digesster plus）（11141ES60）試劑盒、Hieff?qPCR SYBR?Green Master Mix（11202ES03/80/60）試劑盒 上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GL-20G-H型冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；MIR-253三洋恒溫培養(yǎng)箱 上海恒逸實(shí)業(yè)有限公司；FA1204B型分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；DK-S26型電熱恒溫水浴鍋 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；UV-1600型紫外-可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；DDS-11A型電導(dǎo)率儀 上海第二分析儀器廠；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀（配有QuantStudio? 5實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)） 美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桃果實(shí)GB處理

桃果實(shí)在采摘后2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，約30 min散去田間熱后，將挑選出來的桃果實(shí)隨機(jī)分成兩組（GB組和對(duì)照組），每組200 個(gè)。將GB組的桃果實(shí)置于10 mmol/L GB溶液中浸泡10 min；對(duì)照組的桃果實(shí)置于無菌去離子水中浸泡10 min，取出自然晾干。每6 個(gè)桃果實(shí)裝入0.01 mm厚的聚氯乙烯塑料袋中，袋口用普通橡皮筋繞兩圈，在（0±1）℃、相對(duì)濕度90%的恒溫箱中貯藏，每隔7 d進(jìn)行取樣并測(cè)定相關(guān)指標(biāo)，貯藏35 d后結(jié)束。

1.3.2 冷害指數(shù)的測(cè)定

在貯藏21、28、35 d分別取18 個(gè)桃果實(shí)測(cè)定冷害指數(shù)[17,19]。取樣后將桃果實(shí)置于20 ℃、相對(duì)濕度90%的恒溫箱中貯藏3 d（模擬貨架期條件）后，將果實(shí)沿著軸向直徑切開，根據(jù)切面褐變面積所占果實(shí)切面總面積的百分比將冷害指數(shù)分為5 個(gè)等級(jí)：0 級(jí)，無冷害；1 級(jí)，褐變面積＜5%；2 級(jí)，5%＜褐變面積＜25%；3 級(jí)，25%＜褐變面積＜50%；4 級(jí)，褐變面積＞50%，參考文獻(xiàn)[19]按以下公式計(jì)算冷害指數(shù)。

1.3.3 相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定

桃果實(shí)的相對(duì)電導(dǎo)率參照文獻(xiàn)[20]進(jìn)行測(cè)定，每組選取6 個(gè)桃果實(shí)，結(jié)果取平均值。

1.3.4 丙二醛含量和H2O2含量的測(cè)定

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量參照文獻(xiàn)[19]進(jìn)行測(cè)定，單位為nmol/g。H2O2含量參照文獻(xiàn)[21]測(cè)定，單位為μmol/g，以上結(jié)果均以鮮質(zhì)量計(jì)。

1.3.5 AsA含量和脫氫抗壞血酸含量的測(cè)定

AsA含量和脫氫抗壞血酸（dehydroascorbate，DHA）含量測(cè)定參照文獻(xiàn)[22]的方法并略作修改。將2 g樣品在5 mL 60 g/L的TCA溶液中充分研磨，在4 ℃、12 000 ×g下離心20 min，取出上清液用于后續(xù)測(cè)定。AsA反應(yīng)體系含1 mL上清液、1.0 mL 100 g/L的TCA溶液、0.5 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）、0.8 mL 20 g/L的2,2-聯(lián)吡啶溶液、0.8 mL 42%（體積分?jǐn)?shù)）磷酸溶液和0.4 mL 30 g/L的FeCl3溶液?？侫sA反應(yīng)體系是將1 mL上清液、0.5 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）與0.2 mL 6 mmol/L的DTT溶液混合，在42 ℃水浴保溫15 min后，加入0.2 mL 4 g/L的N-乙基馬來酰亞胺溶液，漩渦混勻后，再加入其他反應(yīng)液。測(cè)定兩個(gè)反應(yīng)體系在525 nm波長(zhǎng)處的吸光度?？侫sA、AsA含量用AsA作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，DHA含量是總AsA含量與AsA含量的差值。以上結(jié)果均以鮮質(zhì)量計(jì)，單位為mg/kg。

1.3.6 GSH含量和GSSG含量的測(cè)定

以5 mL 0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）作為提取液，將2 g果肉研磨成勻漿，隨后在4 ℃、12 000 ×g條件下離心20 min，取上清液。根據(jù)A061-1谷胱甘肽試劑盒說明書測(cè)定GSH、GSSG的含量，結(jié)果以鮮質(zhì)量計(jì)，單位為nmol/g。

