血清miRNA-155聯(lián)合IL-6水平檢測(cè)對(duì)肝細(xì)胞肝癌患者預(yù)后的評(píng)估價(jià)值

陳院朝，齊惠麗，蘆晗，王升

（濮陽(yáng)市安陽(yáng)地區(qū)醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 安陽(yáng) 455000）

肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一種具有惡性程度高、進(jìn)展迅速和預(yù)后差等特點(diǎn)的全球性疾病，其發(fā)病率和死亡率分別居惡性腫瘤的前五位[1]。根治性切除手術(shù)是目前肝癌患者主要的治療手段，可達(dá)到緩解臨床癥狀、延長(zhǎng)生存期和改善生活質(zhì)量的目的[2]，但HCC術(shù)后的復(fù)發(fā)率較高，術(shù)后5年內(nèi)復(fù)發(fā)率可高達(dá)60%以上，患者往往預(yù)后較差。因此，早期采取有效方法評(píng)估HCC患者術(shù)后預(yù)后情況對(duì)于及早制定干預(yù)方案并提高患者生存率具有重要的臨床意義。微小核糖核酸-155（microRNA-155,miRNA-155）是一種生物活性RNA分子，可在不同疾病人群的血清中呈特異性和穩(wěn)定表達(dá)[3]，已被發(fā)現(xiàn)與食管鱗狀細(xì)胞癌、胰腺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移具有緊密聯(lián)系，但其在HCC患者中的臨床應(yīng)用價(jià)值尚不明確；白介素-6（Interleukin-6,IL-6）是公認(rèn)的一種炎癥因子，其高水平可反映HCC患者機(jī)體的炎癥微環(huán)境狀態(tài)，與HCC的病情進(jìn)展和生存期有關(guān)[4]。目前，對(duì)于miRNA-155與肝癌患者的主要集中于檢測(cè)癌組織中的miRNA-155表達(dá)，且對(duì)于聯(lián)合檢測(cè)血清miRNA-155和IL-6水平評(píng)估HCC患者預(yù)后的應(yīng)用價(jià)值尚不清楚，基于此，本研究旨在探討血清miRNA-155和IL-6在HCC患者血清中的表達(dá)水平，及二者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)預(yù)后的評(píng)估價(jià)值，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性選取2016年10月-2017年12月期間于我院收治的88例HCC患者作為研究對(duì)象，對(duì)其臨床資料和血清標(biāo)本進(jìn)行回顧性分析。88例患者中男性56例，女性32例，年齡36～83歲，平均年齡59.15±18.29歲；病理證實(shí)Edmondson分級(jí)：I級(jí)19例；II級(jí)25例；III級(jí)24例；IV級(jí)20例。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴結(jié)合影像學(xué)檢查、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)等，所有患者均符合2011年《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》HCC相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；⑵均行根治性切除術(shù)治療，并保存有血清標(biāo)本者；⑶術(shù)前未接受放、化療或射頻消融術(shù)等抗腫瘤治療者；⑷均完成2年隨訪，且具備完整的臨床及隨訪資料者。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴嚴(yán)重凝血功能障礙、腎功能異常及嚴(yán)重感染者；⑵合并其他惡性腫瘤、嚴(yán)重心腦血管疾病者；⑶全身免疫性疾病者；⑷精神異常、認(rèn)知障礙患者。本研究在獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)后實(shí)施，研究?jī)?nèi)容設(shè)計(jì)符合《世界赫爾辛基宣言》。所有患者血清標(biāo)本均取自患者的外周血，并經(jīng)2000r/min離心后取上清液置于液氮中保存。

1.2 方法

1.2.1 隨訪方案 隨訪從患者根治性切除手術(shù)后首日開(kāi)始，采用門(mén)診隨訪以及電話(huà)隨訪的方式對(duì)入組患者進(jìn)行追蹤，門(mén)診復(fù)查內(nèi)容為CT或MRI，以及血清甲胎蛋白檢查，并詳細(xì)記錄患者隨訪期間腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移情況，隨訪至患者死亡日期或術(shù)后2年為止。

