大黃牡丹湯聯(lián)合柳氮磺胺吡啶腸溶片對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠氧化應(yīng)激及Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1-核因子E2相關(guān)因子2信號(hào)通路的影響※

滿(mǎn)光亮 劉永艷 梁國(guó)強(qiáng)

(江蘇省昆山市第四人民醫(yī)院消化科,江蘇 昆山 215300)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)屬于炎癥性腸病的一種常見(jiàn)類(lèi)型，臨床表現(xiàn)為腹瀉、黏液膿血便、腹痛等，且容易反復(fù)發(fā)作，對(duì)患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響[1]。UC的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，有研究認(rèn)為其發(fā)病與遺傳、環(huán)境、免疫等多種因素相關(guān)，其中氧化應(yīng)激也是UC發(fā)病的重要機(jī)制之一[3]。Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1-核因子E2相關(guān)因子2(Keap1-Nrf2)信號(hào)通路是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵通路，其調(diào)控的下游二相代謝酶和抗氧化蛋白酶在細(xì)胞防御保護(hù)中發(fā)揮著重要作用，也是近幾年抗氧化研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[4]。中醫(yī)藥在UC的治療方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，認(rèn)為UC的發(fā)生多是因脾虛失運(yùn)，濕熱熏蒸，氣血相搏結(jié)，導(dǎo)致腸道氣凝血滯，腐敗成膿下所致[5]。大黃牡丹湯源自《金匱要略》，具有瀉熱逐瘀、消腫散結(jié)、涼血止血的功效。有研究表明，大黃牡丹湯可通過(guò)抑制炎性反應(yīng)對(duì)UC發(fā)揮治療作用[6]。為進(jìn)一步發(fā)揮中醫(yī)優(yōu)勢(shì)，探索大黃牡丹湯治療UC的機(jī)制，本研究觀(guān)察大黃牡丹湯聯(lián)合柳氮磺胺吡啶腸溶片對(duì)UC小鼠氧化應(yīng)激及對(duì)Keap1-Nrf2信號(hào)通路的影響，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)BALB/c小鼠50只，雄性，周齡6～8周，體質(zhì)量18～20 g，由昭衍(蘇州)新藥研究中心有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(蘇)2018-0006。

1.2 主要藥物 大黃牡丹湯：大黃12 g，牡丹皮9 g，桃仁12 g，冬瓜仁30 g，芒硝9 g(均采用江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的中藥顆粒劑)；葡聚糖硫酸鈉鹽(美國(guó)MPBIO公司)；柳氮磺胺吡啶腸溶片(上海信誼天平藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H31020557)。

1.3 主要試劑 蘇木素—伊紅(HE)染色試劑盒(鴻泉生物科技有限公司)；小鼠活性氧(ROS)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒、小鼠髓過(guò)氧化物酶(MPO)ELISA試劑盒、小鼠丙二醛(MDA)ELISA試劑盒、小鼠總抗氧化能力(T-AOC)ELISA試劑盒及小鼠谷胱甘肽(GSH)ELISA試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司)；Anti-Keap1抗體、Anti-Nrf2抗體及其相關(guān)免疫組化檢測(cè)試劑盒(英國(guó)Abcam公司)。

1.4 主要儀器 CX41生物顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；數(shù)碼相機(jī)[NIKON(D5100)公司]；Infinite F50酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；Image pro plus 6.0圖像分析軟件(美國(guó)Media Cybernetics公司)；低溫冷凍離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 造模、分組及給藥方法 將50只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、西藥組、中藥組及中西藥組，每組10只。除空白組外，其余各組小鼠參照文獻(xiàn)[7]采用葡聚糖硫酸鈉鹽誘導(dǎo)制備UC模型，連續(xù)飲用5%葡聚糖硫酸鈉鹽溶液7 d即可建立小鼠UC模型。造模成功觀(guān)察3 d后，空白組及模型組予雙蒸水灌胃10 mL/kg灌胃，西藥組予柳氮磺胺吡啶腸溶片藥液0.8 g/kg灌胃，中藥組予大黃牡丹湯顆粒劑5.7 g生藥/kg灌胃，中西藥組上午予柳氮磺胺吡啶腸溶片藥液灌胃，下午予大黃牡丹湯顆粒劑灌胃，灌胃劑量分別同西藥組和中藥組，均每日1次，連續(xù)灌胃7 d。