1.3.7 APX、GR、MDHAR、DHAR活力的測(cè)定

APX活性參照文獻(xiàn)[23]進(jìn)行測(cè)定。

GR活力測(cè)定參照文獻(xiàn)[24]的實(shí)驗(yàn)方法，并略作調(diào)整。將2 g樣品在5 mL 0.1 mol/L的磷酸鈉緩沖液（pH 7.5）中充分研磨，在4 ℃、12 000 ×g下離心20 min，取出上清液待測(cè)定。反應(yīng)體系含1.0 mL上清液、0.15 mL 5 mmol/L的GSSG溶液和1.85 mL 0.1 mol/L的磷酸鈉緩沖液（pH 7.5），加入0.1 mL 4 mmol/L的NADPH溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，記錄340 nm波長(zhǎng)處的吸光度變化。

MDHAR、DHAR活力的測(cè)定參照文獻(xiàn)[22]的方法并略作調(diào)整。將2 g樣品在5 mL 50 mmol/L磷酸鈉緩沖液（含有0.1 mmol/L乙二胺四乙酸、體積分?jǐn)?shù)為0.3%的Triton-100和40 g/L的聚乙烯吡咯烷酮，pH 7.5）充分研磨，在4 ℃、12 000 ×g下離心20 min取上清液待測(cè)。MDHAR反應(yīng)體系含0.4 mL上清液、1.5 mL 50 mmol/L的磷酸鈉緩沖液（含有0.2 mmol/L NADPH、2.5 mmol/L AsA，pH 7.5），以0.1 mL 0.25 U/mL抗壞血酸氧化酶溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，記錄340 nm波長(zhǎng)處吸光度變化。DHAR反應(yīng)體系含0.1 mL上清液、2.8 mL 50 mmol/L的磷酸鈉緩沖液（含有5 mmol/L GSH，pH 7.5），用0.1 mL 2 mmol/L的DHA溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，記錄265 nm波長(zhǎng)處吸光度變化。

以上酶均以每克鮮質(zhì)量樣品每分鐘吸光度變化0.01為1 個(gè)酶活力單位U。

1.3.8 AsA-GSH循環(huán)相關(guān)基因表達(dá)量的測(cè)定

采用十六烷基三甲基溴化銨方法提取冷凍組織中的總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，參照Hieff?qPCR SYBR?Green Master Mix（Low Rox）試劑盒的說明，使用表1中的基因引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為10 μL Green Master Mix（Low Rox）、0.4 μL上游引物、0.4 μL下游引物、1 μL模板DNA，加入無菌超純水至20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變形10 s，60 ℃退火30 s，循環(huán)40 次，使用2－ΔΔCt方法計(jì)算結(jié)果。

表1 用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析的基因特異性引物序列Table 1 Gene-specific primer sequences used for real-time fluorescence polymerase chain reaction

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2016和SPSS 25軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用Duncan多重比較法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異顯著性，P＜0.05表示差異顯著。采用Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 GB處理對(duì)桃果實(shí)冷藏期間冷害指數(shù)的影響

桃果實(shí)在（0±1）℃下貯藏21、28、35 d后的冷害指數(shù)如圖1所示，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組和GB組桃果實(shí)冷害指數(shù)不斷增加，但GB組果實(shí)冷害指數(shù)顯著始終低于對(duì)照組（P＜0.05）。在貯藏35 d后，對(duì)照組的桃果實(shí)冷害指數(shù)達(dá)到83.59%，而GB組的冷害指數(shù)僅為對(duì)照組的79.75%。說明GB處理可以抑制桃果實(shí)的冷害發(fā)生，減輕低溫?fù)p傷。

圖1 GB處理對(duì)桃果實(shí)冷藏期間冷害指數(shù)的影響Fig. 1 Effect of GB treatment on chilling injury index in peach fruit during cold storage

2.2 GB處理對(duì)桃果實(shí)冷藏期間相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量的影響

如圖2A所示，在整個(gè)貯藏期間，桃果實(shí)的相對(duì)電導(dǎo)率總體呈逐漸上升的趨勢(shì)，但GB組果實(shí)的相對(duì)電導(dǎo)率始終低于對(duì)照果實(shí)，在貯藏14～35 d時(shí)差異顯著（P＜0.05）。如圖2B所示，MDA含量的變化趨勢(shì)與相對(duì)電導(dǎo)率相似，隨著果實(shí)冷害程度的不斷增加，MDA含量持續(xù)積累，而且在貯藏7～35 d內(nèi)，GB處理的桃果實(shí)中MDA含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。在貯藏35 d時(shí)，GB組果實(shí)MDA含量低于對(duì)照組果實(shí)14.13%。這表明GB處理可以顯著抑制桃果實(shí)膜透性增加，減少M(fèi)DA的積累，在一定程度上維持細(xì)胞膜的完整性，從而減輕低溫對(duì)細(xì)胞膜造成的損害。