1.2.2 分組方法 以患者隨訪兩年內(nèi)出現(xiàn)的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移情況表示為預(yù)后不良，腫瘤復(fù)發(fā)指經(jīng)影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)患者肝內(nèi)重復(fù)出現(xiàn)肝癌特點(diǎn)的結(jié)節(jié)或出現(xiàn)非原發(fā)性肝癌影響因素之外引起的AFP異常升高（>400ng/ml）[6]；轉(zhuǎn)移指臨床及影像學(xué)檢查顯示有淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移，復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移病灶均經(jīng)病理檢查進(jìn)行診斷確診[7]。將所有入組患者按照隨訪期間有無(wú)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移分為兩組：有局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的預(yù)后不良組和無(wú)局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的預(yù)后良好組。

1.2.3 血清miRNA-155、IL-6檢測(cè) 取兩組患者凍存的血清標(biāo)本，經(jīng)解凍后采用日立7100型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)IL-6水平，測(cè)定方法為酶聯(lián)免疫吸附法，試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)上執(zhí)行；并采用實(shí)時(shí)定量-PCR方法進(jìn)行血清miRNA-155的檢測(cè)，采用RNeasy Mini Kit總RNA提取試劑盒（購(gòu)自美國(guó)Life Technology公司）按規(guī)定步驟提取血清中游離總RNA，即刻逆轉(zhuǎn)錄成cDNA用于擴(kuò)增。選RUN6為內(nèi)參照，其中miRNA-155引物序列：5'-CT-CAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGA-CCCCTAT-3'。依據(jù)設(shè)計(jì)的循環(huán)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增設(shè)置反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃、5 min；95℃、10 s變性，60℃、20 s退火，72℃、20 s延伸，經(jīng)過(guò)35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增后，根據(jù)Ct值分析出miRNA相對(duì)表達(dá)量，繪制熔解曲線(xiàn)，根據(jù)熔解曲線(xiàn)判斷PCR產(chǎn)物的特異度。使用2-ΔΔCT法計(jì)算HCC患者血清miRNA-155的相對(duì)表達(dá)量，ΔCT=CT目標(biāo)-CT內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，本研究中涉及的計(jì)數(shù)資料用%表示，采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用“Mean±SD”表示，兩組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，多因素分析采用Logistic回歸模型；通過(guò)ROC曲線(xiàn)分析miRNA-155對(duì)HCC患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值；對(duì)各變量間的關(guān)系采用Pearson相關(guān)性分析，r值確定正、負(fù)相關(guān)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者預(yù)后情況 在88例HCC患者中有46例患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率為52.27%，為預(yù)后不良組；42例（47.73%）未出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，為預(yù)后良好組。預(yù)后不良組中出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)38例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移4例，肝內(nèi)轉(zhuǎn)移2例，肺轉(zhuǎn)移2例。

2.2 不同預(yù)后患者的血清miRNA-155、IL-6表達(dá)水平及兩指標(biāo)相關(guān)性 經(jīng)檢測(cè)后，預(yù)后不良組患者血清中miRNA-155相對(duì)表達(dá)量和IL-6水平均明顯高于預(yù)后良好組（P＜0.05），見(jiàn)表1。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，miRNA-155與IL-6的表達(dá)呈明顯正相關(guān)性（r=0.531，P=0.024）。

表1 不同預(yù)后患者血清miRNA-155、IL-6表達(dá)水平比較

2.3 影響HCC患者預(yù)后不良的單因素分析 單因素分析結(jié)果顯示，兩組在年齡、性別、腫瘤數(shù)量、乙肝表面抗原及術(shù)后介入治療次數(shù)方面比較無(wú)明顯差異（P＞0.05），兩組在腫瘤大小、病理分級(jí)、血管侵犯、血清miRNA-155表達(dá)和血清IL-6水平方面存在明顯差異（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 影響HCC患者預(yù)后不良的單因素分析