1.5.2 標(biāo)本的采集和處理 各組大鼠末次灌胃后禁食不禁水24 h，然后頸椎脫臼法處死小鼠，剪開(kāi)腹腔，游離結(jié)腸及遠(yuǎn)端回腸，取出肛門(mén)至盲腸末端的整個(gè)腸段，迅速沿著腸系膜縱軸剖開(kāi)，刮取收集腸內(nèi)容物(黏膜黏液)，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｔ儆妙A(yù)冷0.9%氯化鈉注射液漂洗干凈，將結(jié)腸平展開(kāi)，仔細(xì)觀(guān)察腸道潰瘍和炎癥情況，剪取潰瘍最嚴(yán)重處結(jié)腸組織約1.5 cm，等分2份,一份-80 ℃保存?zhèn)溆?，另一份?%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，備用。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.6.1 一般情況 觀(guān)察各組小鼠灌胃期間的一般情況，包括精神狀態(tài)、毛色、體質(zhì)量、排便等，并根據(jù)小鼠糞便性質(zhì)及隱血情況對(duì)灌胃后疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)分進(jìn)行比較[8]。0分：大便正常，隱血陰性；1分：軟便，隱血陰性；2分：軟便，隱血陽(yáng)性；3分：腹瀉，隱血陽(yáng)性；4分：腹瀉，血便。

1.6.2 結(jié)腸組織病理學(xué)觀(guān)察 各組小鼠隨機(jī)取5個(gè)結(jié)腸組織切片樣本進(jìn)行HE染色，然后在生物顯微鏡下(×400)觀(guān)察小鼠結(jié)腸組織病理變化情況，并進(jìn)行結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)(CMDI)評(píng)分比較，包括潰瘍、炎癥、肉芽組織、病變深度及纖維化5個(gè)方面，評(píng)分越高說(shuō)明損傷越嚴(yán)重[9]。

1.6.3 Keap1和Nrf2蛋白表達(dá)檢測(cè) 各組小鼠隨機(jī)取5個(gè)結(jié)腸組織切片樣本進(jìn)行免疫組化染色，然后計(jì)算小鼠結(jié)腸組織Keap1和Nrf2蛋白表達(dá)的平均光密度值。首先按照Keap1和Nrf2的免疫組化檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行免疫組化染色，然后在生物顯微鏡下(×200)觀(guān)察陽(yáng)性染色，截圖，再用Image pro plus 6.0圖像分析軟件分析Keap1和Nrf2蛋白表達(dá)的平均光密度值。

1.6.4 氧化應(yīng)激指標(biāo) 取各組小鼠備用腸內(nèi)容物及結(jié)腸組織，稱(chēng)質(zhì)量，分別加入9倍質(zhì)量的磷酸鹽緩沖液(PBS)混勻，再用低溫冷凍離心機(jī)以3 000 r/min，4 ℃，離心10 min，分別采用ELISA測(cè)定腸內(nèi)容物ROS水平和結(jié)腸組織MPO、MDA、T-AOC、GSH水平，均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況及DIA評(píng)分比較 空白組小鼠灌胃期間精神狀況好，飲食、飲水及排便情況均正常，活動(dòng)敏捷，毛發(fā)順滑光亮，體質(zhì)量隨時(shí)間正常性增長(zhǎng)。模型組小鼠隨著時(shí)間增加飲食、飲水逐漸減少，毛發(fā)雜亂，精神狀態(tài)差，出現(xiàn)持續(xù)性松散血便，體質(zhì)量下降。西藥組、中藥組和中西藥組在灌胃給藥前一般狀況表現(xiàn)與模型組一致，在灌胃治療后上述癥狀均有所改善。另外，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中模型組有2只小鼠死亡，西藥組和中藥組各有1只小鼠死亡，分析原因主要與造模相關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道存在一定的死亡率相一致[7]。各組小鼠灌胃后DIA評(píng)分比較 見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠灌胃后DAI評(píng)分比較 分，

