癲癇患者血清miR-222、BAFF水平表達的臨床意義及對預后的影響

劉震宇，姚淑芳

（河南省三門峽市中心醫(yī)院神經內科，河南 三門峽 472000）

癲癇常規(guī)治療方式包括藥物治療、手術治療等,成人癲癇一般通過藥物治療可以得到有效控制,但是，部分患者在治療后預后不佳，癲癇發(fā)作仍較為頻繁[1]。若能早期預測癲癇患者的預后情況，對調整治療方案，改善患者預后較為重要。癲癇的發(fā)生發(fā)展與機體的免疫功能有關，研究表明，炎癥反應和免疫功能紊亂均會增加癲癇的發(fā)生風險，加重癲癇病情,且多種免疫相關因子在癲癇患者中表達異常[2]。白細胞介素（interleukin，IL）-10、B細胞活化因子(B-cell activating factor of TNF family,BAFF)是常見的炎癥因子，其異常表達與免疫功能紊亂有關,研究證實，IL-10、BAFF與癲癇病情關系密切[3]。微小核糖核酸(microRNA,miRNA)可能是癲癇發(fā)病的關鍵因素之一，在癲癇、中樞神經系統(tǒng)異常病變等疾病的發(fā)生發(fā)展中具有促進或抑制作用，且已有研究從miRNA靶基因和途徑出發(fā)探索癲癇治療方法[4]。miR-222可調節(jié)炎癥因子，刺激炎癥因子、黏附因子的分泌，加重免疫功能紊亂,增加疾病發(fā)生風險,而且可能和炎癥因子相互作用促進癲癇的發(fā)生[5]。由此推測，miR-222、BAFF可能與癲癇患者的預后有關?；诖耍狙芯糠治霭d癇患者血清miR-222、BAFF水平表達的臨床意義及對預后的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 前瞻選擇2017年1月-2018年1月醫(yī)院113例癲癇患者作為研究對象。本研究經我院醫(yī)學倫理委員會審核通過,患者與家屬均知情且自愿簽署同意書。其中，男68例，女45例；年齡32～73歲,中位年齡49.00（45.00,53.00）歲；體重指數(shù)18.23～25.97kg/m2,中位體重指數(shù)22.03（21.63,22.41）kg/m2；病程1～12年,中位病程3.00（2.00，3.00）年；治療前發(fā)作次數(shù)2～12次/月，治療前發(fā)作次數(shù)中位數(shù)6.00（5.00，6.00）次/月。⑴納入標準：①符合《臨床診療指南：癲癇病分冊》[6]癲癇診斷標準；②經腦電圖檢查確診癲癇；③顱腦損傷引起的繼發(fā)性癲癇。⑵排除標準：①基因檢測驗證為存在基因突變導致的癲癇發(fā)作；②肌陣痙攣性癲癇；③合并感染性疾??；④惡性腫瘤；⑤失訪。

1.2 方法

1.2.1 血清指標檢測方法⑴miRNA：入院時，采集5ml空腹靜脈血，靜置30min（常溫下），離心機（鄭州中谷機械設備，TGL-16）離心，-80℃下保存待測。使用上?？道噬锾峁┑腡rizol RNA試劑盒，加入Trizol RNA，提取RNA，使用紫外分光光度計檢測RNA總純度是否達標（純度良好區(qū)間范圍為1.8～2.0）,達標后使用德國QIAGEN公司提供的PCR試劑盒,加入0.5μl逆轉錄酶，于37℃下水浴，將總RNA反轉錄為cDNA,使用實時PCR系統(tǒng)（Applied Bioststems，7500）擴增,采用2﹣△△Ct法計算血清miR-222、miR-21相對表達量。miR-222正向引物：5'-ACACTCCAGCTGGGAGCTACATCTGGCTACTG-3'；反向引物：5'-CTCAACTGGTCTCGTGCA-3'。miR-21正 向 引 物：5'-CTGCAGGGTCCGAGGT-3'；反 向 引 物：5'-GCCCCTAGCTTACACACTGATCT-3'。⑵炎癥因子：入院時，采集5ml空腹時靜脈血離心取上清,置于-20C冰箱保存待測，采用酶聯(lián)免疫試劑盒，以酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清IL-10、BAFF表達。