2.2 影響HCC患者預(yù)后不良的多因素Logisitic回歸分析 以HCC患者術(shù)后是否出現(xiàn)預(yù)后不良作為因變量，將單因素中差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素（腫瘤大小、病理分級(jí)、血管侵犯、血清miRNA-155表達(dá)和血清IL-6水平）作為自變量，并進(jìn)行賦值，腫瘤大?。?5.0cm=0，≥5.0cm=1）、病理分級(jí)（I級(jí)～I(xiàn)I級(jí)=0，III級(jí)～I(xiàn)V級(jí)=1）、血管侵犯（無(wú)=0，有=1）、血清miRNA-155表達(dá)（<1.0=0，≥1.0=1）、血清IL-6水平（<2.2=0，≥2.2=1），并將其納入Logisitic回歸模型中，結(jié)果顯示有血管侵犯、血清miRNA-155表達(dá)≥1.0和血清IL-6水平≥2.2 μg/L是HCC患者出現(xiàn)預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，見(jiàn)表3。

表3 影響HCC患者預(yù)后不良的多因素Logisitic回歸分析

2.3 單項(xiàng)指標(biāo)預(yù)測(cè)與聯(lián)合預(yù)測(cè)HCC患者預(yù)后不良的ROC曲線(xiàn)分析ROC曲線(xiàn)分析結(jié)果顯示，血清miRNA-155、IL-6表達(dá)量聯(lián)合預(yù)測(cè)HCC患者預(yù)后不良的ROC曲線(xiàn)下面積0.865明顯高于兩項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)預(yù)測(cè)的ROC曲線(xiàn)下面積0.787和0.770（P＜0.05）；且血清miRNA-155、IL-6表達(dá)量預(yù)測(cè)HCC患者預(yù)后不良時(shí)的閾值分別為1.048、2.322μg/L，見(jiàn)圖1，表4。

表4 血清miRNA-155、IL-6表達(dá)量預(yù)測(cè)患者預(yù)后的ROC曲線(xiàn)下面積

圖1 血清miRNA-155、IL-6表達(dá)量單獨(dú)預(yù)測(cè)與聯(lián)合預(yù)測(cè)HCC預(yù)后的ROC曲線(xiàn)

3 討論

微小核糖核酸是機(jī)體代謝分子群中新近發(fā)現(xiàn)的生物活性RNA分子，能在血清和血漿中持續(xù)且穩(wěn)定的表達(dá)，可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡發(fā)揮抑癌或促癌作用，與多種惡性腫瘤及疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[8]。其中miRNA-155是與機(jī)體免疫平衡、炎癥反應(yīng)有關(guān)的一種促癌基因，已被報(bào)道可作為多種癌癥和疾病預(yù)后的分子標(biāo)志物[9]。何榮琦等[10]非小細(xì)胞肺癌患者癌組織中呈高表達(dá)，與癌癥的惡性進(jìn)展和不良預(yù)后密切相關(guān)，可作為潛在預(yù)后評(píng)估的標(biāo)記物；張超等[11]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-155在乳腺癌患者血清表達(dá)水平比正常人群的要高，且miRNA-155高表達(dá)患者術(shù)后生存率較低，預(yù)后較差。然而目前關(guān)于miRNA-155聯(lián)合IL-6檢測(cè)在HCC患者預(yù)后評(píng)估中的應(yīng)用價(jià)值尚不明確，本研究對(duì)HCC患者血清miRNA-155、IL-6進(jìn)行檢測(cè)，探討二者對(duì)HCC預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值對(duì)于臨床上指導(dǎo)HCC患者術(shù)后及早干預(yù)具有重要作用。