圖2 GB處理對(duì)桃果實(shí)冷藏期間相對(duì)電導(dǎo)率（A）和MDA含量（B）的影響Fig. 2 Effect of GB treatment on relative electric conductivity (A) and MDA content (B) in peach fruit during cold storage

2.3 GB處理對(duì)桃果實(shí)冷藏期間H2O2含量的影響

如圖3所示，桃果實(shí)H2O2含量隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)不斷上升，而GB組果實(shí)的H2O2含量在整個(gè)貯藏期間顯著低于對(duì)照組，在貯藏結(jié)束時(shí)GB組H2O2含量比對(duì)照組低17.24%。H2O2的含量越高說明植物體內(nèi)遭受的氧化應(yīng)激程度越高，這表明外源GB處理可以抑制冷藏期間桃果實(shí)H2O2的過量積累，減輕氧化應(yīng)激對(duì)果實(shí)造成的損傷，維持活性氧代謝的平衡。

圖3 GB處理對(duì)桃果實(shí)冷藏期間H2O2含量的影響Fig. 3 Effect of GB treatment on H2O2 content in peach fruit during cold storage

2.4 GB處理對(duì)桃果實(shí)冷藏期間AsA-GSH循環(huán)中代謝產(chǎn)物含量的影響

如圖4A所示，桃果實(shí)冷藏期間AsA含量總體呈逐漸下降的趨勢(shì)，但GB組果實(shí)的AsA含量始終高于對(duì)照組。在貯藏35 d時(shí)，GB組果實(shí)的AsA含量顯著高于對(duì)照組0.64 mg/kg（P＜0.05）。桃果實(shí)DHA含量在貯藏期間無明顯的變化趨勢(shì)（圖4B），但GB組果實(shí)的DHA含量低于對(duì)照組，在貯藏7、21 d和28 d時(shí)差異顯著（P＜0.05）。桃果實(shí)中AsA/DHA在貯藏期間呈逐漸減小的趨勢(shì)，與對(duì)照組果實(shí)相比，GB組桃果實(shí)始終維持較高的AsA/DHA（圖4C）。如圖4D所示，桃果實(shí)GSH含量隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降的趨勢(shì)，整個(gè)貯藏期間，GB組果實(shí)GSH含量始終高于對(duì)照組，在貯藏14～35 d時(shí)差異顯著（P＜0.05）。GB組果實(shí)在28 d后達(dá)到峰值，比同時(shí)期對(duì)照組高29.08%。桃果實(shí)中GSSG含量在冷藏期間逐漸下降（圖4E），在貯藏前21 d時(shí)，GB組GSSG含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），而在28～35 d時(shí)，GB組中GSSG的含量則低于對(duì)照組。桃果實(shí)中GSH/GSSG比例在貯藏期間逐漸增加，GB組始終維持較高的GSH/GSSG水平（圖4F）。這說明GB處理能積極調(diào)節(jié)桃果實(shí)冷藏期間AsA和GSH的氧化還原狀態(tài)，使果實(shí)內(nèi)維持較高的AsA、GSH含量和AsA/DHA、GSH/GSSG比例，增強(qiáng)果實(shí)在低溫下的抗氧化能力。

圖4 GB處理對(duì)桃果實(shí)冷藏期間AsA含量（A）、DHA含量（B）、AsA/DHA（C）、GSH含量（D）、GSSG含量（E）和GSH/GSSG（F）的影響Fig. 4 Effect of GB treatment on AsA content (A), DHA content (B),AsA/DHA ratio (C), GSH content (D), GSSG content (E) and GSH/GSSG ratio (F) in peach fruit during cold storage