1.2.2 治療方法 ⑴詢問病史、腦電圖檢查等明確患者8周內癲癇發(fā)作的頻次、類型和抗癲癇藥物使用情況；⑵口服左乙拉西坦（UCB Pharma S.A.公司，生產批號：20160922、20170825，規(guī)格：0.25g），初始劑量為250mg/次,2次/d，在4周內逐漸增加至500mg/次,2次/d，共維持治療12周，進入開放性治療期，繼續(xù)口服左乙拉西坦500mg/次,2次/d，繼續(xù)觀察12周。共治療24周。

1.2.3 預后評估方法 治療完成后1年,采用Engel分級[7]評估預后，Ⅰ級：僅有先兆發(fā)作或發(fā)作完全消失；Ⅱ級：發(fā)作次數(shù)≤3次/年；Ⅲ級：發(fā)作次數(shù)＞但較治療前減少≥75%；Ⅳ級：發(fā)作次數(shù)較治療前減少＜75%。Ⅰ級為預后良好，Ⅱ級-Ⅳ級為預后不良。

1.3 統(tǒng)計學方法 用SPSS 23.0軟件處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以%和n表示，組間比較采用χ2檢驗；全部計量資料均經Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗，偏態(tài)分布計量資料用中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗；血清指標與癲癇患者預后不良的關系采用Logistic回歸分析檢驗；繪制受試者工作曲線（ROC），并計算曲線下面積（AUC）值，檢驗血清miR-222、BAFF水平預測癲癇患者預后不良的價值，AUC值＞0.9表示預測性能較高，0.71～0.90表示有一定預測性能，0.5～0.7表示預測性能較低，＜0.5表示無預測性能，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 預后結局 治療完成后經1年隨訪統(tǒng)計顯示，研究內113例癲癇患者中預后不良的患者有31例，占比為27.43%（31/113），其中Ⅱ級18例，Ⅲ級11例，Ⅳ級2例；預后良好的（Ⅰ級）的患者有82例，占比為72.57%（82/113）。

2.2 兩組患者基線資料比較 預后不良組miR-222、miR-21、IL-10、BAFF水 平 均 高 于 預 后 良 好組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；兩組其他基線資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組患者基線資料比較

2.3 血清指標與癲癇患者預后不良關系的Logistic回歸分析 將2.2中比較結果顯示差異有統(tǒng)計學意義的變量納入作為自變量（均為連續(xù)變量）,將癲癇患者預后情況作為因變量（1=預后不良，0=預后良好）,經Logistic回歸分析檢驗結果顯示,miR-222、BAFF與癲癇患者預后不良有關，二者過表達可能是癲癇患者預后不良的風險因子（OR＞1，P＜0.05）。見表2。

表2 血清指標與癲癇患者預后不良關系的Logistic回歸分析

2.4 血清miR-222、BAFF單獨及聯(lián)合預測癲癇患者預后不良的價值 將癲癇患者預后情況作為狀態(tài)變量（1=預后不良，0=預后良好），將入院時血清miR-222、BAFF水平作為檢驗變量，繪制ROC曲線圖,見圖1,結果顯示,入院時血清miR-222、BAFF水平單獨及聯(lián)合預測癲癇患者預后不良的AUC分別為0.731、0.783、0.801,均有一定預測價值,且當二者的cut-off值分別取1.208、7.837ng/ml時，可獲得最佳預測價值。見表3。

圖1 血清miR-222、BAFF單獨及聯(lián)合預測癲癇患者預后不良的ROC曲線圖

表3 血清miR-222、BAFF單獨及聯(lián)合預測癲癇患者預后不良的價值

3 討論

目前,普遍認為癲癇的發(fā)病與中樞神經系統(tǒng)感染、腦部結構病變等因素有關，但具體發(fā)病機制尚不清楚，而且，目前癲癇治療現(xiàn)狀不佳[8]。因此，尋找新的生物標志物來預測癲癇患者的預后,對癲癇的治療和病情評估較為重要。