本研究通過(guò)血清檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，預(yù)后不良組患者血清中miRNA-155相對(duì)表達(dá)量和IL-6水平均明顯高于預(yù)后良好組，可見(jiàn)miRNA-155、IL-6在HCC預(yù)后不良患者血清中呈較高表達(dá)。經(jīng)隨訪2年，HCC患者出現(xiàn)預(yù)后不良的單因素分析結(jié)果顯示，兩組在腫瘤大小、病理分級(jí)、血管侵犯、血清miRNA-155表達(dá)和血清IL-6水平方面存在明顯差異，提示HCC患者術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移可能與以上因素具有一定的聯(lián)系。進(jìn)一步的多因素分析結(jié)果顯示，有血管侵犯、血清miRNA-155表達(dá)≥1.0和血清IL-6水平≥2.2 μg/L是HCC患者出現(xiàn)預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。血管侵犯已被研究證實(shí)是HCC術(shù)后預(yù)后不良的主要危險(xiǎn)因素之一，可通過(guò)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移進(jìn)一步導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā),降低患者術(shù)后生存率[12,13]。同時(shí)可以看出，miRNA-155、IL-6在患者血清中的高表達(dá)與HCC術(shù)后出現(xiàn)不良預(yù)后具有重要聯(lián)系。HCC的發(fā)生與機(jī)體的長(zhǎng)期炎癥反應(yīng)和微環(huán)境密切相關(guān),腫瘤的發(fā)展過(guò)程中炎癥反應(yīng)發(fā)揮了決定性作用。miRNA-155是一種已被認(rèn)為具有癌基因特性的miRNA分子，在多種惡性腫瘤疾病中呈異常高表達(dá)[14]。miRNA-155過(guò)表達(dá)對(duì)HCC患者預(yù)后的影響機(jī)制可能在于：⑴miRNA-155參與T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的發(fā)育、分化、活化、增殖及其穩(wěn)態(tài)的維持[15],可通過(guò)上調(diào)腫瘤壞死因子-α水平，進(jìn)一步對(duì)輔助性T細(xì)胞的增殖以及T細(xì)胞亞群比例進(jìn)行調(diào)節(jié)，導(dǎo)致患者體內(nèi)免疫應(yīng)答失衡，加劇炎癥反應(yīng)，有利于癌細(xì)胞的增殖和擴(kuò)散，最終引起腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。⑵miRNA-155可能通過(guò)對(duì)抑癌基因caspase-3活性的抑制，進(jìn)一步抑制HCC腫瘤細(xì)胞凋亡；并且miRNA-155的高表達(dá)能夠降低TP53INPI的表達(dá)，抑制細(xì)胞周期捕獲，減少癌細(xì)胞凋亡[16]。IL-6是一種由Kupffer細(xì)胞釋放的炎癥介質(zhì)，其在血清中水平升高可促進(jìn)肝癌多個(gè)階段的進(jìn)展，與HCC的發(fā)生、發(fā)展具有重要聯(lián)系。研究表明[17]，IL-6水平升高是人類(lèi)病毒性肝炎向肝癌快速進(jìn)展的有效預(yù)測(cè)指標(biāo)之一。IL-6在HCC患者根治性手術(shù)前血清中的表達(dá)上升可反映出腫瘤的局部炎癥反應(yīng)嚴(yán)重,可能存在腫瘤炎性浸潤(rùn)導(dǎo)致腫瘤突破包膜并蔓延至包膜外側(cè),腫瘤目前已經(jīng)處于擴(kuò)展期，導(dǎo)致進(jìn)展期肝癌患者術(shù)后的不良預(yù)后[18]。由此可見(jiàn)，miRNA-155與IL-6的高表達(dá)均與HCC的不良預(yù)后有關(guān)，二者存在著正相關(guān)關(guān)系，miRNA-155可能通過(guò)調(diào)控免疫應(yīng)答系統(tǒng)進(jìn)一步調(diào)節(jié)IL-6水平，共同參與HCC的術(shù)后進(jìn)展。因此，可見(jiàn)血清miRNA-155與IL-6的較高表達(dá)均會(huì)增加HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致預(yù)后不良。本研究ROC曲線(xiàn)分析結(jié)果顯示，血清miRNA-155、IL-6表達(dá)量聯(lián)合預(yù)測(cè)HCC患者預(yù)后不良的ROC曲線(xiàn)下面積明顯高于兩項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)預(yù)測(cè)的ROC曲線(xiàn)下面積，表明血清miRNA-155聯(lián)合IL-6水平檢測(cè)對(duì)于HCC患者預(yù)后的評(píng)估價(jià)值更高，可能作為評(píng)估HCC患者不良預(yù)后的新指標(biāo)。臨床上可在術(shù)前聯(lián)合檢測(cè)二者指標(biāo)水平,評(píng)估患者預(yù)后的情況，及早制定術(shù)后干預(yù)措施，以改善患者預(yù)后。

綜上所述,血清miRNA-155、IL-6水平在HCC預(yù)后不良患者血清中呈較高表達(dá)，二者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于HCC患者預(yù)后具有較好的評(píng)估價(jià)值，可能作為臨床上評(píng)估HCC患者不良預(yù)后的分子標(biāo)志物。