由表1可見(jiàn)，與空白組比較，模型組小鼠DAI評(píng)分升高，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，中藥組和中西藥組小鼠DAI評(píng)分均降低，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，西藥組雖也有下降但比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。西藥組、中藥組和中西藥組小鼠DAI評(píng)分組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀(guān)察及CMDI評(píng)分比較 空白組小鼠結(jié)腸組織黏膜完整，腺體排列整齊，未見(jiàn)潰瘍。模型組小鼠結(jié)腸黏膜有缺損，腺體結(jié)構(gòu)分離，大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，出現(xiàn)炎性反應(yīng)，可見(jiàn)肉芽組織增生及纖維化，病變深度集中在肌層及漿膜層，說(shuō)明已經(jīng)造成了結(jié)腸黏膜深層損傷。相對(duì)模型組，西藥組、中藥組和中西藥組結(jié)腸組織的病理學(xué)表現(xiàn)均有不同程度的改善。見(jiàn)圖1。各組小鼠CMDI評(píng)分比較 見(jiàn)表2。

由表2可見(jiàn)，與空白組比較，模型組小鼠CMDI評(píng)分升高，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，西藥組、中藥組和中西藥組小鼠CMDI評(píng)分均降低，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與西藥組和中藥組比較，中西藥組小鼠CMDI評(píng)分均降低，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，西藥組與中藥組組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組小鼠CMDI評(píng)分比較 分,

2.3 各組小鼠結(jié)腸組織Keap1和Nrf2蛋白平均光密度值比較 見(jiàn)表3、圖2、圖3。

由表3可見(jiàn)，與空白組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織Keap1和Nrf2蛋白平均光密度值的升高，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，西藥組、中藥組和中西藥組Keap1蛋白平均光密度值均降低，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),西藥組Nrf2蛋白平均光密度值有下降趨勢(shì)，中藥組和中西藥組Nrf2蛋白平均光密度值有增高趨勢(shì)，但比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與西藥組比較，中西藥組Keap1蛋白平均光密度值降低，Nrf2蛋白平均光密度值升高，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與中藥組比較，中西藥組Keap1蛋白平均光密度值降低，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Nrf2蛋白平均光密度值有升高趨勢(shì)，但比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 各組小鼠結(jié)腸組織病理觀(guān)察(HE，×400)

表3 各組小鼠結(jié)腸組織Keap1和Nrf2蛋白平均光密度值比較

圖2 各組小鼠結(jié)腸組織Keap1蛋白表達(dá)情況(免疫組化，×200)

圖3 各組小鼠結(jié)腸組織Nrf2蛋白表達(dá)情況 (免疫組化，×200)

2.4 各組小鼠ROS、MPO、MDA和T-AOC、GSH水平比較 見(jiàn)表4。

表4 各組小鼠ROS、MPO、MDA和T-AOC、GSH水平比較

由表4可見(jiàn)，與空白組比較，模型組小鼠ROS、MPO和MDA水平均升高，T-AOC水平降低，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，GSH水平有下降趨勢(shì)，但比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，西藥組、中藥組和中西藥組ROS和MDA水平均降低，T-AOC水平均升高，西藥組和中西藥組MPO水平均降低，中藥組和中西藥組GSH水平均升高，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，中藥組MPO和西藥組GSH水平與模型組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與西藥組比較，中西藥組ROS和MDA水平均降低，T-AOC和GSH水平均升高，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，MPO水平有升高趨勢(shì)，但比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與中藥組比較，中西藥組ROS、MPO和MDA水平均降低，T-AOC水平升高，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，GSH水平有升高趨勢(shì)，但比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