2.5 GB處理對(duì)桃果實(shí)冷藏期間APX、GR、MDHAR和DHAR活力的影響

如圖5A所示，桃果實(shí)冷藏過程中APX活力呈先上后降的趨勢(shì)，在貯藏14 d時(shí)達(dá)到最大值，GB組果實(shí)APX活力始終顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。桃果實(shí)冷藏期間GR活力呈先上升后下降的趨勢(shì)（圖5B），與對(duì)照果實(shí)相比，GB組果實(shí)始終保持較高的GR活力，在貯藏28 d時(shí)比對(duì)照組高48.05%（P＜0.05）。桃果實(shí)冷藏期間MDHAR活力先上升后下降（圖5C），而GB處理能維持較高的MDHAR活力，在貯藏7、35 d時(shí)，GB組果實(shí)中MDHAR活力分別顯著高于對(duì)照組14.65%和9.42%（P＜0.05）。如圖5D所示，桃果實(shí)冷藏期間DHAR活力變化趨勢(shì)與MDHAR類似，在貯藏第7d時(shí)達(dá)到最大值，隨后逐漸下降，GB組果實(shí)DHAR活力始終高于對(duì)照組，在貯藏7～28 d時(shí)差異顯著（P＜0.05）。這說明GB處理能顯著提高桃果實(shí)冷藏期間AsA-GSH循環(huán)中關(guān)鍵酶的活力，促進(jìn)活性氧的清除。

圖5 GB處理對(duì)桃果實(shí)冷藏期間APX活力（A）、GR活力（B）、MDHAR活力（C）和DHAR活力（D）的影響Fig. 5 Effect of GB treatment on the activities of APX (A), GR (B),MDHAR (C) and DHAR (D) in peach fruit during cold storage

2.6 GB處理對(duì)桃果實(shí)冷藏期間PpAPX、PpGR、PpMDHAR和PpDHAR基因相對(duì)表達(dá)量的影響

如圖6A所示，桃果實(shí)冷藏期間PpAPX基因相對(duì)表達(dá)量總體呈先上升后下降的趨勢(shì)，GB組和對(duì)照組分別在7 d和14 d達(dá)到最大值，GB處理能維持較高的PpAPX相對(duì)表達(dá)量。桃果實(shí)PpGR基因相對(duì)表達(dá)量在貯藏前14 d呈下降的趨勢(shì)，從貯藏21 d開始明顯增加（圖6B）。與對(duì)照組相比，GB處理可以顯著上調(diào)桃果實(shí)PpGR相對(duì)表達(dá)量（P＜0.05）。如圖6C所示，桃果實(shí)PpMDHAR基因相對(duì)表達(dá)量在貯藏7 d時(shí)急劇上升，隨后逐漸下降，GB組果實(shí)PpMDHAR基因相對(duì)表達(dá)量在貯藏7 d和28～35 d時(shí)顯著高于對(duì)照果實(shí)（P＜0.05）。由圖6D可知，整個(gè)貯藏期間，對(duì)照組桃果實(shí)PpDHAR相對(duì)表達(dá)量呈逐漸下降的趨勢(shì)，而GB組果實(shí)PpDHAR相對(duì)表達(dá)量整體呈先升后降的趨勢(shì)。GB處理在貯藏7 d時(shí)PpDHAR相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.05），比對(duì)照果實(shí)高1.11 倍。這說明GB處理可以上調(diào)AsA-GSH循環(huán)中PpAPX、PpGR、PpMDHAR和PpDHAR關(guān)鍵基因的表達(dá)，提高AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)中關(guān)鍵酶的活性，從而增強(qiáng)果實(shí)的抗氧化能力。

圖6 GB處理對(duì)桃果實(shí)冷藏期間PpAPX（A）、PpGR（B）、PpMDHAR（C）和PpDHAR（D）基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig. 6 Effect of GB treatment on the relative expression of PpAPX (A), PpGR (B), PpMDHAR (C) and PpDHAR (D) gene in peach fruit during cold storage

3 討 論

在適宜條件下，植物細(xì)胞內(nèi)ROS的積累和清除處于穩(wěn)定的平衡狀態(tài)，而非生物脅迫會(huì)破壞這種平衡，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，引發(fā)過量的ROS積累[16]。相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量分別表示細(xì)胞膜透性和膜脂質(zhì)過氧化程度，一般用于評(píng)估細(xì)胞膜的損傷程度[26]。研究表明，GB是含氮的相容性滲透物質(zhì)之一，它可以通過維持蛋白質(zhì)活性，保護(hù)細(xì)胞膜完整性和有效清除有毒ROS來激活非生物脅迫的防御反應(yīng)[27-28]。已有研究報(bào)道外源GB處理可以降低H2O2水平，提高番茄植株的耐冷性[29]。孫玉潔等[30]研究發(fā)現(xiàn)10 mmol/L甜菜堿處理能減緩枇杷果實(shí)相對(duì)電導(dǎo)率的上升，同時(shí)有效抑制MDA和H2O2含量的積累，從而減輕了枇杷果實(shí)果心褐變。本研究發(fā)現(xiàn)，GB處理的桃果實(shí)中MDA含量、H2O2含量以及相對(duì)電導(dǎo)率的上升速度相對(duì)緩慢，其冷害指數(shù)也顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），這與GB處理番木瓜果實(shí)中得到的結(jié)果一致[21]。因此，外源GB處理通過抑制桃果實(shí)冷藏期間電導(dǎo)率和MDA含量的上升，減輕H2O2對(duì)細(xì)胞造成的氧化損傷，維持細(xì)胞膜的完整性，從而減輕果實(shí)的冷害。