研究表明，癲癇患者治療現(xiàn)狀不甚理想[9]。本研究結果顯示，治療完成后經1年隨訪統(tǒng)計顯示，研究內113例癲癇患者中預后不良的患者有31例，占比為27.43%，其中Ⅱ級18例，Ⅲ級11例，Ⅳ級2例。說明，仍有較多癲癇患者在藥物治療后無法得到有效控制，預后情況不佳。研究表明，癲癇患者IL-10水平異常升高，IL-10水平升高與癲癇的發(fā)生有關[10]。miR-21被發(fā)現(xiàn)與自身免疫性疾病的發(fā)病機制相關,在調節(jié)自身免疫反應中起重要作用[11]。本次研究結果顯示，預后不良組miR-21、IL-10水平均高于預后良好組，說明miR-21、IL-10可能與癲癇患者預后不良有關。但后經Logistic回歸分析檢驗，miR-21、IL-10與癲癇患者預后不良無關,這可能是由于其他因素產生的影響造成，因此，無法將其作為癲癇患者預后不良的預測指標。

癲癇的發(fā)作與加重均與機體異常表達的凋亡分子和過度釋放的炎癥因子聯(lián)系緊密[12]。BAFF屬于腫瘤壞死因子超家族，分泌于單核細胞、樹突狀細胞等，與免疫系統(tǒng)功能有關，在自身免疫的發(fā)展中起著關鍵作用[13]。研究表明，BAFF可參與免疫調節(jié),而癲癇的發(fā)生發(fā)展與免疫功能障礙有關[14]。miRNA參與了癲癇的發(fā)生發(fā)展，miRNA能調控下游基因的翻譯和轉錄，改變相關蛋白含量，激活細胞內信號，從而導致疾病的發(fā)生[15]。miR-222能節(jié)炎性因子，促進凋亡分子活化，增加炎癥因子水平[16]。本研究通過對比不同預后情況患者入院時血清BAFF、miR-222水平后經Logistic回歸分析檢驗結果顯示，miR-222、BAFF與癲癇患者預后不良有關,各指標過表達可能是癲癇患者預后不良的風險因子。分析原因可能為：BAFF水平升高增加癲癇患者預后不良的風險可能是由于BAFF對人體免疫的作用，BAFF可調節(jié)T細胞主導的免疫反應，刺激B細胞中重組蛋白的生成,從而調控T細胞存活，造成免疫功能紊亂，從而引起或加重神經系統(tǒng)紊亂，從而影響癲癇患者預后結局[17,18]。研究表明，BAFF對人體的免疫調節(jié)作用可以促進抑制性細胞因子分泌，如IL-35，起到一定的負向免疫調節(jié)作用,減輕機體炎癥反應程度，改善癲癇患者病情，提高預后[19]。此外，動物實驗證實，BAFF參與癲癇的發(fā)生發(fā)展[20]。作為調節(jié)因子，miR-222可受促炎因子的誘導而增加分泌，并刺激炎癥因子、黏附因子表達，加重炎癥反應[21]。miR-222對機體神經元細胞具有傷害性，會破壞神經元鞘膜，誘發(fā)或增加異常放電，從而影響癲癇的治療，對癲癇患者的預后產生負面影響[22]。

最后，本研究繪制ROC曲線圖，結果顯示，入院時血清miR-222、BAFF水平單獨及聯(lián)合預測癲癇患者預后不良的AUC分別為0.731、0.783、0.801，均有一定評估價值。未來臨床若監(jiān)測到上述指標異常，應調整癲癇治療方案，增加營養(yǎng)神經類藥物、免疫調節(jié)類藥物治療等，以改善預后結局。但值得注意的是，miR-222、BAFF可能相互影響，共同促進癲癇病情進展，影響癲癇的治療和預后，但本文未分析兩者間的聯(lián)系，后續(xù)應增加研究繼續(xù)探索。

綜上所述，癲癇患者血清miR-222、BAFF水平表達與預后不良有關，可用于癲癇患者預后結局的預測。