UC又稱(chēng)為慢性非特異性潰瘍性結(jié)腸炎，是一種多因素、多層次、病因不明的非特異性腸道炎癥，臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、里急后重、黏液膿血便等消化道癥狀，以及發(fā)熱、水電解質(zhì)紊亂、貧血、體質(zhì)量下降等全身癥狀[10]。UC病情常反復(fù)遷延不愈，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，一直是學(xué)界的研究熱點(diǎn)，臨床上研究較多的機(jī)制包括遺傳因素、感染因素、環(huán)境因素、飲食結(jié)構(gòu)因素、免疫因素等，近年來(lái)氧化應(yīng)激對(duì)UC發(fā)病的影響也逐漸受到關(guān)注[11]。氧化應(yīng)激是體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態(tài)。正常情況下機(jī)體內(nèi)的氧化過(guò)程與抗氧化過(guò)程處在動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)，一旦這種平衡受到破壞，受氧化應(yīng)激作用的刺激或損傷,體內(nèi)ROS分泌會(huì)明顯增多，而過(guò)量的ROS會(huì)造成機(jī)體細(xì)胞功能紊亂和損傷，誘發(fā)炎性反應(yīng)[12]。MDA是自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)的氧化終產(chǎn)物，作為過(guò)氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物之一，其可以反映過(guò)氧化程度，也可以間接反映細(xì)胞損傷的程度[13]。MPO是一種由中性粒細(xì)胞表達(dá)并分泌的過(guò)氧化物酶，具有強(qiáng)效的促炎作用，并且可能直接參與組織損傷[14]。GSH是含有巰基的三肽化合物，在人體內(nèi)具有活化氧化還原系統(tǒng)的生理活性，是體內(nèi)一種重要的抗氧化劑，其通過(guò)巰基與自由基結(jié)合，直接使自由基還原成酸性物質(zhì)，從而加速自由基的排泄，并對(duì)抗自由基對(duì)組織細(xì)胞的損害[15]。T-AOC是指體內(nèi)各種抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶等構(gòu)成的總抗氧化水平，其水平越高表示機(jī)體抗氧化的能力越強(qiáng)[16]。Nrf2是機(jī)體抗氧化應(yīng)激體系中的一類(lèi)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)也是維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的中樞調(diào)節(jié)者,其參與的Keap1-Nrf2信號(hào)通路被認(rèn)為是機(jī)體參與抗氧化的最重要的通路之一[17]。正常情況下,存在于細(xì)胞漿中的Nrf2與胞質(zhì)接頭蛋白Keap1緊密結(jié)合，從而處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)，但在機(jī)體受到氧化應(yīng)激的作用下,Nrf2會(huì)迅速與Keap1分離后活化進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),進(jìn)而調(diào)控下游多種抗氧化酶如GSH等參與到清除氧化應(yīng)激產(chǎn)生的有害物質(zhì)的過(guò)程，Keap1-Nrf2信號(hào)通路介導(dǎo)的防御機(jī)制對(duì)正常細(xì)胞具有保護(hù)作用，在對(duì)抗多種疾病的病理狀態(tài)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[18]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠造模后飲食、飲水逐漸減少，毛發(fā)雜亂，精神狀態(tài)差，出現(xiàn)血便，體質(zhì)量下降，結(jié)腸組織病理觀(guān)察也顯示結(jié)腸黏膜缺損，腺體結(jié)構(gòu)分離，大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，出現(xiàn)炎性反應(yīng)，可見(jiàn)肉芽組織增生及纖維化，DIA評(píng)分及CMDI評(píng)分較空白組均明顯升高(P<0.05)，說(shuō)明UC模型造模非常成功；氧化應(yīng)激指標(biāo)中ROS、MPO和MDA水平較空白組明顯升高(P<0.05)，T-AOC水平明顯降低(P<0.05)，且結(jié)腸組織Keap1和Nrf2蛋白平均光密度值明顯升高(P<0.05)，說(shuō)明機(jī)體處于氧化應(yīng)激過(guò)度的狀態(tài)。