AsA-GSH循環(huán)是植物體內(nèi)重要的H2O2清除系統(tǒng)，AsA和GSH是此循環(huán)中重要的非酶促抗氧化劑，其氧化還原狀態(tài)可以代表細(xì)胞環(huán)境中的氧化還原狀態(tài)[6]。AsA/DHA和GSH/GSSG可以反映植物的氧化還原能力，一般還原性物質(zhì)含量越高，對(duì)植物的抗脅迫能力越強(qiáng)[6,31]。在本研究中，GB處理始終維持桃果實(shí)中較高的AsA、GSH含量和AsA/DHA、GSH/GSSG比例，這與水楊酸處理增強(qiáng)臍橙果實(shí)抗氧化能力的結(jié)果一致[32]。Li Huizi等[10]發(fā)現(xiàn)冷馴化可以增強(qiáng)番茄果實(shí)的抗冷性，這與其顯著誘導(dǎo)GSH的積累和提升GSH/GSSG比例有關(guān)。Endo等[9]報(bào)道了可以通過維持AsA和GSH含量，增強(qiáng)AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)的抗氧化能力來提高甜椒果實(shí)的耐冷性，這與本研究結(jié)果相似。這些結(jié)果表明GB處理有利于調(diào)節(jié)細(xì)胞中AsA和GSH的氧化還原狀態(tài)，維持較高的AsA/DHA和GSH/GSSG比例，從而提高冷藏桃果實(shí)的抗氧化能力。

APX、MDHAR、DHAR和GR是AsA-GSH循環(huán)代謝中的關(guān)鍵酶。APX能夠利用AsA作為電子供體將H2O2還原為H2O，清除細(xì)胞中過量的H2O2，同時(shí)AsA被催化為單脫氫抗壞血酸（monodehydroascorbate，MDHA）或DHA[33]。MDHAR和DHAR可分別將MDHA和DHA還原為AsA，保證了ASA的高效再生，與此同時(shí)GSH被氧化成GSSG[6,34]。GR可利用NAD(P)H作電子供體將GSSG再生成GSH，維持GSH的還原狀態(tài)[34]。已有研究表明，GB處理可以通過調(diào)節(jié)植物體內(nèi)AsA-GSH循環(huán)代謝，減輕氧化應(yīng)激的損傷，提高植物的抗冷性[35]。本研究發(fā)現(xiàn)，桃果實(shí)冷藏期間GB處理顯著上調(diào)了AsA-GSH循環(huán)中PpAPX、PpGR、PpMDHAR和PpDHAR基因的表達(dá)，使得APX、MDHAR、DHAR和GR活性在冷藏期間均維持在較高的水平，這與Song Lili等[11]在低壓處理的桃果實(shí)中得到的結(jié)果類似。在辣椒果實(shí)中，GB處理可以提高APX和GR酶活性并誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)，從而提高抗冷性，減輕低溫?fù)p傷[24]，這與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果一致。這些結(jié)果揭示了GB處理可以調(diào)控桃果實(shí)冷藏期間AsA-GSH循環(huán)中關(guān)鍵酶活性及相關(guān)基因表達(dá)，提高H2O2的清除能力，同時(shí)可以維持果實(shí)的AsA和GSH含量，調(diào)節(jié)AsA/DHA、GSH/GSSG的相互轉(zhuǎn)化來平衡細(xì)胞中的氧化還原狀態(tài)，減輕膜脂過氧化程度，從而延緩桃果實(shí)冷害的發(fā)生。

4 結(jié) 論

GB處理可以有效減輕桃果實(shí)的冷害，這與GB處理參與調(diào)控AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)密切相關(guān)。GB處理可通過增加APX、GR、MDHAR和DHAR的活性及關(guān)鍵基因的表達(dá)，促進(jìn)桃果實(shí)中AsA和GSH兩種非酶抗氧化劑的再生，有效清除積累的H2O2，保持細(xì)胞的完整性，減輕桃果實(shí)的冷害，增強(qiáng)桃果實(shí)的抗冷性。綜上，外源GB處理在延長(zhǎng)桃果實(shí)采后貯藏期及維持果實(shí)品質(zhì)方面具有較好的應(yīng)用前景。