UC屬于中醫(yī)學(xué)臟毒、泄瀉、腸風(fēng)、痢疾等范疇，認(rèn)為本病多由于外感濕熱，或飲食內(nèi)傷，或勞倦過(guò)度，導(dǎo)致脾胃受損，運(yùn)化失司，水濕內(nèi)聚，日久生熱，濕熱蘊(yùn)結(jié)，下注大腸，濕熱浸淫，氣滯血瘀，損傷腸絡(luò)，導(dǎo)致血敗肉腐，發(fā)為潰瘍[19]。大黃牡丹湯是治療腸癰初起，濕熱瘀滯的經(jīng)典名方，方中大黃逐瘀瀉下，解毒攻積；牡丹皮清熱涼血，活血散瘀；桃仁性善破血，活血逐瘀；冬瓜仁清熱利濕，排膿消癰；芒硝滌蕩實(shí)熱，軟堅(jiān)散結(jié)，使壅滯邪熱自腸而出。全方集瀉下、清熱、利濕、逐瘀于一體，諸藥合用，濕熱得清，血滯得散，腸腑得通，則癰消痛止。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，大黃牡丹湯可通過(guò)抑制外周血中性粒細(xì)胞增殖、提高紅細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白含量、提高免疫功能等發(fā)揮對(duì)UC的治療作用[6，20]。柳氮磺胺吡啶屬于氨基水楊酸類(lèi)藥物，是目前臨床上治療UC的一線(xiàn)用藥，可通過(guò)消除氧自由基、抑制炎性反應(yīng)等途徑起到治療作用[21]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，西藥組予柳氮磺胺吡啶腸溶片灌胃干預(yù)后ROS、MPO、MDA及T-AOC水平均明顯改善(P<0.05)，Keap1蛋白平均光密度值明顯降低(P<0.05)；中藥組予大黃牡丹湯灌胃干預(yù)后ROS、MDA、T-AOC及GSH水平均明顯改善(P<0.05)，Keap1蛋白平均光密度值明顯降低(P<0.05)；中西藥組予聯(lián)合干預(yù)后ROS、MPO、MDA、T-AOC及GSH水平均有明顯改善(P<0.05)，Keap1蛋白平均光密度值明顯降低(P<0.05)，且中西藥組對(duì)ROS、MDA、T-AOC水平及Keap1蛋白平均光密度值改善程度均優(yōu)于西藥組和中藥組(P<0.05)，對(duì)GXH及Nrf2改善優(yōu)于西藥組(P<0.05)，對(duì)MPO改善優(yōu)于中藥組(P<0.05)。說(shuō)明柳氮磺胺吡啶腸溶片和大黃牡丹湯對(duì)UC模型小鼠均有抗氧化作用，且兩者聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同效應(yīng)，可進(jìn)一步提高療效。

總之，氧化應(yīng)激損傷是UC發(fā)病的重要機(jī)制，臨床主要表現(xiàn)為持續(xù)性松散血便，結(jié)腸組織病理可見(jiàn)黏膜損傷，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肉芽組織增生及纖維化，病變深度集中在肌層及漿膜層。大黃牡丹湯和柳氮磺胺吡啶腸溶片對(duì)UC均有確切的治療作用，可改善小鼠的臨床癥狀及結(jié)腸黏膜損傷程度，且兩者聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同效應(yīng)，作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Keap1-Nrf2信號(hào)通路，啟動(dòng)機(jī)體氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)程序，提高機(jī)體抗氧化能力有關(guān)。